酸性蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的研究

姜太玲，吳紅洋，申光輝，董小華，張志清*

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

酸性蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的研究

姜太玲，吳紅洋，申光輝，董小華，張志清*

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

利用酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽，以底物質量濃度、酶與底物比、pH值、酶解溫度、酶解時間為影響因子，在單因素試驗結果的基礎上，應用Box-Behnken方法進行三因素三水平的試驗設計，以對大腸桿菌的抑菌率為響應值，應用響應面法對花椒籽蛋白制備抗菌肽工藝進行優化。其最佳工藝條件為：底物質量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解溫度51.2 ℃、酶解時間4.7 h，此條件下酶解產生的抗菌肽復合物的水解度為9.05%，對大腸桿菌的抑菌率為56.98%。

花椒籽蛋白；抗菌肽；酸性蛋白酶；抑菌率

抗菌肽又叫抗生素肽、抗微生物肽，是由多種生物細胞特定的基因編碼經外界條件誘導而產生的一類具有廣譜抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲、抑殺腫瘤細胞等生物活性作用的多肽，由12～100 個氨基酸組成，分子質量小于10 kD，是生物先天免疫系統的重要組成部分［1-4］。由于抗菌肽具有廣譜殺菌性以及良好的溶解性和穩定性，易在 消化系統中降解成對人類副作用小、使用安全的氨基酸，對人類而言這將成為一種具有前途的新型食品防腐劑。目前有學者用從天然蠶蛹、甲基營養型芽孢桿菌中分離得到的抗菌肽分別對鮮豬肉、羅非魚片進行處理后，表現出良好的防腐效果［5-6］，而從乳酸菌中分離得到的乳酸鏈球菌素（Nisin）已在50多個國家和地區廣泛應用于食品的防腐保鮮［7］。

花椒籽，是花椒果皮生產中的主要副產物，除含有豐富的油脂外，還含有18%的蛋白質［8］。目前，對于花椒籽蛋白的研究主要集中在提取工藝上，而從其蛋白中提取活性肽的研究除王輝［9］、宋燕［10］等制備出的抗氧化肽外，還未見從花椒籽蛋白中提取具有抑菌活性多肽的研究報道。而在植物種子中，有學者已從咖啡豆、豇豆、小麥、蘇鐵和稗草等植物種子中分離出抗菌肽［11-15］，這為從花椒籽蛋白中制備具有抗菌活性的多肽提供了理論上的依據。

目前，制備抗菌肽常用到的蛋白酶包 括胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶等，利用這些蛋白酶已從酪蛋白、螺旋藻、油茶粕蛋白和小麥蛋白等多種材料中分離出抗菌肽［16-19］，而選用酸性蛋白酶制備抗菌肽的研究很少見報道。本實驗以花椒籽蛋白為原料，以其酶解產物為研究對象，對大腸桿菌的抑菌率為指標，優化酸性蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的條件，對制備抗菌肽的主要因素進行研究，同時利用響應面回歸分析對酶解條件進行優化，以期為花椒籽蛋白抗菌肽在食品中的應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

花椒籽 涼山州金陽縣花椒產區。

大腸桿菌（ATCC 25922） 四川農業大學食品學院微生物實驗室鑒定保存；酸性蛋白酶（酶活力≥50 U/mg） 北京華邁科生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、瓊脂粉、氯化鈉 成都科龍化工試劑廠；蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物科技有限責任公司；LB液體培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，調pH值至7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

CP225D型電子天平 德國賽多利斯股份公司；真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SW-CJ型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HZQ-A型恒溫振蕩培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；Thermo ST16R冷凍離心機 美國賽默飛有限公司。

1.2方法

1.2.1花椒籽蛋白的提取［20］

脫脂花椒籽→NaOH溶液提取→離心去沉淀→HCl溶液進行酸析→離心去上清液→水洗沉淀→調pH值→真空冷凍干燥→花椒籽蛋白

1.2.2酸性蛋白酶對花椒籽蛋白的酶解

酶解制備工藝參考薛培宇等［21］的方法，并作一定的修改。取1.0 g花椒籽蛋白溶于適量的去離子水中，在適當溫度的恒溫水浴鍋中預熱，達到酶解溫度后用HCl調節溶液的pH值至適宜值，加入酸性蛋白酶進行酶解。酶解過程中不斷攪拌，并滴加HCl或NaOH以維持溶液的pH值。酶解完成后取出放入95 ℃水浴鍋中滅酶15 min，冷卻，然后4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液調節pH值至中性，真空冷凍干燥，凍干粉保存備用。

1.2.3單因素試驗設計

按照1.2.2節的方法制備花椒籽蛋白的酶解液，對其中的底物質量濃度（10、20、30、40、50 mg/mL），酶與底物比（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、酶解pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解時間（2、3、4、5、6 h）進行考察。

