響應(yīng)面法優(yōu)化木醋桿菌發(fā)酵釀酒丟糟水解液產(chǎn)細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基及其產(chǎn) 物性能

張　雯，劉　康，羅霏霏，張敏娟，李彥軍

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

響應(yīng)面法優(yōu)化木醋桿菌發(fā)酵釀酒丟糟水解液產(chǎn)細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基及其產(chǎn) 物性能

張?chǎng)瑒⒖担_霏霏，張敏娟，李彥軍

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

為提高木醋桿菌（Acetobacter xylinum）發(fā)酵釀酒丟糟水解液生產(chǎn)細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）的產(chǎn)量，采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)比較了發(fā)酵產(chǎn)物BC的性能和結(jié)構(gòu)。通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果確定木醋桿菌發(fā)酵釀酒丟糟水解液生產(chǎn)BC的最佳培養(yǎng)基配方為：蔗糖39.33 g、蛋白胨20.01 g、MgSO40.91 g、檸檬酸鈉3.45 g、黃嘌呤1.02 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL、pH 6.0。在此條件下BC的產(chǎn)量為6.27 g/L，較優(yōu)化前（4.4 g/L）提高了42.5%。利用傅里葉紅外光譜、X射線(xiàn)衍射、掃描電子顯微鏡對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物BC的性能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，酒糟水解液發(fā)酵產(chǎn)物BC結(jié)構(gòu)性能與基本培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物BC的基本一致，說(shuō)明酒糟水解液能夠替代部分發(fā)酵原料發(fā)酵生產(chǎn)BC，且不影響B(tài)C性能。

釀酒丟糟；細(xì)菌纖維素；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面法；性能

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由生長(zhǎng)在液態(tài)含糖基質(zhì)中的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的纖維素成分。與植物纖維素相比，BC不含半纖維素和木質(zhì)素，具有高持水率（大于90%）、高分子質(zhì)量以及較高的結(jié)晶度。目前，BC作為一種新型功能材料受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注，如今已成功地應(yīng)用于食品、生物醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)器材、化妝品、膜濾器等多個(gè)領(lǐng)域［1-2］。但BC培養(yǎng)基成本高、產(chǎn)量低等問(wèn)題卻是其工業(yè)化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用的瓶頸。利用各種廢渣、廢液進(jìn)行生產(chǎn)，減輕環(huán)保壓力，其應(yīng)用前景比動(dòng)植物多糖更為廣闊［3］。

我國(guó)是白酒生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)，在釀制白酒的過(guò)程中不可避免地會(huì)出現(xiàn)釀酒副產(chǎn)物酒糟、黃水、酒尾等。通常每生產(chǎn)1 t白酒就要產(chǎn)生3 t酒糟，2008年我國(guó)白酒的產(chǎn)量約為600 萬(wàn)t，這樣我國(guó)每年酒糟的產(chǎn)量就達(dá)1 800多萬(wàn)噸。一方面由于對(duì)其開(kāi)發(fā)利用有限易造成污染環(huán)境，而另一方面酒糟中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又造成資源的浪費(fèi)。閻立平等［4］曾研究了用米酒糟制備BC，沈金 朋等［5］利用未經(jīng)預(yù)處理的酒糟為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)BC，發(fā)酵15 d后的BC產(chǎn)量為2.7 g/L。本研究擬利用白酒酒糟水解液作為發(fā)酵原料，采用響應(yīng)面法對(duì)BC發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)利用傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）、X射線(xiàn)衍射（X-ray diffraction，XRD）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）研究發(fā)酵產(chǎn)物BC性能及結(jié)構(gòu)，探索酒糟作為發(fā)酵原料對(duì)BC的影響。本研究可為BC發(fā)酵提供一種廉價(jià)原料，為其規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)，同時(shí)可為酒糟的綜合利用、附加值的提升和酒類(lèi)的清潔化生產(chǎn)提供一條新的途徑，具有良好的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

木醋桿菌（Acetobacter xylinum） 陜西科技大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室；酒糟 西安酒廠(chǎng)；纖維素酶（700 EGU/g）、淀粉酶（135 KNU/g）、糖化酶（170 AGU/g）、堿性蛋白酶（2.4 AU/g） 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。

固體培養(yǎng)基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、Na2HPO44.40 g、檸檬酸0.80 g、瓊脂18.00 g、乙醇10 mL、自來(lái)水1 000 mL，pH 6.0；種子培養(yǎng)基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、Na2HPO44.40 g、檸檬酸0.80 g、乙醇10 mL、自來(lái)水1 000 mL，pH 6.0；基本發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL，pH 6.0；其余試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2儀器與設(shè)備

