牛肝谷氨酸脫氫酶的分離純化及部分酶學性質(zhì)

王　丹，傅　婷，萬　驥，唐云明*

（西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

牛肝谷氨酸脫氫酶的分離純化及部分酶學性質(zhì)

王丹，傅婷，萬驥，唐云明*

（西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

取新鮮牛肝，經(jīng)勻漿、緩沖液抽提、正丁醇脫脂、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Superdex-200凝膠過濾層析等方法純化，獲得 了電泳純的牛肝谷氨酸 脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）。經(jīng)過純化后的結(jié)果：GDH的酶比活力為306.0 6 U/mg，純化倍數(shù)為 93.60 倍，酶活回收率為 23.12%。GDH的分子質(zhì)量為380. 2 kD，亞基分子質(zhì)量約為61.7 kD。酶學性質(zhì)研究結(jié)果表明：GDH的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在溫度為30 ℃以下時較穩(wěn)定；最適反應(yīng)pH值為8.2，該酶對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的Km值為0.696 mmol/L。甲醇、乙醇、異丙醇、Cd2+、Co2+、 Ca2+、Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+對該酶具有抑制作用，低濃度Ba2+、Mg2+、K+、Li+與乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）對其具有一定的激活作用。

牛肝；谷氨酸脫氫酶；分離純化；酶學性質(zhì)

谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）以NAD（P）為輔酶，屬于線粒體酶，廣泛存在于動物、植物以及微生物體內(nèi)［1-2］，是生物體內(nèi)進行谷氨酸新陳代謝的關(guān)鍵酶之一［3］，主要催化α-酮戊二酸和谷氨酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，該酶以四聚體、六聚體的形式存在于生物體內(nèi)［4］，在生物化學分析、醫(yī)學藥物分析以及食品酶制劑中具有非常重要的應(yīng)用價值［5-7］。目前，有多種來源的GDH提取及分子結(jié)構(gòu)相關(guān)研究的詳細報道［8-12］，但國內(nèi)關(guān)于從牛肝中提純GDH的方法及酶學性質(zhì)的研究未見報道，且國內(nèi)所需GDH主要來源于國外生產(chǎn)，價格昂貴。因此，獲得來源較廣、成本較低廉的GDH在理論及實踐方面有十分重要的意義。牛肝是牛肉加工過程中總量十分豐富的副產(chǎn)品，價格較低且易取材，因此本實驗嘗試以牛肝為實驗材料，從中分離純化GDH并對部分酶學性質(zhì)進行了研究，旨在為GDH更深入研究、在國內(nèi)自主生產(chǎn)及應(yīng)用該酶提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

以健康新鮮的牛肝臟作為材料，購于重慶市北碚區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

DEAE-Sepharose、Superdex-200、凝膠過濾層析分子質(zhì)量標準品和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）標準品 美國GE Healthcare公司；丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；考馬斯亮藍R-250 美國Bio-Rad公司；牛血清白蛋白 美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1牛肝GDH粗酶液的制備

將新鮮牛肝去除結(jié)締組織后，稱取90 g，剪碎并用生理鹽水浸泡30 min，用雙蒸水清洗數(shù)次，按1∶3（m/V）的比例加入預冷的10 mmol/L pH 8.0的Tris緩沖液（內(nèi)含0.5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）），勻漿后，4 ℃冰箱中抽提2 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，收集上清液；按10%的比例加入預冷的正丁醇，置于4 ℃冰箱中抽提2 h后12 000 r/min離心30 min，棄正丁醇層，收集上清液即為粗酶液。

1.2.2硫酸銨分級沉淀

向粗酶液中加入干燥的硫酸銨粉末至25%飽和度，4 ℃冰箱中靜置2 h，12 000 r/min離心30 min，收集上清液，再向其中加入干燥的硫酸銨粉末至55%飽和度，4 ℃冰箱中靜置1 h，12 000 r/min離心30 min，收集沉淀；沉淀用10 mmol/L pH 8.0 的Tris緩沖液（內(nèi)含0.5 mmol/L EDTA）完全溶解，于4 ℃條件下透析24 h后6 000 r/min離心20 min，收集上清液即為初步純化的GDH酶液。

1.2.3DEAE-Sepharose離子交換層析

DEAE-Sepharose離子交換層析柱經(jīng)25 mmol/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）內(nèi)含0.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L β-巰基乙醇）平衡后，取10 mL初步純化后的GDH酶液上樣，用0～1 mol/L的NaCl（由25 mmol/L pH 8.0的PBS溶液配制而成，含0.5 mmol/L的EDTA，1 mmol/L的β-巰基乙醇）進行線性梯度洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集5 mL，紫外檢測波長為280 nm。測定各管GDH的酶活力和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的酶液。