1.2.4響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，在底物質量濃度30 mg/mL、pH 4.0的條件下，采用Box-Behnken設計原理，選取酶與底物比（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時間（X3）這3 個影響酶解產物抑菌活性的主要因素作為響應面考察因素，以對大腸桿菌抑菌率為響應值，利用Design Expert 8.0.5b軟件對試驗數據進行多元回歸擬合及對模型進行方差分析。

1.2.5水解度的測定

采用甲醛滴定法［22］測定。

1.2.6抑菌活性的測定

稱取0.250 g凍干粉溶于2 mL去離子水中，調節樣液的pH值至近中性，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，然后用0.22 μm的濾膜過濾除菌后進行抑菌實驗。

抑菌率的測定參照文獻［23］，并作一定的修改。以大腸桿菌為受試菌，接種于LB液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h。取過濾除菌后的樣液100 μL，加LB培養基30 μL和菌懸液70 μL（菌懸液濃度為103～104CFU/mL）并混勻，37 ℃、150 r/min搖床孵育1 h，取100 μL傾注于LB平板，37 ℃培養過夜，計算菌落數。以去離子水為對照組。計算抑菌率。實驗重復3次，結果取平均值。

1.3數據處理

響應面分析以外的其他數據采用Excel進行分析，0.01＜P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2　結果與分析

2.1酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽主要影響因素分析

2.1.1底物質量濃度對酶解產物抑菌效果的影響

在酶與底物比4.0%、pH 3.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h的條件下，測定不同底物質量濃度對酶解產物抑菌效果的影響，結果見圖1。隨著底物質量濃度的增大，酶解產物的抑菌活性增加，當底物質量濃度為30 mg/mL時，酶解產物對大腸桿菌的抑菌率達到最大；隨著底物質量濃度的增加，酶解產物的抑菌活性呈現先下降后升高的趨勢，下降的原因可能是底物質量濃度增大導致酶解不完全，其中具有抑菌活性組分的比例下降，致使抑菌率降低，而質量濃度在40 mg/mL后的抑菌率出現升高，其具體原因還有待進一步研究。因此，最佳底物質量濃度為30 mg/mL，優化試驗底物質量濃度選用30 mg/mL。

圖1　底物質量濃度對酶解產物抑菌活性的影響Fig.1　Effect of substrate concentration on the antibacterial activity of hydrolysate

2.1.2酶與底物比對酶解產物抑菌效果的影響

在底物質量濃度30 mg/mL、pH 3.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h的條件下，測定不同酶與底物比對酶解產物抑菌效果的影響，結果見圖2。隨著酶與底物比的增加，酶解產物的抑菌活性呈現先增加后降低的趨勢，酶與底物比為3.0%時酶解產物的抑菌活性達到最大。原因可能是酶與底物比較低時，酶解不充分，隨著酸性蛋白酶與花椒籽蛋白比例的增加，酶解產物中具有抑菌活性的多肽量增加，抑菌活性隨之增強；當酶與底物比較高時，酶與酶之間會產生競爭性抑制，過量的蛋白酶會將具有抑菌活性的多肽酶解成無抑菌活性的小分子片段或酶解成具有促進大腸桿菌生長作用的氨基酸等營養物質。因此，最佳酶與底物比為3.0%，優化試驗酶與底物比選用2.0%～4.0%。

圖2　酶與底物比對酶解產物抑菌效果的影響Fig.2　Effect of enzyme/substrate ratio on the antibacterial activity of hydrolysate

2.1.3pH值對酶解產物抑菌效果的影響

在底物質量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h的條件下，測定不同pH值對酶解產物抑菌效果的影響，結果見圖3。隨著pH值的增加，酶解產物的抑菌活性呈現先升高后降低的趨勢，pH值為4.0時，抑菌活性達到最大。原因可能是，當pH值低于或高于酶的最適pH值時，pH值會破壞蛋白酶的空間結構，引起酶的失活；也可能改變了底物的解離狀態，導致底物不能與酶結合。因此，最佳pH值為4.0，優化試驗pH值選用4.0。

圖3　pH值對酶解產物抑菌效果的影響Fig.3　Effect of pH on the antibacterial activity of hydrolysate

2.1.4酶解溫度對酶解產物抑菌效果的影響

在底物質量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、 pH 4.0、酶解時間3 h的條件下，測定不同酶解溫度對酶解產物抑菌效果的影響，結果見圖4。隨著酶解溫度的升高，酶解產物的抑菌活性呈現先增加后降低的趨勢，酶解溫度為55 ℃時，抑菌活性達到最大。原因可能是，酶解溫度的升高，提高了酶分子與花椒籽蛋白分子間的碰撞概率，使抑菌活性增大；當酶解溫度過高時，可能會使蛋白酶變性失活，或影響酶與底物的結合，不利于酶解反應的進行，導致抑菌活性降低。因此，最佳酶解溫度為55 ℃，優化試驗酶解溫度選用50～60 ℃。

