烤鴨中金黃色葡萄球菌生長模型的建立

宇盛好，曹　慧，徐　斐，*，于勁松，袁　敏，彭少杰，王李偉，李　潔，王　穎

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海市食品藥品監(jiān)督管理局執(zhí)法總隊(duì)，上海 200233）

烤鴨中金黃色葡萄球菌生長模型的建立

宇盛好1，曹慧1，徐斐1，*，于勁松1，袁敏1，彭少杰2，王李偉2，李潔2，王穎2

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海市食品藥品監(jiān)督管理局執(zhí)法總隊(duì)，上海 200233）

選用修正的Gompertz（SGompertz）和修正的Logistic（Slogistic）作為一級(jí)生長模型，應(yīng)用Origin 9.0軟件分別擬合烤鴨中金黃色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生長數(shù)據(jù)，并以此獲得最大比生長速率（μmax）和遲滯期（λ）。在此基礎(chǔ)上，采用平方根模型和二次多項(xiàng)式模型建立二級(jí)生長模型。結(jié)果表明，SGompertz模型擬合的R2值優(yōu)于Slogistic模型。以SGompertz模型擬合得到的μmax建立平方根和二次多項(xiàng)式模型R2分別為0.942 3、0.947 1，偏差因子（Bf）分別為1.02和0.93，準(zhǔn)確因子（Af）分別為1.18和1.37，表明采用μmax進(jìn)行擬合時(shí)平方根模型的預(yù)測效果較好；以SGompertz模型擬合得到的λ建立的平方根和二次多項(xiàng)式模型R2分別為0.953 3、0.987 1，Bf分別為0.99和1.00，Af分別為1.11和1.06，表明采用λ進(jìn)行擬合時(shí)二次多項(xiàng)式模型較好。

金黃色葡萄球菌；烤鴨；一級(jí)生長模型；二級(jí)生長模型

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）在自然界中普遍存在［1］，其最適生長溫度為30～37 ℃［2］，pH值為范圍為4.5～9.3［3］。金黃色葡萄球菌的部分菌株可產(chǎn)生耐熱的致病性腸毒素［4］，主要有SEA～SEE 5 種血清型［5-6］，近年來許多新的腸毒素血清型如SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER和SEU被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［7-10］。在這些血清型中，其中由A型腸毒素引起食物中毒的現(xiàn)象較為常見［11-12］，當(dāng)其攝入量達(dá)到0.1～1.0 μg時(shí)即可引起食物中毒［3，13］。在美國由金黃色葡萄球腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%［14］。營養(yǎng)豐富且含水量較高的食品較易污染金黃色葡萄球菌，如即食熟肉［15-18］、乳制品［19-20］、奶油蛋糕［21］等。烤鴨是我國食用最為普遍的即食熟肉產(chǎn)品，同時(shí)也是金黃色葡萄球菌的重要污染源［22］，然而對(duì)烤鴨中金黃色葡萄球菌生長預(yù)測模型研究較少，因而本研究選用SGompertz和Slogistic作為一級(jí)生長模型，應(yīng)用Origin 9.0軟件分別擬合烤鴨中金黃色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生長數(shù)據(jù)，并以此獲得μmax和λ。在此基礎(chǔ)上，采用平方根模型和二次多項(xiàng)式模型建立二級(jí)生長模型，研究結(jié)果可為烤鴨的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、菌株與試劑

烤鴨，熟食店購買。

金黃色葡萄球菌株（ATCC6538），購于廣東省微生物研究所。

Baird-Parker瓊脂平板、亞碲酸鉀卵黃增菌液、腦心浸出液肉湯（BHI）、無菌均質(zhì)袋 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；NaCl（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海比朗儀器有限公司；SCIENTZ-09無菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；BCD-226K50型冰箱 TCL集團(tuán)股份有限公司。