1.2.4Superdex-200凝膠過濾層析

Superdex-200凝膠層析柱經(jīng)25 mmol/L pH 8.0的PBS溶液（內(nèi)含0.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L β-巰基乙醇）平衡后，取經(jīng)離子交換層析后活性較高的酶液上樣，每次5 mL，用25 mmol/L pH 8.0的PBS溶液（內(nèi)含0.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L β-巰基乙醇）進行洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集3 mL。測定各管GDH的酶活力和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的酶液，4 ℃冰箱中超純水透析24 h，冷凍干燥后，得到GDH純品，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5GDH純度鑒定及分子質(zhì)量測定

通過SDS-PAGE法對凝膠過濾層析后獲得的GDH進行純度鑒定，制備5%濃縮膠和12%分離膠，上樣量為10 μL，經(jīng)SDS-PAGE法和凝膠過濾層析分別測定其亞基分子質(zhì)量和全分子質(zhì)量［13］。

1.2.6GDH活力的測定

參照文獻［10］略有改進，測酶活力體系包含150 μL 0.1 mol/L的α-酮戊二酸，150 μL 1 mol/L（NH4）2SO4，20 μL 18 mmol/L的二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP），50 μL 10 mmol/L的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），2.53 mL 50 mmol/L的Tris緩沖液與100 μL的酶液，混勻后，于50 ℃條件下進行反應(yīng)。在340 nm波長處測定NADH 1 min內(nèi)吸光度的減少值。酶活力單位定義：25 ℃時，每分鐘氧化1 μmol NADH所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.2.7蛋白質(zhì)含量測定方法

采用紫外分光光度法和考馬斯亮藍染料（Bradford）法對蛋白質(zhì)含量進行測定［13］。

1.2.8牛肝GDH酶學性質(zhì)的研究

1.2.8.1最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

在不同溫度（25～70 ℃，梯度為5 ℃），pH 8.2條件下測定GDH的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他溫度下的相對酶活力，以確定其最適反應(yīng)溫度。將酶液分別置于不同溫度（20～60 ℃，梯度為10 ℃）下保溫不同的時間后，測定GDH的酶活力，以酶液不保溫時的酶活力為100%，計算不同溫度、時間下的相對酶活力，以研究該酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8.2最適pH值和pH值穩(wěn)定性

在不同pH 3～10條件下測定GDH的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他各pH值下的相對酶活力，以確定GDH的最適反應(yīng)pH值。將純化后的GDH酶液分別置于不同pH 3～10的緩沖液中靜置3 h后，測定GDH的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他各pH值條件下的相對酶活力，以研究該酶的pH值穩(wěn)定性。

1.2.8.3米氏常數(shù)（Km）的測定

配制不同濃度（0.1～1 mmol/L）的NADH，50 ℃、pH 8.2的條件下測定牛肝GDH的酶活力，采用雙倒數(shù)作圖（Lineweaver-Burk）法［14］，求出GDH的Km值。

1.2.8.4不同有機溶劑對GDH活性的影響

將不同體積分數(shù)（10%～50%）的甲醇、乙醇、異丙醇與GDH酶液等體積混合后，4 ℃冰箱中靜置30 min，測定酶活力，以酶液中不加有機溶劑時的相對酶活力為100%，計算GDH的相對酶活力。

1.2.8.5不同化合物對GDH活性的影響

將不同濃度（5～25 mmol/L）的抗壞血酸、EDTA、草酸、SDS、尿素酶液等體積混合后，4 ℃冰箱中靜置30 min，測定酶活力，以酶液中不加化合物時的酶活力為100%，計算GDH的相對酶活力。

1.2.8.6不同金屬離子對GDH活性的影響

將不同濃度（10～50 mmol/L）金屬離子與酶液等體積混合后，4 ℃冰箱中靜置30 min，測定酶活力，以酶液中不加金屬離子時的相對酶活力為100%，計算GDH的相對酶活力。

2　結(jié)果與分析

2.1牛肝GDH的分離純化

圖1　牛肝GDH的DEAE-Sepharose離子交換層析Fig.1　DEAE-Sepharose chromatography of GDH from bovine liver

圖2　牛肝GDH的Superdex-200凝膠過濾層析Fig.2　Superdex-200 chromatography of GDH from bovine liver