圖4　酶解溫度對酶解產物抑菌效果的影響Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on the antibacterial activity of hydrolysate

2.1.5酶解時間對酶解產物抑菌效果的影響

在底物質量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、pH 4.0、酶解溫度55 ℃的條件下，測定不同酶解時間對酶解產物抑菌效果的影響，結果見圖5。隨著酶解時間的延長，酶解產物的抑菌活性呈現先增加后降低的趨勢，酶解時間為5 h時，抑菌活性達到最大。原因可能是，在5 h以前，酶解時間太短，酶解不充分，酶解產物的抑菌活性受到限制；5 h以后，具有抑菌活性的多肽可能會酶解成無抑菌活性的小分子片段或酶解成具有促進大腸桿菌生長作用的氨基酸等營養物質。因此，最佳酶解時間為5 h，優化試驗酶解時間選用4～6 h。

圖5　酶解時間對酶解產物抑菌效果的影響Fig.5　Effect of hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate

通過上述單因素試驗結果分析可知，酶與底物比、酶解溫度和酶解時間這3 個因素對酸性蛋白酶提取花椒籽蛋白所得抗菌肽復合物的抑菌活性影響顯著。單因素試驗所確定的酸性蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的合適條件為：底物質量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解溫度55 ℃、酶解時間5 h，此試驗結果為設定響應面試驗因素水平的零點提供參考。

2.2響應面優化酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽

2.2.1響應面法試驗設計及制備的抗菌肽抑菌效果

根據Box-Behnken設計原理，結合上述單因素試驗結果分析，運用Design Expert 8.0.5b軟件，選取酶與底物比、酶解溫度和酶解時間這3 個影響顯著的因素，各取3 個水平，采用三因素三水平的響應面分析方法，對酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽的工藝條件進行優化設計，其響應面分析方案及試驗結果和方差分析見表1和表2。

表1　響應面試驗設計及結果分析Table1　Experimental design and results for RSM

表2　方差分析結果Table2　Results of analysis of variance

由表2可知，回歸模型的P值為0.000 2，表明回歸模型是顯著的。失擬項的P檢驗值為0.14（P＞0.05），表明該模型可以充分地解釋響應中的變異，模型擬合度高，相對于純誤差是不顯著的。同時該模型具有較高的回歸系數（R2=96.78%），說明對于加工過程中的數據，有96.78%的抑菌率變異可由該模型解釋。因此，這種試驗方法是可靠的，可以用該模型對酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽的抑菌率進行分析和預測。

在該模型中，回歸系數的顯著性檢驗顯示，一次項X2，平方項，交互項X1X3、X2X3的影響均達到極顯著水平；交互項X1X2的影響達到顯著水平。由方差分析中的P值可知，在試驗范圍內對抑菌率影響大小的順序為：酶解溫度＞酶與底物比＞酶解時間。

綜合上述分析結果，得到酶與底物比（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時間（X3）的二次多項回歸方程：

2.2.2響應面分析

采用Design Expert 8.0.5b軟件對3 個因素間的交互作用進行全面的模型分析，模型的響應面曲線圖見圖6～8。

圖6　酶與底物比和酶解溫度交互作用對抑菌活性的影響Fig.6　Response surface and contour plots for the effect of enzyme/ substrate ratio and hydrolysis temperature on the antibacterial activity of hydrolsate

由圖6可知，無論酶解溫度處于何種水平，隨著酶與底物比的增加，酶解產物的抑菌活性均呈現先增加后降低的趨勢，原因可能為酶與底物處于低水平時，酶解不充分，生成抗菌肽的量較少，而處于較高水平時，生成的抗菌肽被酶解為更小的分子片段；無論酶與底物比處于何種水平，隨著酶解溫度的升高，酶解產物的抑菌活性均呈現先增加后降低的趨勢，原因可能為高于或低于酶解的最適溫度都會破壞酸性蛋白酶的活性，從而影響酶解反應的進行，造成抑菌活性的降低。

由圖7可知，無論酶解時間出于何種水平，隨著酶與底物比的增加，酶解產物的抑菌活性均呈現先升高后降低的趨勢；無論酶與底物比處于何種水平，隨著酶解時間的延長，酶解產物的抑菌活性都呈現先增加后降低的趨勢，原因可能是酶解時間太短，具有抗菌活性的基團沒有完全暴露出來，而酶解時間太長，具有抗菌活性的多肽被水解成了氨基酸等物質。