1.3方法

1.3.1金黃色葡萄球菌的接種、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

將金黃色葡萄球菌接種到BHI營養(yǎng)液中，置于37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，在600 nm波長處測定菌懸液的吸光度，用無菌生理鹽水（8.5 g/L的NaCl溶液）梯度稀釋菌懸液，使初始接種量控制在103CFU/g左右。按無菌操作，將烤鴨分為10 g/份，在紫外下滅菌30 min后裝入無菌均質(zhì)袋，吸取1 mL稀釋過的菌懸液接種到上述無菌處理過的烤鴨之中，并分別置于10、15、25、30、37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)190、120、32、32、30 h。每隔一定時(shí)間取出1 份試樣加入90 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)2 min后取均質(zhì)液1 mL，稀釋并按照GB4789.10—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的平板計(jì)數(shù)法測定菌落數(shù)。每個(gè)溫度設(shè)3 組平行。不同溫度下測定終止時(shí)間以金黃色葡萄球菌生長達(dá)到穩(wěn)定期為準(zhǔn)。以未接種金黃色葡萄球菌的烤鴨作為空白對(duì)照。

1.3.2烤鴨中金黃色葡萄球菌一級(jí)生長模型的建立

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的烤鴨中金黃色葡萄球菌在不同溫度下的生長數(shù)據(jù)，選擇SGompertz模型［23］（公式（1））和Slogistic模型［23］（公式（2））為一級(jí)模型對(duì)烤鴨中金黃色葡萄球菌生長情況進(jìn)行擬合。根據(jù)擬合得到的模型參數(shù)，SGompertz模型選用公式（3）計(jì)算出最大比生長速率（μmax，lg（CFU/g）/h）和公式（4）計(jì)算出遲滯期（λ）。Slogistic模型選用公式（5）計(jì)算出最大比生長速率（μmax）和公式（6）計(jì)算出遲滯期（λ）。

式中：Nt、N0分別表示在時(shí)間t時(shí)和初始時(shí)間的微生物數(shù)量/（CFU/g）；λ為遲滯期/h；a為最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的對(duì)數(shù)值的差值（lg（CFU/g））；xc為達(dá)到相對(duì)最大生長速率所需的時(shí)間/h；k為在時(shí)間xc的相對(duì)生長速率/（（lg（CFU/g））/h）。

1.3.3烤鴨中金黃色葡萄球菌二級(jí)生長模型的建立

根據(jù)一級(jí)模型得到的烤鴨中金黃色葡萄球菌的最大比生長速率和遲滯期，選取平方根模型［24］（square root model）（公式（7）、（8））和二次多項(xiàng)式模型［25］（quadratic polynomial model）（公式（9））擬合其與溫度之間的生長關(guān)系，表達(dá)式如下：

式中：T是實(shí)驗(yàn)中的生長溫度/℃；Tmin是理論上金黃色葡萄球菌生長的最低溫度/℃；a、b、c為模型的參數(shù)。

1.3.4模型的評(píng)價(jià)

采用均方誤差（mean square error，MSE）（公式（10））和R2對(duì)一級(jí)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。選擇R2、MSE、偏差因子（bias factor，Bf）（公式（11））、準(zhǔn)確因子（accuracy factor，Af）（公式（12））對(duì)二級(jí)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)［25-29］。

式中：n為實(shí)測值個(gè)數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1烤鴨中金黃色葡萄球菌生長的一級(jí)模型

選用SGompertz和Slogistic模型，應(yīng)用Origin 9.0軟件分別擬合金黃色葡萄球菌在不同溫度的生長曲線（圖1～5），得到其模型擬合參數(shù)（表1）。結(jié)果表明，SGompertz模型能較好地?cái)M合烤鴨中金黃色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生長曲線，其R2值分別為0.996 7、0.994 8、0.995 3、0.991 0、0.998 7，均優(yōu)于Slogistic模型的R2值，MSE值分別為0.010 8、0.018 3、0.015 8、0.032 3、0.004 8均小于Slogistic模型的MSE值。這表明SGompertz模型的擬合度較高，模型的誤差較小，因此選擇其作為金黃色葡萄球菌最適的一級(jí)生長模型。

圖1　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在10 ℃的生長曲線Fig.1　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 10 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

圖2　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在15 ℃的生長曲線Fig.2　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 15 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

圖3　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在25 ℃的生長曲線Fig.3　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 25 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

圖4　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在30 ℃的生長曲線Fig.4　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 30 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

圖5　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在37 ℃的生長曲線Fig.5　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 37 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

表1　烤鴨中金黃色葡萄球菌的一級(jí)生長模型擬合參數(shù)Table1　Fitting parameters for the primary growth model of Staphylococcus aureus reus in roast duck