S-4800電鏡掃描儀 日本日立公司；D/max2200PC全自動(dòng)X射線(xiàn)衍射儀 日本Rigaku公司；VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Brucher公司；MG250B恒溫培養(yǎng)箱、HYG-1A恒溫振蕩器 上海新瑞儀器有限公司；XPS-8CA光學(xué)顯微鏡 上海光學(xué)儀器有限公司；752型紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1還原糖含量的測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法［6］測(cè)定。

1.3.2氨基態(tài)氮含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法［7］測(cè)定。

1.3.3BC膜處理

將發(fā)酵所得BC膜浸泡于0.10 mol/L NaOH溶液中，80 ℃浸泡30 min，繼續(xù)加熱煮沸2 h，再用蒸餾水反 復(fù)沖洗，直到pH值為7.0，冷凍干燥［8-9］。

1.3.4BC膜產(chǎn)量測(cè)定

采用稱(chēng)質(zhì)量法［10］測(cè)定。

1.3.5BC鑒定及基團(tuán)分析

采用傅里葉紅外光譜掃描法［9］。樣品處理：取適量BC干膜放入紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定，450 mW，掃描范圍4 500～400 cm-1，設(shè)定分辨率4 cm-1，掃描速率為0.2 cm/s，室溫下操作。

1.3.6BC膜結(jié)晶度

采用X射線(xiàn)衍射光譜掃描法［9］。樣品處理：BC干膜平整固定在樣品架上，銅靶，測(cè)試電壓40 kV，測(cè)試電流100 mA，速率5°/min，步寬0.02°，2θ為0～80°范圍掃描。根據(jù)X衍射參數(shù)，由下面兩個(gè)計(jì)算公式分別計(jì)算細(xì)菌纖維素的結(jié)晶度（Xc）和晶體的粒徑（L）。

式中：I為衍射峰的衍射強(qiáng)度；Iam為無(wú)定形區(qū)衍射強(qiáng)度；L為晶體的粒徑/nm；β為半峰寬/rad；k為常數(shù)，通常取0.89；λ為X射線(xiàn)波長(zhǎng)（0.154 06 nm）；θ為布拉格衍射角/（°）。

1.3.7BC膜表面形貌

采用掃描電鏡法［9］。樣品處理：處理后的BC干膜置于液氮中，脆斷處理，分別取斷面及表面制樣，噴金鍍膜后利用掃描電子顯微鏡觀(guān)察其微觀(guān)結(jié)構(gòu)，電壓25 kV。

1.4酒糟水解液的制備

取經(jīng)粉碎干燥的酒糟，加自來(lái)水至液固比為10∶1（V/m），加纖維素酶至終濃度為25.00 EGU/g，pH 5.0～6.0、60 ℃條件下水解6 h，反應(yīng)結(jié)束后升溫至100 ℃，維持10 min滅酶，得水解液1。水解液1加淀粉酶至終濃度為25.00 KNU/g，pH 5.5～6.5、70 ℃水解60 min，反應(yīng)結(jié)束后升溫至100 ℃，維持10 min滅酶，得水解液2。水解液2加糖化酶至終濃度為15.00 AGU/g，pH 4.0～5.0、70 ℃水解40 h，反應(yīng)結(jié)束后升溫至100 ℃，維持10 min滅酶，得水解液3。水解液3加堿性蛋白酶至終濃度為0.10 AU/g，pH 8.0～9.0、70 ℃水解10 h，反應(yīng)結(jié)束后升溫至100 ℃，維持10 min滅酶，得酒糟水解液。

1.5BC的發(fā)酵

斜面培養(yǎng)：挑取木醋桿菌保藏菌種劃斜面，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d；種子液制備：挑取木醋桿菌活化菌種接種子培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，培養(yǎng)液置于30 ℃，160 r/min搖床振蕩30 min，得種子液；發(fā)酵培養(yǎng)：移取木醋桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量30 mL/250 mL三角瓶，接種量20%，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10 d。

1.6單因素試驗(yàn)

