羊羔美酒大曲中乳酸菌多樣性及分子鑒定

李　艷，董振玲，李　佳，牟德華，*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018；3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800）

羊羔美酒大曲中乳酸菌多樣性及分子鑒定

李艷1，2，董振玲1，3，李佳1，牟德華1，*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018；3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800）

目的：分離和鑒定羊羔美酒大曲中的乳酸菌，探尋其菌群多樣性，為釀酒工藝條件改進提供參考。方法：將酒曲進行梯度稀釋、富集培養、平板畫線等分離純化，獲取乳酸菌單菌落。采用菌落特征和個體形態特征結合的方法進行乳酸菌形態鑒定。乳酸菌的分子鑒定采用重復序列聚合酶鏈式反應（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，Rep-PCR）技術和16S rDNA序列分析法。結果：從羊羔美酒大曲中共得到65 株乳酸菌，形態學分為9 類。用Rep-PCR技術在75%的相似性上將其區分為5 類，經基因序列分析，鑒定為分屬于4 個屬的乳酸菌，分別為：片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）。結論：傳統微生物分離技術與現代分子鑒定技術相結合，可快速準確鑒定出羊羔美酒大曲中乳酸菌的菌群組成和多樣性。

羊羔美酒大曲；乳酸菌；分子鑒定；重復序列聚合酶鏈式反應；16S rDNA序列分析

乳酸菌指利用可發酵性糖產生乳酸的一類革蘭氏陽性細菌的通稱。在分類學上，乳酸菌這個名稱是非正式、非規范的［1］。乳酸菌與中國傳統釀造業息息相關。黃酒發酵屬糖化和發酵并行的過程，以多品種、高密度酵母菌和乳酸菌協同發酵產生酒精、乳酸和多種風味物質［2］。乳酸菌對釀酒過程及最終產品的風味形成有突出貢獻，發酵初期產生乳酸，使發酵環境的pH值下降，可抑制有害菌繁殖；發酵中后期產生的乳酸可與酵母代謝產生的乙醇作用，形成乳酸乙酯以增強酒的濃醇感和酒香氣的柔和性［3］。酒曲是發酵的動力，酒曲微生物菌群的組成是釀酒的源泉，鑒定酒曲中的乳酸菌對酒曲應用和釀酒工藝改進極有意義。

目前，越來越多的分子生物學方法，如擴增片段長度多態技術、變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳、16S～23S rDNA間區、16S rDNA序列分析、重復序列聚合酶鏈式反應（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，Rep-PCR）技術等［4-10］已應用于乳酸菌的分類鑒定。其中Rep-PCR是采用特定引物對細菌基因組DNA的重復序列進行擴增，經電泳技術分離后分析其多態性。該技術可以在亞種和菌株水平上對菌種進行快速而準確的分類和鑒定，并且有操作簡便、重復性好、分辨率高等優勢。

羊羔美酒是一種北方特色肉釀型黃酒，河北省名酒，利用大曲為糖化劑、發酵劑和生香劑［11］。本實驗檢測羊羔酒大曲中的乳酸菌，可以探明羊羔美酒的發酵驅動力，從一個側面解密酒的風味特征，對進一步優化釀酒工藝，篩選有益于酒類釀造和形成特色風味的乳酸菌奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與培養基

羊羔美酒大曲由河北味道府酒業有限責任公司提供。

MRS固體培養基［12］（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉膏10.0、酵母浸粉5.0、檸檬酸氫二銨2.0、葡萄糖20.0、乙酸鈉2.0、K2HPO42.0、MgSO40.58、MnSO40.25、瓊脂18.0、CaCO310，吐溫-80 1.0 mL蒸餾水配制，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

MRS液體培養基：MRS固體培養基中不添加碳酸鈣、中性紅和瓊脂。

1.2試劑與儀器

引物：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，1495R：5'-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3'，（GTG）5：5'-GTG GTG GTG GTG GTG-3'，BOXAIR：5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GACG-3'；10×PCR Buffer、dNTP、rTaq酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

PCR儀、凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司；瓊脂糖水平板電泳儀 北京六一公司。

1.3方法

1.3.1酒曲中乳酸菌的分離

樣品處理：取成品羊羔美酒大曲，分別用無菌刀在酒曲外表面、中間和內部取樣各1.0 g，混合研磨成粉。取1 g加入100 mL無菌水，置于搖床上150 r/min搖30 min，靜止，取其上清液進行系列10 倍梯度稀釋［11-13］。選適宜稀釋梯度的稀釋液0.2 mL傾注法接種于3 個平行MRS培養基中，37 ℃恒溫培養48 h。對在MRS培養基上可以產生透明圈并長勢良好的菌落進行計數。再選取產生透明圈及在厭氧條件生長的菌落接種于液體MRS培養基（含20%甘油），-20 ℃條件下保藏。