圖3　牛肝GDH的SDS-PAGE圖譜Fig.3　SDS-PAGE of GDH from bovine liver

牛肝GDH粗酶液經(jīng)DEAE-Sepharose層析后結(jié)果如圖1所示，可見酶活力峰主要集中在31～38 管；收集酶活力較高的各管酶液進行Superdex-200層析，洗脫圖譜如圖2所示，可見酶活力峰主要集中在30～35 管，收集較高酶活性峰的各管酶液；經(jīng)透析冷凍濃縮后的樣品，進行SDS-PAGE凝膠電泳后顯示為單一條帶，如圖3所示，表明GDH已達到電泳純；整個純化結(jié)果如表1所示，最終得到牛肝GDH純品的酶活回收率為23.12%，純化倍數(shù)為93.60 倍，酶比活力達到306.06 U/mg。

表1　牛肝GDH的純化結(jié)果Table1　Purification of GDH from bovine liver

2.2牛肝GDH的分子質(zhì)量

經(jīng)過SDS-PAGE法，測得GDH的亞基分子質(zhì)量約為為61.7 kD，經(jīng)過Superdex-200層析測得其全酶分子質(zhì)量約為380.2 kD，如圖4所示，由此可以推測牛肝GDH由6 個亞基組成。

圖4　Sephacryl-200凝膠過濾測定牛肝GDH分子質(zhì)量Fig.4　Estimation of molecular weight of GDH by Superdex-200 gel filtration chromatography

2.3牛肝GDH的部分酶學性質(zhì)

2.3.1最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

實驗結(jié)果表明：隨著溫度的升高，酶活力出現(xiàn)先增大后減小的趨勢，且在50 ℃時，酶活力達到最高，因此該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃（圖5），在45～55 ℃范圍內(nèi)，酶活力均保持在90%左右。酶的熱穩(wěn)定性（圖6），在20～40 ℃范圍內(nèi)，保溫1 h后酶活力均保持在較高水平（80%左右），超過1 h酶活力逐漸下降；溫度超過40 ℃后，酶活力急劇下降，1 h之內(nèi)完全喪失，主要原因是在較高溫度的作用下，引起酶蛋白分子內(nèi)部的基團間的相互作用發(fā)生變化，從而酶分子的天然構(gòu)象被破壞，導致其催化功能的急劇減小甚至完全喪失，由此可推斷，該酶不耐高溫，在40 ℃以下時較穩(wěn)定。

圖5　反應(yīng)溫度對牛肝GDH活力的影響Fig.5　Effect of temperature on the activity of GDH from bovine liver

圖6　牛肝GDH的熱穩(wěn)定性Fig.6　Thermal stability of GDH from bovine liver

2.3.2最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖7　pH值對牛肝GDH活力的影響Fig.7　Effect of pH on the activity of GDH from bovine liver

圖8　牛肝GDH的pH值穩(wěn)定性Fig.8　pH Stability of GDH from bovine liver

由圖7可知，該酶的最適pH值為8.2，在pH 7～9范圍內(nèi)，酶活力較高，當pH值小于6和大于10時，酶活力幾乎完全喪失，其主要原因是pH值會影響酶的活性基團和底物的解離狀態(tài)，同時過高或者過低的pH值也會影響酶分子活性中心的構(gòu)象，從而導致其催化效率的降低。由圖8可見，在pH 5～10范圍內(nèi)，放置3 h后，酶活力均保持在較高水平（70%以上），表明該酶具有較強的酸堿耐受性。

2.3.3牛肝GDH的米氏常數(shù)

采用Lineweaver-Burk法，在50 ℃、pH 8.2的條件下，以不同濃度的NADH為底物，結(jié)果顯示該酶的催化反應(yīng)與米氏動力學規(guī)律相符合，1/［S］與1/v呈線性關(guān)系，由圖9中直線方程得GDH的Km值為0.696 mmol/L，表明在酶的催化反應(yīng)過程中，酶與底物NADH之間具有較高的親和力。

圖9　雙倒數(shù)法測牛肝GDH的米氏常數(shù)Fig.9　Kmdetermination of GDH from bovine liver by Lineweaver-Burk plot

2.3.4不同有機溶劑對GDH活性的影響

圖10　不同有機溶劑對牛肝GDH活力的影響Fig.10　Effect of various organic solvents on the activity of GDH from bovine liver

由圖10可知，在3 種不同有機溶劑的作用下，酶活力均表現(xiàn)出被抑制的趨勢，特別是在甲醇的體積分數(shù)升高的過程中，酶活力急劇下降；當甲醇、乙醇和異丙醇的體積分數(shù)超過30%時，酶活力均出現(xiàn)驟降的趨勢且在體積分數(shù)達到50%時酶活力幾乎完全喪失，其主要原因是由于有機溶劑中水的含量對酶的催化功能具有顯著影響，因為水直接或者間接參與了酶天然構(gòu)象中氫鍵、靜電作用、范德華力等非共價鍵的相互作用，因此，隨著有機溶劑濃度的增加，酶進行催化反應(yīng)的必需水降低，導致其催化效率急劇減小甚至完全喪失。