以發(fā)酵液中BC產(chǎn)量為指標(biāo)，考察碳源種類(lèi)及含量（葡萄糖、蔗糖、乳糖，設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00 g/L）、氮源種類(lèi)及含量（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨，設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00 g/L）、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及含量（MgSO4、Na2HPO4、檸檬酸鈉，設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 g/L）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）抑制劑種類(lèi)及含量（黃嘌呤、咖啡因，設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10、1.50、2.00 g/L）等因素對(duì)BC產(chǎn)量的影響。初始培養(yǎng)基配方為：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL、pH 6.0，后續(xù)因素的試驗(yàn)將前一個(gè)因素的較佳條件帶入以置換初始條件。

1.7響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Design Expert 7.0軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取影響較大的因素，以發(fā)酵液中BC產(chǎn)量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

1.8發(fā)酵產(chǎn)物性能研究

以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為菌種，按照優(yōu)化培養(yǎng)基配方制備酒糟水解液發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)BC，記為BC-YP，利用基本培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)BC記為BC-DZ。利用FT-IR、SEM、XRD對(duì)BC-YP及BC-DZ進(jìn)行檢測(cè)，研究酒糟水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料對(duì)BC性能的影響。

1.9數(shù)據(jù)處理方法

所有數(shù)據(jù)均用3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值表示，用SPSS 18軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1碳源對(duì)BC產(chǎn)量的影響

圖1　碳源種類(lèi)及質(zhì)量濃度對(duì)BC產(chǎn)量的影響Fig.1　Effect of carbon source type and mass concentration on the yield of BC

由圖1可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中所加入葡萄糖質(zhì)量濃度低于30.00 g/L，蔗糖和乳糖質(zhì)量濃度低于40.00 g/L時(shí)，BC產(chǎn)量隨著糖質(zhì)量濃度的增大呈上升趨勢(shì)。隨著所添加糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，BC產(chǎn)量反而降低。相同質(zhì)量濃度水平下，蔗糖作為碳源時(shí)BC產(chǎn)量最大，其次分別是乳糖、葡萄糖。分析原因，主要有以下四方面：1）培養(yǎng)基中糖含量過(guò)低，所提供碳源不能滿(mǎn)足菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成，因此BC產(chǎn)量較低；2）培養(yǎng)基中糖含量過(guò)高，引起培養(yǎng)基滲透壓過(guò)高，抑制菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成，使BC產(chǎn)量降低；3）相較于蔗糖和乳糖，葡萄糖為微生物可更快速利用的碳源。高質(zhì)量濃度葡萄糖的快速利用，容易引起糖代謝途徑中丙酮酸的積累及無(wú)氧酵解產(chǎn)物乳酸、醋酸等的產(chǎn)生，使發(fā)酵液pH值降低，不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成［11］。同時(shí)快速利用基質(zhì)的利用易產(chǎn)生對(duì)產(chǎn)物合成相關(guān)酶的阻遏作用，不利于發(fā)酵過(guò)程由細(xì)胞生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)為產(chǎn)物生產(chǎn)期，從而降低產(chǎn)物產(chǎn)量；4）蔗糖和乳糖作為碳源時(shí)，微生物對(duì)其水解速率不同，其利用速率也不相同。培養(yǎng)基中添加40.00 g/L的蔗糖比相同質(zhì)量濃度的乳糖發(fā)酵產(chǎn)BC產(chǎn)量高，可能是因?yàn)槟敬讞U菌（Acetobacter xylinum）在代謝過(guò)程中將蔗糖水解為葡萄糖及果糖，其代謝及利用速率更適宜于產(chǎn)物BC的合成，因而可促進(jìn)BC的合成。因此選擇蔗糖質(zhì)量濃度40.00 g/L為較佳參數(shù)。

2.1.2氮源對(duì)BC產(chǎn)量的影響

圖2　氮源種類(lèi)及質(zhì)量濃度對(duì)BC產(chǎn)量的影響Fig.2　Effect of nitrogen source type and mass concentration on the yield of BC

由圖2可知，發(fā)酵培養(yǎng)中分別加入牛肉膏、酵母膏、蛋白胨作為氮源時(shí)，隨著氮源質(zhì)量濃度的升高，BC產(chǎn)量呈先上升再下降的趨勢(shì)，其最大產(chǎn)量對(duì)應(yīng)氮源質(zhì)量濃度均為20.00 g/L。表明酒糟水解液中的蛋白質(zhì)不能滿(mǎn)足BC發(fā)酵所需氮源，需要外源添加氮源，最適添加量20.00 g/L。外源添加量繼續(xù)增加時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的質(zhì)量濃度過(guò)高，易引起菌體細(xì)胞生長(zhǎng)速率過(guò)快，不利于發(fā)酵過(guò)程由細(xì)胞生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)為產(chǎn)物生產(chǎn)期，從而降低BC產(chǎn)量。所添加3 種氮源中，蛋白胨作為氮源時(shí)，BC產(chǎn)量最高，可達(dá)4.75 g/L，表明蛋白胨為木醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)BC最佳氮源。因此選擇蛋白胨質(zhì)量濃度20.00 g/L為較佳參數(shù)。

