烤鴨中金黃色葡萄球菌生長模型的建立

宇盛好，曹　慧，徐　斐，*，于勁松，袁　敏，彭少杰，王李偉，李　潔，王　穎

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海市食品藥品監督管理局執法總隊，上海 200233）

烤鴨中金黃色葡萄球菌生長模型的建立

宇盛好1，曹慧1，徐斐1，*，于勁松1，袁敏1，彭少杰2，王李偉2，李潔2，王穎2

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海市食品藥品監督管理局執法總隊，上海 200233）

選用修正的Gompertz（SGompertz）和修正的Logistic（Slogistic）作為一級生長模型，應用Origin 9.0軟件分別擬合烤鴨中金黃色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生長數據，并以此獲得最大比生長速率（μmax）和遲滯期（λ）。在此基礎上，采用平方根模型和二次多項式模型建立二級生長模型。結果表明，SGompertz模型擬合的R2值優于Slogistic模型。以SGompertz模型擬合得到的μmax建立平方根和二次多項式模型R2分別為0.942 3、0.947 1，偏差因子（Bf）分別為1.02和0.93，準確因子（Af）分別為1.18和1.37，表明采用μmax進行擬合時平方根模型的預測效果較好；以SGompertz模型擬合得到的λ建立的平方根和二次多項式模型R2分別為0.953 3、0.987 1，Bf分別為0.99和1.00，Af分別為1.11和1.06，表明采用λ進行擬合時二次多項式模型較好。

金黃色葡萄球菌；烤鴨；一級生長模型；二級生長模型

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）在自然界中普遍存在［1］，其最適生長溫度為30～37 ℃［2］，pH值為范圍為4.5～9.3［3］。金黃色葡萄球菌的部分菌株可產生耐熱的致病性腸毒素［4］，主要有SEA～SEE 5 種血清型［5-6］，近年來許多新的腸毒素血清型如SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER和SEU被陸續發現［7-10］。在這些血清型中，其中由A型腸毒素引起食物中毒的現象較為常見［11-12］，當其攝入量達到0.1～1.0 μg時即可引起食物中毒［3，13］。在美國由金黃色葡萄球腸毒素引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%［14］。營養豐富且含水量較高的食品較易污染金黃色葡萄球菌，如即食熟肉［15-18］、乳制品［19-20］、奶油蛋糕［21］等。烤鴨是我國食用最為普遍的即食熟肉產品，同時也是金黃色葡萄球菌的重要污染源［22］，然而對烤鴨中金黃色葡萄球菌生長預測模型研究較少，因而本研究選用SGompertz和Slogistic作為一級生長模型，應用Origin 9.0軟件分別擬合烤鴨中金黃色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生長數據，并以此獲得μmax和λ。在此基礎上，采用平方根模型和二次多項式模型建立二級生長模型，研究結果可為烤鴨的定量風險評估提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料、菌株與試劑

烤鴨，熟食店購買。

金黃色葡萄球菌株（ATCC6538），購于廣東省微生物研究所。

Baird-Parker瓊脂平板、亞碲酸鉀卵黃增菌液、腦心浸出液肉湯（BHI）、無菌均質袋 青島高科園海博生物技術有限公司；NaCl（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HWS-150型恒溫恒濕培養箱 上海比朗儀器有限公司；SCIENTZ-09無菌均質器 寧波新芝生物科技股份有限公司；BCD-226K50型冰箱 TCL集團股份有限公司。

1.3方法

1.3.1金黃色葡萄球菌的接種、培養及計數

將金黃色葡萄球菌接種到BHI營養液中，置于37 ℃的恒溫恒濕培養箱中培養12 h，在600 nm波長處測定菌懸液的吸光度，用無菌生理鹽水（8.5 g/L的NaCl溶液）梯度稀釋菌懸液，使初始接種量控制在103CFU/g左右。按無菌操作，將烤鴨分為10 g/份，在紫外下滅菌30 min后裝入無菌均質袋，吸取1 mL稀釋過的菌懸液接種到上述無菌處理過的烤鴨之中，并分別置于10、15、25、30、37 ℃的恒溫恒濕培養箱中分別培養190、120、32、32、30 h。每隔一定時間取出1 份試樣加入90 mL無菌生理鹽水，均質2 min后取均質液1 mL，稀釋并按照GB4789.10—2010《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》中的平板計數法測定菌落數。每個溫度設3 組平行。不同溫度下測定終止時間以金黃色葡萄球菌生長達到穩定期為準。以未接種金黃色葡萄球菌的烤鴨作為空白對照。

1.3.2烤鴨中金黃色葡萄球菌一級生長模型的建立

根據實驗得到的烤鴨中金黃色葡萄球菌在不同溫度下的生長數據，選擇SGompertz模型［23］（公式（1））和Slogistic模型［23］（公式（2））為一級模型對烤鴨中金黃色葡萄球菌生長情況進行擬合。根據擬合得到的模型參數，SGompertz模型選用公式（3）計算出最大比生長速率（μmax，lg（CFU/g）/h）和公式（4）計算出遲滯期（λ）。Slogistic模型選用公式（5）計算出最大比生長速率（μmax）和公式（6）計算出遲滯期（λ）。