乳酸菌的分離：分別選用大米、糯米、黍米為酒曲活化基質，進行大曲微生物的富集，30 ℃培養5 d。取培養基質1 g，加100 mL無菌水，打漿，取5 mL漿液進行系列10 倍梯度稀釋，選3 個合適的稀釋度0.2 mL進行3 個平行平板的涂布分離培養。

1.3.2乳酸菌的初步鑒定和形態聚類

將保存的菌株進行活化，接種于瓊脂培養基，劃線分離，上層傾注MRS培養基，37 ℃培養48 h，挑取單菌落連續純化2 次。將已純化的單菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫實驗，將革蘭氏陽性且過氧化氫實驗陰性的菌確定為乳酸菌［14］。將已確定為乳酸菌的菌株采用平板劃線法接種于MRS培養基，37 ℃培養5 d后根據其菌落形態及個體形態進行分類。

1.3.3乳酸菌的分子鑒定

1.3.3.1基因組DNA的提取

實驗菌株接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養48 h，獲得足夠量的菌體。取1.5 mL培養液12 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加20 mg/mL的溶菌酶50 μL，37 ℃處理1 h。向每管加入200 μL裂解緩沖液（4 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol/L乙酸鈉，1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）），混合均勻。加入10 μL蛋白酶K（10 mg/mL），55 ℃處理30 min，向每管加入66 μL飽和NaCl溶液，充分混合后，12 000 r/min離心10 min，除去蛋白質復合物及細胞壁等殘渣。取離心后上清液，加入等體積的Tris飽和酚，14 000 r/min離心5 min，取上清液，用等體積的氯仿異戊醇溶液抽提2 次，取上清液，用預冷1 倍體積的異丙醇沉淀DNA，15 000 r/min離心10 min，棄去上清液。用400 μL 70%的乙醇洗滌沉淀兩次。室溫干燥后，用50 μL無菌雙蒸水溶解DNA［15-17］。檢測DNA的純度與濃度，將DNA稀釋至質量濃度20～50 ng/μL，-20 ℃保存備用［18］。

1.3.3.2Rep-PCR分析

（GTG）5 PCR反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，（GTG）5（0.4 μmol/L）1 μL，模板DNA（20～50 ng）1 μL，Taq酶（0.5 U/L）0.2 μL，加滅菌雙蒸水補足 25 μL。PCR反應程序：預變性95 ℃ 7 min，94 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，35 個循環，最后65 ℃ 20 min［19-21］。

BOX AIR PCR反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，BOX AIR（0.4 μmol/L）1 μL，模板DNA（20～50 ng）1 μL，Taq酶（0.5 U/L）0.5 μL，加滅菌雙蒸水補足25 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性7 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，35 個循環；最后65 ℃ 16 min［22-25］。

PCR產物的檢測：吸取8 μL PCR產物，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，90 V電壓140 min，經過EB染色15 min后，利用凝膠成像系統成像［26］。

1.3.3.316S rDNA序列分析

擴增乳酸菌16S rDNA使用細菌通用引物27F與1495R。PCR反應體系：Buffer 10 μL，Taq酶0.4 μL，dNTP 1 μL，引物2 μL，DNA 2 μL，雙蒸水32.6 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個循環；72 ℃末端延伸10 min。將PCR產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段長度［27］。

將樣品菌株的16S rDNA PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司，委托其進行序列測定。

2　結果與分析

2.1乳酸菌的分離與形態聚類

表1　MRS培養基上（培養5 d）乳酸菌落的形態描述Table1　Morphological characteristics of lactic acid bacteria on MRS medium （incubation for 5 days）

從羊羔美酒大曲中共分離得到168 株可以產生透明圈的單菌株，對單菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫實驗后，將65 株過氧化氫實驗顯示陰性且革蘭氏陽性的菌株初步確定為乳酸菌，其中桿菌18 株（27.7%），球菌47 株（72.3%）。根據乳酸菌在MRS培養基上菌落形態和顯微鏡下細胞形態的不同進行聚類，可將桿菌分為3 類，其中形態2數量最多，共12 株，占乳桿菌數量的66.7%；球菌分為6 類，其中形態4與形態9數量較多，各有13 株和12 株，分別占乳球菌總數量的27.7%與25.5%，形態聚類結果見表1。因此，在羊羔美酒大曲中，優勢乳酸菌群為形態2的乳桿菌和形態4與9的乳球菌。