2.1.3無(wú)機(jī)鹽對(duì)BC產(chǎn)量的影響

圖3　無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及質(zhì)量濃度對(duì)BC產(chǎn)量的影響Fig.3　Effect of inorganic salt type and mass concentration on the yield of BC

由圖3可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為3.50 g/L時(shí)，BC產(chǎn)量最高。根據(jù)Zeng Xiaobo［11］、Chen Lin［12］等的研究結(jié)果，發(fā)酵過(guò)程中，糖的利用引起的pH值降低會(huì)抑制BC的合成，因此培養(yǎng)基中添加具有pH值緩沖能力的基質(zhì)，能夠提高BC的產(chǎn)量。本試驗(yàn)中，微生物代謝檸檬酸鈉時(shí)生成堿性產(chǎn)物，能夠起到上述作用，試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致。圖3表明，培養(yǎng)基中MgSO4質(zhì)量濃度為1.00 g/L時(shí)，BC產(chǎn)量最高，這與Son等［13］的研究結(jié)果一致。Mg2+是微生物代謝過(guò)程中多種酶的輔基，如大部分核酸復(fù)制轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶均需Mg2+保證其催化活性，因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加合適質(zhì)量濃度的Mg2+，對(duì)BC的合成具有促進(jìn)作用。同時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中Na2HPO4的加入并沒(méi)有對(duì)BC的合成表現(xiàn)出促進(jìn)作用，BC產(chǎn)量反而有所降低，分析原因，可能是培養(yǎng)基中過(guò)量的磷酸鹽對(duì)糖代謝過(guò)程中戊糖磷酸途徑產(chǎn)生了抑制作用，從而抑制BC的合成。因此培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽選擇檸檬酸鈉和MgSO4進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.1.4PDE抑制劑對(duì)BC產(chǎn)量的影響

圖4　PDE酶抑制劑對(duì)BC產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of PDE inhibitors on the yield of BC

由圖4可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中黃嘌呤和咖啡因的加入對(duì)BC的合成具有明顯的促進(jìn)作用，添加黃嘌呤質(zhì)量濃度為1.10 g/L，咖啡因質(zhì)量濃度為0.90 g/L時(shí)，BC產(chǎn)量可分別提高17.7%、7.0%。BC生物合成過(guò)程如圖5所示，纖維素合成酶在環(huán)鳥(niǎo)苷酸（C-di-GMP）的激活下能夠保持較高活性，C-di-GMP又能被PDE水解為無(wú)活性的線(xiàn)狀鳥(niǎo)苷酸，因此理論上PDE抑制劑能夠促進(jìn)BC的合成。咖啡因、黃嘌呤和茶堿等可抑制PDE的活性［14］，使C-di-GMP在細(xì)胞內(nèi)保持較高水平，提高纖維素合成酶活性，從而提高BC的合成速率。試驗(yàn)結(jié)果與理論分析一致。同時(shí)結(jié)果表明，黃嘌呤對(duì)BC合成的促進(jìn)作用優(yōu)于咖啡因，因此培養(yǎng)基中PDE抑制劑選擇黃嘌呤進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖5　BC生化合成過(guò)程Fig.5　Biochemical synthesis process of BC

2.2響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)蔗糖、蛋白胨、檸檬酸鈉、MgSO4及黃嘌呤質(zhì)量濃度5 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。以這5 個(gè)因素為自變量，以BC產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table1　Box-Behnken experimental design and results

續(xù)表1

利用Design Expert 7.0軟件，以蔗糖、蛋白胨、檸檬酸鈉、MgSO4及黃嘌呤質(zhì)量濃度為響應(yīng)變量，以BC產(chǎn)量為響應(yīng)值對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到回歸模型方程為：Y=6.29-0.13A+0.052B-0.20C-0.15D-0.19E+0.11AB+0.086AC-3.75×10-3AD-0.015AE-0.036BC-0.015BD+0.54BE+0.18CD+0.24CE-0.033DE-1.07A2-1.12B2-0.64C2-0.91D2-1.23E2。

表2　回歸方程方差分析結(jié)果Table2　Analysis of variance for the developed regression equationTable2　Analysis of variance for the developed regression equation