式中：Nt、N0分別表示在時間t時和初始時間的微生物數量/（CFU/g）；λ為遲滯期/h；a為最大菌數Nmax與初始菌數N0的對數值的差值（lg（CFU/g））；xc為達到相對最大生長速率所需的時間/h；k為在時間xc的相對生長速率/（（lg（CFU/g））/h）。

1.3.3烤鴨中金黃色葡萄球菌二級生長模型的建立

根據一級模型得到的烤鴨中金黃色葡萄球菌的最大比生長速率和遲滯期，選取平方根模型［24］（square root model）（公式（7）、（8））和二次多項式模型［25］（quadratic polynomial model）（公式（9））擬合其與溫度之間的生長關系，表達式如下：

式中：T是實驗中的生長溫度/℃；Tmin是理論上金黃色葡萄球菌生長的最低溫度/℃；a、b、c為模型的參數。

1.3.4模型的評價

采用均方誤差（mean square error，MSE）（公式（10））和R2對一級模型進行評價。選擇R2、MSE、偏差因子（bias factor，Bf）（公式（11））、準確因子（accuracy factor，Af）（公式（12））對二級模型進行評價［25-29］。

式中：n為實測值個數。

2　結果與分析

2.1烤鴨中金黃色葡萄球菌生長的一級模型

選用SGompertz和Slogistic模型，應用Origin 9.0軟件分別擬合金黃色葡萄球菌在不同溫度的生長曲線（圖1～5），得到其模型擬合參數（表1）。結果表明，SGompertz模型能較好地擬合烤鴨中金黃色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生長曲線，其R2值分別為0.996 7、0.994 8、0.995 3、0.991 0、0.998 7，均優于Slogistic模型的R2值，MSE值分別為0.010 8、0.018 3、0.015 8、0.032 3、0.004 8均小于Slogistic模型的MSE值。這表明SGompertz模型的擬合度較高，模型的誤差較小，因此選擇其作為金黃色葡萄球菌最適的一級生長模型。

圖1　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在10 ℃的生長曲線Fig.1　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 10 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

圖2　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在15 ℃的生長曲線Fig.2　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 15 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

圖3　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在25 ℃的生長曲線Fig.3　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 25 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

圖4　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在30 ℃的生長曲線Fig.4　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 30 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

圖5　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在37 ℃的生長曲線Fig.5　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 37 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

表1　烤鴨中金黃色葡萄球菌的一級生長模型擬合參數Table1　Fitting parameters for the primary growth model of Staphylococcus aureus reus in roast duck

根據SGompertz模型擬合的烤鴨中金黃色葡萄球菌在不同溫度下的最適生長模型如表2所示，由此計算的最大比生長速率和遲滯期如表3所示。可見，隨著溫度的增加，金黃色葡萄球菌在烤鴨中的最大比生長速率呈增加的趨勢，而遲滯期則呈降低的趨勢。

表2　烤鴨中金黃色葡萄球菌的最適一級生長模型Table2　Optimal primary growth model of eus in roast duck

表3　SGompertz模型得到的不同溫度條件下的生長參數Table3　Kinetic growth parameters estimated by SGompertz model at different temperatures ures

2.2烤鴨中金黃色葡萄球菌二級生長模型的建立

根據SGompertz模型擬合得到金黃色葡萄球菌在不同溫度下的μmax和λ，選用平方根和二次多項式模型作為二級模型，采用Origin 9.0軟件分別對溫度與μmax、λ的關系進行擬合，結果如圖6、7所示。

圖6　平方根模型（a）和二次多項式模型（b）擬合的烤鴨中μmax與生長溫度的關系曲線Fig.6　Maximum growth rates of Staphylococcus aureus at different temperatures fitted by square root model （a） and quadratic polynomial model （b）

圖7　平方根模型（a）和二次多項式模型（b）擬合的烤鴨中λ與生長溫度的關系曲線Fig.7　Lag time of Staphylococcus aureus at different temperatures fitted by square root model （a） and quadratic polynomial model （b）

由圖6a可知，采用平方根模型擬合的溫度與μmax關系的R2為0.942 3，采用二次多項式模型（圖6b）擬合的R2為0.947 1。

由圖7可知，采用平方根模型擬合的溫度與λ關系的R2為0.953 3，采用二次多項式模型擬合的R2為0.987 1。可見選用的兩種二級模型擬合度都較高。

2.3模型評價

Bf和Af被認為是驗證模型可靠度的有效工具［28-29］。根據Ross對偏差因子的劃分標準［26，30-31］，Bf在0.9～1.05之間，Bf越接近于1，模型越可靠；如果Bf值在0.70～0.90或者1.06～1.15范圍之內，該模型也可以被接受。Af與Bf類似，其值越接近1，模型越可靠［26，29-31］。MSE則用來評價數據的變異程度，MSE值越小，說明預測模型精確度越好。因而，本研究采用MSE、Bf和Af對所建的平方根模型和二次多項式模型進行評價，結果如表4所示。