根據(jù)SGompertz模型擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在不同溫度下的最適生長模型如表2所示，由此計(jì)算的最大比生長速率和遲滯期如表3所示?？梢?，隨著溫度的增加，金黃色葡萄球菌在烤鴨中的最大比生長速率呈增加的趨勢(shì)，而遲滯期則呈降低的趨勢(shì)。

表2　烤鴨中金黃色葡萄球菌的最適一級(jí)生長模型Table2　Optimal primary growth model of eus in roast duck

表3　SGompertz模型得到的不同溫度條件下的生長參數(shù)Table3　Kinetic growth parameters estimated by SGompertz model at different temperatures ures

2.2烤鴨中金黃色葡萄球菌二級(jí)生長模型的建立

根據(jù)SGompertz模型擬合得到金黃色葡萄球菌在不同溫度下的μmax和λ，選用平方根和二次多項(xiàng)式模型作為二級(jí)模型，采用Origin 9.0軟件分別對(duì)溫度與μmax、λ的關(guān)系進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖6、7所示。

圖6　平方根模型（a）和二次多項(xiàng)式模型（b）擬合的烤鴨中μmax與生長溫度的關(guān)系曲線Fig.6　Maximum growth rates of Staphylococcus aureus at different temperatures fitted by square root model （a） and quadratic polynomial model （b）

圖7　平方根模型（a）和二次多項(xiàng)式模型（b）擬合的烤鴨中λ與生長溫度的關(guān)系曲線Fig.7　Lag time of Staphylococcus aureus at different temperatures fitted by square root model （a） and quadratic polynomial model （b）

由圖6a可知，采用平方根模型擬合的溫度與μmax關(guān)系的R2為0.942 3，采用二次多項(xiàng)式模型（圖6b）擬合的R2為0.947 1。

由圖7可知，采用平方根模型擬合的溫度與λ關(guān)系的R2為0.953 3，采用二次多項(xiàng)式模型擬合的R2為0.987 1。可見選用的兩種二級(jí)模型擬合度都較高。

2.3模型評(píng)價(jià)

Bf和Af被認(rèn)為是驗(yàn)證模型可靠度的有效工具［28-29］。根據(jù)Ross對(duì)偏差因子的劃分標(biāo)準(zhǔn)［26，30-31］，Bf在0.9～1.05之間，Bf越接近于1，模型越可靠；如果Bf值在0.70～0.90或者1.06～1.15范圍之內(nèi)，該模型也可以被接受。Af與Bf類似，其值越接近1，模型越可靠［26，29-31］。MSE則用來評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的變異程度，MSE值越小，說明預(yù)測模型精確度越好。因而，本研究采用MSE、Bf和Af對(duì)所建的平方根模型和二次多項(xiàng)式模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表4所示。

表4　二級(jí)模型的評(píng)價(jià)Table4　Various statistical characteristics of secondary models

由表4可知，在對(duì)金黃色葡萄球菌生長溫度與μmax之間的關(guān)系進(jìn)行擬合時(shí)，平方根模型的Bf為1.02，Af為1.18，表明該生長模型的預(yù)測值超出實(shí)測值2%（Bf＞1），預(yù)測誤差為18%。二次多項(xiàng)式模型的Bf為0.93，Af為1.37，表明該生長預(yù)測模型的預(yù)測誤差為37%。兩種二級(jí)模的MSE值較小，均小于0.004。由于平方根模型的Bf和Af更接近于1，因此選擇其預(yù)測烤鴨中金黃色葡萄球菌在10～37 ℃之間的生長。Kang等［31］采用修正Gompertz模型為一級(jí)模型，平方根模型為二級(jí)模型建立了不同溫度下半干的秋刀魚中金黃色葡萄球菌的最大比生長速率預(yù)測模型，該模型的Bf值為1.02，Af為1.17，可能的預(yù)測誤差為17%，預(yù)測效果與本研究類似。