圖7　酶與底物比和酶解時間交互作用對抑菌活性的影響Fig.7　Response surface and contour plots for the effect of enzyme/substrate ratio and hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate

圖8　酶解溫度和酶解時間交互作用對抑菌活性的影響Fig.8　Response surface and contour plots for the effect of hydrolysis temperature and hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate

由圖8可知，當酶解時間處于低水平時，隨著酶解溫度的升高，酶解產物對大腸桿菌的抑菌活性逐漸降低，原因可能是溫度過高，破壞了酶解產物的穩定性，影響了多肽的抑菌活性；而酶解時間處于高水平時，隨著酶解溫度的升高，酶解產物的抑菌活性表現出平緩的先增加后降低的趨勢。當酶解溫度處于低水平時，隨著酶解時間的延長，酶解產物的抑菌活性變化平緩，酶解反應進行5.5 h后，抑菌率出現下降趨勢，原因可能是時間太長，酶解產物發生了解離，生成了無抑菌活性的物質；酶解溫度處于高水平時，隨著酶解時間的延長，酶解產物對大腸桿菌的抑菌率呈現先增加后降低的趨勢，但在5～6 h這一段時間內，變化趨勢較為平緩。

2.2.3最佳酶解工藝條件的驗證

通過Design Expert 8.0.5b軟件分析可得，酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽的最佳工藝條件為底物質量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.01%、酶解pH 4.0、酶解溫度51.22 ℃、酶解時間4.68 h，在此優化條件下，酶解產物抑菌率的理論值為56.46%。結合實際條件，最終選擇的試驗條件為底物質量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解溫度51.2 ℃、酶解時間4.7 h，實際測得酶解產物對大腸桿菌的平均抑菌率為56.98%。與理論值相比，相對誤差為0.91%。說明采用響應面法優化得到的工藝參數準確可靠，有實際應用的價值。在該優化條件下，酶解產物的水解度為9.05%，由于酶解產物的水解度與抗菌肽的抑菌率沒有顯著的線性關系［24-25］，所以本研究中只對在最佳工藝條件下獲得的抗菌肽進行了水解度的測定。

3　結 論

本研究對酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白條件進行了優化以及酶解產物抗菌性的研究，針對酶解過程中對大腸桿菌抑菌活性影響顯著的酶與底物比、酶解溫度和酶解時間進行了深入研究。最后得出在底物質量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解溫度51.2 ℃、酶解時間4.7 h時，測得酶解產物對大腸桿菌的平均抑菌率為56.98%，驗證結果顯示，該模型可靠，具有很好的預測能力。另外，在該模型條件下，所得酶解產物的水解度為9.05%。

抑菌實驗結果表明，酸性蛋白酶制備的花椒籽蛋白酶解產物對大腸桿菌的生長具有一定的抑菌效果，但抑制率較本項目中其他蛋白酶酶解產物而言較低，后續工作應將其作進一步純化以提高抑菌活性，并進一步研究不同蛋白酶酶解產物的抑菌機理。在某些條件下制備的花椒籽蛋白酶解產物對大腸桿菌的生長有一定促進作用，可能是酶解產生的氨基酸等營養物質促進了大腸桿菌的生長，但具體原因還有待進一步探究。

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Preparation of Antibacterial Peptide Derived from Hydrolysis of Prickly Ash Seed Protein by Acid Protease

JIANG Tailing， WU Hongyang， SHEN Guanghui， DONG Xiaohua， ZHANG Zhiqing*
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya'an 625014， China）

This work reports the preparation of antibacterial peptide by enzymatic hydrolysis of prickly ash seed protein with acid protease. Substrate concentration， enzyme/substrate ratio， pH， hydrolysis temperature and hydrolysis time were investigated by single factor method for their effect on the anti-E. coli activity of hydrolysates. Optimization of enzyme/ substrate ratio， hydrolysis temperature and hydrolysis time based on anti-E. coli activity of hydrolysates was carried out using a Box-Behnken experimental design. The degree of hydrolysis of prickly ash seed protein was 9.05% and the inhibitory rate of the produced antibacterial peptide against E. coli was 56.98% when the hydrolysis experiment was carried out for 4.7 h at 51.2 ℃ and an initial pH of 4.0 with a substrate concentration of 30 mg/mL and an enzyme/substrate ratio of 3.0%.

prickly ash seed protein； antibacterial peptide； acid protease； inhibitory rate

TS201.2

A

1002-6630（2015）13-0148-06

10.7506/spkx1002-6630-201513028

2014-09-03

四川農業大學“學科建設雙支計劃”項目（06070909）

姜太玲（1989—），女，碩士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：ynjiangtailing@163.com

張志清（1976—），男，教授，博士，研究方向為糧油副產物開發利用。E-mail：zqzhang721@163.com