表4　二級模型的評價Table4　Various statistical characteristics of secondary models

由表4可知，在對金黃色葡萄球菌生長溫度與μmax之間的關系進行擬合時，平方根模型的Bf為1.02，Af為1.18，表明該生長模型的預測值超出實測值2%（Bf＞1），預測誤差為18%。二次多項式模型的Bf為0.93，Af為1.37，表明該生長預測模型的預測誤差為37%。兩種二級模的MSE值較小，均小于0.004。由于平方根模型的Bf和Af更接近于1，因此選擇其預測烤鴨中金黃色葡萄球菌在10～37 ℃之間的生長。Kang等［31］采用修正Gompertz模型為一級模型，平方根模型為二級模型建立了不同溫度下半干的秋刀魚中金黃色葡萄球菌的最大比生長速率預測模型，該模型的Bf值為1.02，Af為1.17，可能的預測誤差為17%，預測效果與本研究類似。

進一步對金黃色葡萄球菌生長溫度與λ之間的關系進行擬合，可見平方根模型的Bf為0.99，Af為1.11，表明該生長預測模型的預測誤差為11%。而二次多項式模型的Bf為1.00，Af為1.06，其預測誤差僅為6%。同時，二次多項式模型的MSE值（0.081 3）也明顯小于平方根模型的MSE值（0.402 3），因此選擇其預測烤鴨中金黃色葡萄球菌在10～37 ℃之間生長的遲滯期。Park等［25］也采用修正的Gompertz模型為一級模型，二次多項式模型為二級模型建立了不同溫度下煮菠菜中金黃色葡萄球菌的遲滯期預測模型，其Bf值為1.05，Af為1.19，可能的預測誤差為19%，誤差略高于本研究。Kang等［31］采用和本研究同樣的模型建立了不同溫度下半干的秋刀魚中金黃色葡萄球菌的遲滯期預測模型時，該模型的Bf值為1.08，Af值為1.08，可能的預測誤差為8%，預測效果與本研究類似。

3　結 論

SGompertz模型能較好地擬合烤鴨中金黃色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生長曲線，其R2都在0.99以上，MSE值均小于0.04，因此選擇其作為金黃色葡萄球菌最適的一級生長預測模型。在對金黃色葡萄球菌生長溫度與其最大比生長速率之間的關系進行擬合時，平方根模型的Bf為1.02，Af為1.18，MSE值為0.003 7，因此選擇其預測烤鴨中金黃色葡萄球菌在10～37 ℃之間的生長，相應的二級平方根模型為在對金黃色葡萄球菌生長溫度與其遲滯期之間的關系進行擬合時，二次多項式模型的Bf為1.00，Af為1.06，MSE值為0.081 3，因此選擇其預測烤鴨中金黃色葡萄球菌在10～37 ℃之間的生長遲滯期，相應的二次多項式模型為λ=0.015 0T2-1.037 2T+19.896 3。本實驗結果可以對以后烤鴨等即食肉制品的危害分析與關鍵控制點（hazard analysis and critical control point，HACCP）和定量風險評估的暴露評估提供了科學依據。

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Predictive Models for the Growth of Staphylococcus aureus in Roast Duck

YU Shenghao1， CAO Hui1， XU Fei1，*， YU Jinsong1， YUAN Min1， PENG Shaojie2， WANG Liwei2， LI Jie2， WANG Ying2
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China；2. Law Enforcement Corps of Shanghai Food and Drug Administration Bureau， Shanghai 200233， China）

Modified Gompertz （SGompertz） and logistic （Slogistic） models were selected as the primary growth models to fit the growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at various storage temperatures （10， 15， 25， 30 and 37 ℃）. Using the obtained specific growth rate （μmax） and lag time （λ）， square root model and quadratic polynomial model were selected to fit the secondary growth models of Staphylococcus aureus in roast duck. The results showed that the SGompertz model could well describe the growth of Staphylococcus aureus at different temperatures， and therefore μmaxand λ values obtained from it were used to establish the secondary growth models. It was found that for the square root and quadratic polynomial models based on μmax， R2values were 0.942 3 and 0.947 1； Bfwere 1.02 and 0.93； Afwere 1.18 and 1.37， respectively， suggesting that the square root model could be employed to predict the growth of Staphylococcus aureus in roast duck. For the square root and quadratic polynomial models describing λ， R2were 0.953 3 and 0.987 1； Bfwere 0.99 and 1.00； Afwere 1.11 and 1.06，respectively， suggesting that the quadratic polynomial model could be employed to predict λ. This study can provide basic information for quantitative microbial risk assessment of roast duck and other ready-to-eat cooked meat products.

Staphylococcus aureus； roast duck； primary growth model； secondary growth model

TS201.3

A

1002-6630（2015）13-0154-06

10.7506/spkx1002-6630-201513029

2014-09-09

上海市科委重點攻關項目（11391902000；13391901400）

宇盛好（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全風險評估。E-mail：850368049@qq.com

徐斐（1972—），女，教授，博士，研究方向為食品安全風險評估。E-mail：xufei.first@263.net