2.2Rep-PCR技術鑒定乳酸菌

為了選擇適合大曲中乳酸菌多樣性研究的引物，本研究選取了2 種在乳酸菌Rep-PCR技術報道中使用較多的引 物（GTG）5與BOXAIR。用這兩種引物對9 種形態的乳酸菌代表菌株進行基因擴增。由圖1可知，用（GTG）5和BOXAIR 分別作為引物的 PCR 產物電泳出現多條帶譜，其分子質量大小范圍在0.25～0.5 kb 之間，菌株之間的差異能夠明顯地被區分開來。從（GTG）5擴增結果可知，各菌株均有良好的多態性，擴增條帶數目均在9～15 條；而BOXA1R引物擴增結果并不是很理想，泳道5～10的條帶均少于8 條，圖譜多態性并不理想。因此，（GTG）5在這些乳酸菌基因組中的分布比BOXA1R更為多樣，且兩者的結果對菌株的分群有差異，暗示這兩種短重復序列在基因中的分布也不同［28］。

圖1　（ GTG）5（a）和BOXA1R（b）擴增條帶的比較Fig.1　Comparison of fingerprints obtained with （GTG） 5 （a） and BOXA1R （b）

以（GTG）5擴增圖譜進行多態性分析，使用NTSYSpc2.0軟件進行數據處理，采用平均連鎖法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）繪出聚類樹狀圖，并進行菌株的分群，結果見圖2。

圖2　采用平均連鎖法構建的Rep-PCR結果樹狀圖Fig.2　UPGMA dendrogram generated from Rep-PCR fingerprints

由圖2可知，在75%相似性上進行分群，（GTG）5可以將9 種不同類型的乳酸菌區分為5 個群，其中群Ⅱ是最大的一個群，包含了形態4、5、6、7共4 種形態；群Ⅲ包含形態2、3兩種形態；其余形態1、形態8、形態9分別屬于群Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ。使用Rep-PCR技術可以快速地將不同菌株在基因型上進行聚類分析。

2.316S rDNA序列分析法鑒定乳酸菌

為了進一步驗證Rep-PCR技術的可靠性，將實驗菌株進行16S rDNA測序，將所得序列結果登陸GenBank數據庫，進行BLAST（http： //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/ Blast. cgi）相似性比對，以相似度大于99%確定其屬種，測序結果見表2。

表2　乳酸菌16S rDNA序列分析結果Table2　16S rDNA sequence analysis of lactic acid bacteria

在GenBank核酸序列數據庫中下載相關菌株16S rDNA序列，與已測序菌株的序列放在一起，使用Clustal X軟件進行序列比對；利用MEGA4生物學軟件的Neighbor-Joining連接法構建系統發育樹，并進行1 000 次Bootstrap檢驗。構建的系統發育樹如圖3所示。

結合圖2與圖3進行分析可知，Rep-PCR結果樹狀圖與16S rDNA序列系統發育樹有較好的相關性。因此，（GTG）5-PCR指紋分析技術能夠反映出不同菌株的基因組間存在的差異，可以作為鑒別菌種的手段之一［26-28］。針對羊羔美酒大曲中大量乳酸菌的基因型差異性，在后續研究中，可以建立相關Rep-PCR指紋圖譜數據庫，結合16S rDNA序列測序技術，便可實時了解羊羔美酒發酵過程中優勢乳酸菌的演變規律，為發酵工藝優化與控制奠定基礎。本實驗為羊羔美酒大曲中乳酸菌的Rep-PCR指紋圖譜數據庫建立奠定了基礎。

圖3　基于16S rDNA序列和Neighbor-Joining法構建的系統發育樹Fig.3　Phylogenetic tree based on 5.8S-ITS region sequences and Neighbor-Jointing method

另外，從以上分子鑒定結果可以看出，羊羔美酒大曲中乳酸菌種類非常豐富，存在著乳桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和腸球菌屬，其中片球菌屬和乳桿菌屬所占比重較大。片球菌屬、腸球菌屬和明串珠菌屬都有糖化作用，也可分解蛋白質、產生乳酸、降低pH值。羊羔美酒大曲中豐富的球菌對保證其釀造過程順利進行起著至關重要的作用。乳桿菌在羊羔酒發酵過程中產生乳酸的同時也會產生不同類型的肽聚糖，而肽聚糖可以成為羊羔酒的風味成分之一。另外，乳酸桿菌也可以利用霉菌等微生物代謝生成的朊、胨和多肽類物質分解成氨基酸，推測這些乳酸桿菌與羊羔美酒獨特的香氣和富含的22 種氨基酸有著密切聯系。實驗為后續研究各種乳酸菌單菌株特性、優勢菌株的分析、及其在羊羔美酒發酵過程中的作用機制奠定了基礎，進而為改進釀酒工藝條件提供參考。