回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P = 0.77＞0.05），表明回歸方程擬合程度良好；決定系數(shù)R2= 0.948 5，說(shuō)明因變量與考察的自變量之間的線(xiàn)性關(guān)系顯著；模型校正決定系數(shù)即該模型能解釋響應(yīng)值變化的90.72%，均說(shuō)明模型可信度較高。，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性良好；一次項(xiàng)A、D對(duì)BC產(chǎn)量影響是顯著的，C、E對(duì)BC產(chǎn)量影響是極顯著的，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、E2及交互相BE對(duì)BC產(chǎn)量影響是極顯著的，說(shuō)明各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系；由F值判斷，在選擇范圍內(nèi)，5 個(gè)因素對(duì)BC產(chǎn)量的影響順序?yàn)镃＞E＞D＞A＞B。綜上所述，使用該模型可以較好地對(duì)響應(yīng)值（BC產(chǎn)量）進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.2響應(yīng)面分析

利用Design Expert 7.0軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，蔗糖、蛋白胨、檸檬酸鈉、MgSO4及黃嘌呤質(zhì)量濃度之間交互作用對(duì)BC產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖6。

圖6　各交互因素對(duì)BC產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖Fig.6　Response surface plots showing the effects of medium components on the yield of BC

結(jié)合表2所示方差分析結(jié)果，由圖6響應(yīng)面曲線(xiàn)圖及等高線(xiàn)圖分析可知［15］：黃嘌呤與MgSO4、檸檬酸鈉與MgSO4、黃嘌呤與蛋白胨對(duì)BC產(chǎn)量影響的交互作用較強(qiáng)，蔗糖與蛋白胨、蔗糖與MgSO4對(duì)BC產(chǎn)量影響的交互作用較弱。同時(shí)，黃嘌呤、MgSO4、檸檬酸鈉對(duì)BC產(chǎn)量的影響比較顯著，曲線(xiàn)較陡；而蔗糖、蛋白胨對(duì)BC產(chǎn)量的影響相對(duì)較小，曲線(xiàn)較平緩，其數(shù)值的增加減少，對(duì)響應(yīng)值的變化影響較小。

2.2.3最佳發(fā)酵培養(yǎng)基

由Design Expert 7.0軟件求出回歸模型極值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：蔗糖質(zhì)量濃度39.33 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度20.01 g/L、MgSO4質(zhì)量濃度0.91 g/L、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度3.45 g/L、黃嘌呤質(zhì)量濃度1.02 g/L，此條件下，BC的理論產(chǎn)量為6.33 g/L。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，在最佳培養(yǎng)基條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。此條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，BC平均產(chǎn)量為（6.27±0.11） g/L，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明回歸方程能比較真實(shí)地模擬各因素對(duì)BC產(chǎn)量的影響，因此，使用該回歸模型優(yōu)化利用酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)BC的培養(yǎng)基是可行的。

2.3發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與性能

圖7　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）紅外圖譜Fig.7　FT-IR spectraof BC produced from basic culture medium （BC-DZ）and BC from culture medium containing vinasse hydrolysate （BC-YP）

圖8　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）XXRRDD圖譜Fig.8　XRD of BC produced from basic culture medium （BC-DZ） and BC from culture medium containing vinasse hydrolysate （BC-YP）

酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）與基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）紅外圖譜如圖7所示。吸收峰3 285、1 154、1 077、1 040 cm-1證實(shí)了樣品中大量—OH的存在；吸收峰2 925、1 383、1 313、667、645 cm-1證實(shí)了—CH2—、—CH和C—H的存在；吸收峰1 241 cm-1證實(shí)了環(huán)C—O—C的存在；吸收峰1 241、1 033 cm-1證實(shí)了直鏈C—O—C的存在［16-17］。以上結(jié)果顯示為細(xì)菌纖維素葡聚糖的特征吸收，可以推斷出兩種樣品的主要成分均為細(xì)菌纖維素。由圖7可知，BC-YP和BC-DZ紅外圖譜基本一致，說(shuō)明兩種樣品的化學(xué)組成非常相似，酒糟水解液作為發(fā)酵原料不影響B(tài)C的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）與基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）XRD圖譜如圖8所示，BC-YP和BC-DZ的X射線(xiàn)圖譜大致相同，且在相同位置處均含有主要衍射峰，分別在144.8°、16.8°和21.7°附近存在3 個(gè)衍射峰，此3 個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)纖維素晶體的＜101＞、＜101＞和＜002＞晶面［18］，據(jù)此可知BC-YP和BC-DZ為Ⅰ型纖維素。