進(jìn)一步對(duì)金黃色葡萄球菌生長溫度與λ之間的關(guān)系進(jìn)行擬合，可見平方根模型的Bf為0.99，Af為1.11，表明該生長預(yù)測模型的預(yù)測誤差為11%。而二次多項(xiàng)式模型的Bf為1.00，Af為1.06，其預(yù)測誤差僅為6%。同時(shí)，二次多項(xiàng)式模型的MSE值（0.081 3）也明顯小于平方根模型的MSE值（0.402 3），因此選擇其預(yù)測烤鴨中金黃色葡萄球菌在10～37 ℃之間生長的遲滯期。Park等［25］也采用修正的Gompertz模型為一級(jí)模型，二次多項(xiàng)式模型為二級(jí)模型建立了不同溫度下煮菠菜中金黃色葡萄球菌的遲滯期預(yù)測模型，其Bf值為1.05，Af為1.19，可能的預(yù)測誤差為19%，誤差略高于本研究。Kang等［31］采用和本研究同樣的模型建立了不同溫度下半干的秋刀魚中金黃色葡萄球菌的遲滯期預(yù)測模型時(shí)，該模型的Bf值為1.08，Af值為1.08，可能的預(yù)測誤差為8%，預(yù)測效果與本研究類似。

3　結(jié) 論

SGompertz模型能較好地?cái)M合烤鴨中金黃色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生長曲線，其R2都在0.99以上，MSE值均小于0.04，因此選擇其作為金黃色葡萄球菌最適的一級(jí)生長預(yù)測模型。在對(duì)金黃色葡萄球菌生長溫度與其最大比生長速率之間的關(guān)系進(jìn)行擬合時(shí)，平方根模型的Bf為1.02，Af為1.18，MSE值為0.003 7，因此選擇其預(yù)測烤鴨中金黃色葡萄球菌在10～37 ℃之間的生長，相應(yīng)的二級(jí)平方根模型為在對(duì)金黃色葡萄球菌生長溫度與其遲滯期之間的關(guān)系進(jìn)行擬合時(shí)，二次多項(xiàng)式模型的Bf為1.00，Af為1.06，MSE值為0.081 3，因此選擇其預(yù)測烤鴨中金黃色葡萄球菌在10～37 ℃之間的生長遲滯期，相應(yīng)的二次多項(xiàng)式模型為λ=0.015 0T2-1.037 2T+19.896 3。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以對(duì)以后烤鴨等即食肉制品的危害分析與關(guān)鍵控制點(diǎn)（hazard analysis and critical control point，HACCP）和定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的暴露評(píng)估提供了科學(xué)依據(jù)。

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Predictive Models for the Growth of Staphylococcus aureus in Roast Duck

YU Shenghao1， CAO Hui1， XU Fei1，*， YU Jinsong1， YUAN Min1， PENG Shaojie2， WANG Liwei2， LI Jie2， WANG Ying2
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China；2. Law Enforcement Corps of Shanghai Food and Drug Administration Bureau， Shanghai 200233， China）

Modified Gompertz （SGompertz） and logistic （Slogistic） models were selected as the primary growth models to fit the growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at various storage temperatures （10， 15， 25， 30 and 37 ℃）. Using the obtained specific growth rate （μmax） and lag time （λ）， square root model and quadratic polynomial model were selected to fit the secondary growth models of Staphylococcus aureus in roast duck. The results showed that the SGompertz model could well describe the growth of Staphylococcus aureus at different temperatures， and therefore μmaxand λ values obtained from it were used to establish the secondary growth models. It was found that for the square root and quadratic polynomial models based on μmax， R2values were 0.942 3 and 0.947 1； Bfwere 1.02 and 0.93； Afwere 1.18 and 1.37， respectively， suggesting that the square root model could be employed to predict the growth of Staphylococcus aureus in roast duck. For the square root and quadratic polynomial models describing λ， R2were 0.953 3 and 0.987 1； Bfwere 0.99 and 1.00； Afwere 1.11 and 1.06，respectively， suggesting that the quadratic polynomial model could be employed to predict λ. This study can provide basic information for quantitative microbial risk assessment of roast duck and other ready-to-eat cooked meat products.

Staphylococcus aureus； roast duck； primary growth model； secondary growth model

TS201.3

A

1002-6630（2015）13-0154-06

10.7506/spkx1002-6630-201513029

2014-09-09

上海市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（11391902000；13391901400）

宇盛好（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。E-mail：850368049@qq.com

徐斐（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。E-mail：xufei.first@263.net