3　結 論

本實驗從羊羔美酒大曲中共分離乳酸菌65 株，形態區分為9 類，使用Rep-PCR技術將其區分為5 類，經16S rDNA基因序列分析，將其鑒定為分屬于片球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬4 個屬的乳酸菌。研究結果反映了羊羔美酒大曲中乳酸菌的多樣性，為優化這一我國北方特色地方名酒的釀造工藝、改進傳統的配料和研究產品的風味物質特征奠定了基礎。

［1］ 凌代文， 東秀珠. 乳酸菌的分類鑒定及實驗方法［M］. 北京： 中國輕工業出版社， 1999： 1-3.

［2］ 毛青鐘. 論黃酒發酵過程酵母和乳酸桿菌協同作用關系［J］. 山東食品發酵， 2006（1）： 29-31.

［3］ 汪建國. 淺談乳酸菌在黃酒生產中的作用［J］. 生產與技術， 2009，26（3）： 37-42.

［4］ 劇檸， 靳燁. DNA分子標記技術在乳酸菌多態性研究中的應用［J］.微生物學通報， 2008， 35（8）： 1297-1301.

［5］ 李海星， 曹郁生， 付琳琳. 用于乳酸菌鑒定的幾種分子生物學方法［J］.江西科學， 2004， 22（5）： 393-398.

［6］ RANTSIOU K， COMI G， COCOLIN L. The rpoB gene as a target for PCR-DGGE analysis to follow lactic acid bacterial population dynamics during food fermentations［J］. Food Microbiology， 2004，21（4）： 481-487.

［7］ MUYZER G， de WAAL E C， UITTERLINDEN A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rRNA［J］. Applied and Environmental Microbiology，1993， 59（3）： 695-700.

［8］ TILSALA-TIMISJ?RVI A， ALATOSSAVA T. Development of oligonucleotide primers from the 16S-23S rRNA intergenic sequences for identifying different dairy and probiotic lactic acid bacteria by PCR［J］. International Journal of Food Microbiology， 1997， 35（1）： 49-56.

［9］ BUSSE H J， DENNER E B M， LUBITZ W. Classification and identification of bacteria： current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics［J］. Journal of Biotechnology， 1996， 47（1）： 3-38.

［10］ TEMMERMAN R， HUYS G， SWINGS J. Identi?cation of lactic acid bacteria： culture-dependent and culture-independent methods［J］. Trends in Food Science & Technology， 2004， 15（7/8）： 348-359.

［11］ 李艷， 董振玲， 牟德華. 羊羔美酒大曲中酵母菌多樣性及分子鑒定［J］. 食品科學， 2014， 35（5）： 144-149. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201405029.

［12］ GEVERSA D， HUYS G， SWINGS J. Applicability of rep-PCR fingerprinting for identification of Lactobacillus species［J］. FEMS Microbiology Letters， 2001， 205： 31-36.

［13］ SCHEIRLINCK I， van der MEULEN R， van SCHOOR A， et al. In?uence of geographical origin and flour type on diversity of lactic acid bacteria in traditional belgian sourdoughs［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（19）： 6262-6269.

［14］ CAMU N， WINTER T D， VERBRUGGHE K， et al. Dynamics and biodiversity of populations of lactic acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneous heap fermentation of cocoa beans in ghana［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（6）：1809-1824.

［15］ LEFEBER T， GOBERT W， VRANCKEN G， et al. Dynamics and species diversity of communities of lactic acid bacteria and acetic acid bacteria during spontaneous cocoa bean fermentation in vessels［J］. Food Microbiology， 2011， 28（3）： 457-464.

［16］ AUDENAERT K， D'HAENE K， MESSENS K， et al. Diversity of lactic acid bacteria from modi?ed atmosphere packaged sliced cooked meat products at sell-by date assessed by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis［J］. Food Microbiology， 2010， 27（1）： 12-18.

［17］ SINGH A K， RAMESH A. Evaluation of a facile method of template DNA preparation for PCR-based detection and typing of lactic acid bacteria［J］. Food Microbiology， 2009， 26： 504-513.

［18］ 于潔， 孫志宏， 張家超， 等. 16S rDNA-RFLP技術鑒定西藏地區乳制品中的乳桿菌［J］. 食品與生物技術學報， 2009， 28（6）： 804-809.