兩種樣品的結(jié)晶度與晶體粒徑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BC-YP和BC-DZ的結(jié)晶度基本相同，分別為23.73%及23.95%，BC-YP粒徑為34 nm，BC-DZ粒徑為13 nm。結(jié)晶度與纖維的抗張強(qiáng)度、楊氏模量、硬度、伸長(zhǎng)率、吸濕性、潤(rùn)脹度、柔軟性等性質(zhì)有一定的關(guān)系［19-20］，說(shuō)明酒糟水解液作為發(fā)酵原料不影響B(tài)C結(jié)晶度。晶體粒徑與透明度、撕裂因子有關(guān)，酒糟水解液中含有纖維素未水解完全的多糖成分，部分多糖可在BC合成過(guò)程中結(jié)合到BC中，從而改變BC的晶體粒徑。

圖9　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YYPP）SEM圖譜Fig.9　SEM of BC produced from basic culture medium （BC-DZ） and BC from culture medium with vinasse hydrolysate （BC-YP）

酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）與基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）SEM圖譜如圖9所示，BC-YP和BC-DZ均由高密度納米級(jí)微纖維相互纏繞形成，具有三維網(wǎng)狀層狀結(jié)構(gòu)［21］。SEM表面和斷面圖譜顯示BC-YP的微纖絲之間有填充物存在。這可能是因?yàn)樵贐C合成過(guò)程中，酒糟水解液中的多糖成分能夠直接結(jié)合在BC的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，這與XRD的檢測(cè)結(jié)果一致。

3　結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)BC的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，建立了蔗糖、蛋白胨、MgSO4、檸檬酸鈉和黃嘌呤5 個(gè)因素對(duì)BC產(chǎn)量的二次回歸方程模型，經(jīng)檢驗(yàn)，模型準(zhǔn)確有效，可以用該模型分析預(yù)測(cè)各因素對(duì)BC產(chǎn)量的影響。由單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化模型確定利用酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)BC的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖39.33 g、蛋白胨20.01 g、MgSO40.91 g、檸檬酸鈉3.45 g、黃嘌呤1.02 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL、pH 6.0。在此條件下，得到BC產(chǎn)量為6.27 g/L，較優(yōu)化前（4.40 g/L）提高了42.5%。利用FT-IR、XRD、SEM對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物BC化學(xué)基團(tuán)、結(jié)晶性能、微觀(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，酒糟水解液發(fā)酵產(chǎn)物BC結(jié)構(gòu)性能與基本培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物BC基本一致，酒糟水解液能夠替代部分發(fā)酵原料發(fā)酵生產(chǎn)BC，且不影響B(tài)C性能。

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Optimization of Culture Medium Based on Vinasse Hydrolysate for Acetobacter xylinum by Response Surface Methodology for Enhanced Production of Bacterial Cellulose and Properties of the Product

ZHANG Wen， LIU Kang， LUO Feifei， ZHANG Minjuan， LI Yanjun
（College of Life Science and Engineering， Shaanxi University of Science and Technology， Xi'an 710021， China）

Response surface methodology was used to optimize the fermentation medium based on vinasse hydrolysate for enhanced production of bacterial cellulose （BC）. Meanwhile， the properties and structures of the BC were compared with those obtained with the basic culture medium. According t o the results of single factor experiments and response surface analysis， the optimal medium components were determined as follows： saccharose 39.33 g， peptone 20.01 g， magnesium sulfate 0.91 g， sodium citrate 3.45 g， xanthine 1.02 g， ethanol 10 mL， vinasse hydrolysate 1 000 mL and pH 6.0， yielding 6.27 g/L of BC， which was increased by 42.5% when compared with that before optimization （4.4 g/L）. The properties and structures of BC produced with vinasse hydrolysate were confirmed to be basically the same as those of BC produced with the basic medium through Fourier transform infrared （FT-IR） spectroscopy， X-ray diffraction （XRD） and scanning electron microscopy （SEM）， suggesting that vinasse hydrolysate could be used as an alternative raw material for the fermentation of BC without any influence on the properties of BC.

vinasse； bacterial cellulose； culture medium optimization； response surface methodology； property

TS201.1

A

1002-6630（2015）13-0160-07

10.7506/spkx1002-6630-201513030

2014-07-21

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（NJ2012-14）；陜西省2014年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（0913）

張?chǎng)?982—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樯镏扑帯-mail：zwen102@163.com