［19］ HOORDE K V， LEUVEN I V， DIRINCK P， et al. Selection，application and monitoring of Lactobacillus paracasei strains as adjunct cultures in the production of Gouda-type cheeses［J］. International Journal of Food Microbiology， 2010， 144（2）： 226-235.

［20］ KESMEN Z， YETIMAN A E， GULLUCE A， et al. Combination of culture-dependent and culture-independent molecular methods for the determination of lactic microbiota in sucuk［J］. International Journal of Food Microbiology， 2012， 153： 428-435.

［21］ NIKOLIC M， TERZIC-VIDOJEVIC A， JOVCIC B， et al. Characterization of lactic acid bacteria isolated from Bukuljac， a homemade goat's milk cheese［J］. International Journal of Food Microbiology， 2008， 122： 162-170.

［22］ MOHAMMED M， El-AZIZ H A， OMRAN N， et al. Rep-PCR characterization and biochemical selection of lactic acid bacteria isolated from the Delta area of Egypt［J］. International Journal of Food Microbiology， 2009， 128（3）： 417-423.

［23］ 滿朝新， 遲濤， 胡博韜， 等. rep-PCR指紋圖譜技術在乳酸菌鑒定中的應用［J］. 中國乳品工業， 2010， 38（5）： 4-6.

［24］ KIM W， HONG Y P， YOO J H， et al. Genetic relationships of Bacillus anthracis and closely related species based on variable-number tandem repeat analysis and BOX-PCR genomic fingerprinting［J］. FEMS Microbiology Letters， 2001， 207（1）： 21-27.

［25］ TRAN K T M， MAY B K， SMOOKER P M， et al. Distribution and genetic diversity of lactic acid bacteria from traditional fermented sausage［J］. Food Research International， 2011， 44（1）： 338-344.

［26］ 朱鳳玲， 曲凌云， 洪旭光， 等. 兩株海洋細菌新種的分離及BOX-PCR鑒定［J］. 海洋環境科學， 2011， 30（5）： 622-625.

［27］ 馬燕， 倪永清， 盧士玲， 等. 新疆特色干酪中乳酸菌的分離鑒定［J］.中國釀造， 2011， 30（8）： 38-40.

［28］ 李俊， 徐玲玫， 樊蕙， 等. 用rep-PCR技術研究中國花生根瘤菌的多樣性［J］. 微生物學報， 1999， 39（4）： 297-303.

Diversity and Molecular Biological Identification of Lactic Acid Bacteria from Yanggaomeijiu Daqu， a Traditional Chinese Liquor Fermentation Starter

LI Yan1，2， DONG Zhenling1，3， LI Jia1， MOU Dehua1，*
（1. College of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018， China；2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province， Shijiazhuang 050018， China；3. Hebei Inatural Biological Technology Co. Ltd.， Shijiazhuang 050800， China）

Purpose： The aim of this work was to isolate and identify lactic acid bacteria （LAB） in Yanggaomeijiu Daqu，a fermentation starter for the production of Chinese liquor Yanggaomeijiu， and to explore the diversity of LAB in Yanggaomeijiu Daqu. Methods： Individual bacterial colonies of LAB from Yanggaomeijiu Daqu were obtained through isolation and purification steps including gradient dilution， enrichment， cultivation， and plate streaking. Morphological identification of LAB isolates was performed based on colony and individual morphological characteristics and further molecular identification was carried out by repetitive sequence-based polymerase chain reaction （Rep-PCR） and 16S rDNA sequence analysis. Res ults： A total of 65 LAB isolates were obtained from Yanggaomeijiu Daqu， which could be assigned into 9 different groups by conventional microbiological anal ysis， differentiated into five types by Rep-PCR at a 75% similarity， and belonged to 4 genera including Pediococcus，Leuconostoc， Lactobacillus and Enterococcus by gene sequencing. Conclusion： The diversity and composition of LAB in Yanggaomeijiu Daqu can be identified quickly and accurately by the combination of traditional microbial separation methods and modern molecular biological identification techniques.

Yanggaomeijiu； lactic acid bacteria； molecular biological identification； repetitive sequence-based polymerase chain reaction （Rep-PCR）； 16S rDNA sequence analysis

TS261.1

A

1002-6630（2015）13-0167-05

10.7506/spkx1002-6630-201513031

2014-09-19

河北省石家莊市科技支撐計劃課題（101171271A；10117901A）；河北省自然科學基金項目（C2011208028）

李艷（1958—），女，教授，本科，研究方向為飲料酒釀造、釀酒微生物。E-mail：lymdh5885@163.com

牟德華（1960—），男，教授，本科，研究方向為農產品加工。E-mail：dh_mou@163.com