2.3.5不同化合物對GDH活性的影響

圖11　不同化合物對牛肝GDH活力的影響Fig.11　Effects of different compounds on the activity of GDH from bovine liver

由圖11可知，EDTA對該酶活性表現(xiàn)出一定的激活作用，且隨著EDTA濃度的增加，激活作用越顯著，其主要原因是EDTA是一種金屬螯合劑，它能有效地防止高濃度的Mg2+和Ca2+等對該酶的抑制作用，從而增大酶活力；尿素和抗壞血酸對該酶活性具有較小的影響，當濃度達到25 mmol/L時，相對酶活力依然保持在70%左右；SDS對該酶的抑制作用最顯著，其原因是SDS破壞了酶蛋白分子中的氫鍵和疏水鍵，改變了該酶的空間構(gòu)象，從而使其變性失活。草酸對該酶的抑制作用較為明顯，當濃度達到20 mmol/L時，酶活力開始急劇下降，當濃度達到25 mmol/L時，活力完全喪失；SDS對該酶的抑制作用最為顯著，當其濃度達到10 mmol/L時，酶活力已完全喪失。

2.3.6不同金屬離子對GDH活性的影響

由圖12可知，在不同濃度的情況下，同一種金屬離子以及不同金屬離子對該酶均表現(xiàn)出不同的作用效果。Ba2+、Mg2+、K+、Li+低濃度時對該酶具有一定的激活作用，其原因主要是當?shù)蜐舛鹊慕饘匐x子加入后，會形成金屬離子，底物和酶蛋白的三元配合物的穩(wěn)定過渡態(tài)，降低反應(yīng)的活化能，從而加快酶促反應(yīng)的速度［15］。Cd2+、Co2+、Ca2+對該酶較為顯著的抑制作用；Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+對該酶的抑制作用非常強烈，當濃度達到20 mmol/L時，酶活性幾乎完全喪失，其主要原因是這些金屬離子的作用會影響酶的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)，主要影響酶活性中心的構(gòu)象，從而導致酶活力的降低甚至完全喪失［16］。

圖12　不同金屬離子對牛肝GDH活力的影響Fig.12　Effect of various metal ions on the activity of GDH from bovine liver

3　討 論

本實驗選取的材料為新鮮的牛肝，經(jīng)一系列的純化步驟從中分離純化得到了電泳純的GDH。在純化過程中與鴨肝GDH［9］相比較，該實驗步驟更簡便，且經(jīng)DEAESepharose離子交換層析純化后收集到的酶液活性較高，不需冷凍干燥可直接上Superdex-200凝膠過濾層析柱，減少實驗所需時間的同時也減少了酶活力的損失；與以牛肝細胞核為材料［17］的報道中，本實驗以DEAE-Sepharose離子交換層析替代其兩次均使用的Sephadex G-200凝膠層析步驟，從而更高效的減少了雜蛋白，提高了純化倍數(shù)；比較于谷氨酸棒桿菌S9114GDH［18］與牛腦GDH［19］的純化過程減少了層析次數(shù)，提高了純化效率，同時得到了電泳純的谷氨酸脫氫酶；與豬肝（75.5 倍）［8］、鴨肝（60.9 倍）［9］、豬腦（70.1 倍）［10］和牛肝細胞核（82、87.8 倍）［17，20］中的GDH相比，提高了純化倍數(shù)。

該酶的亞基分子質(zhì)量約為6 1.7 k D，與鴨肝（61.60 kD）［9］相接近，高于豬腦（56.04 kD）［10］亞基分子質(zhì)量；表明來源不相同的在GDH分子結(jié)構(gòu)具有物種特異性。該酶對NADH的Km值為0.096 mmol/L，相近于豬腦（0.084 mmol/L）［10］以及牛腦（0.12 mmol/L）［16］中GDH的Km值；高于鴨肝（53.19 μmol/L）［9］中的GDH，表明不同來源的GDH對底物的親和力具有一定的差異。

該酶的最適溫度為50 ℃，高于鴨肝（35 ℃）GDH［9］，低于豬腦（55 ℃）GDH［10］的最適溫度；但是該酶在此溫度下穩(wěn)定性較差，在保溫1 h內(nèi)，酶活力急劇下降；該酶的最適反應(yīng)pH值為8.2，與來源于豬腦中的GDH［10］一樣，低于來源于鴨肝（pH 10.0）中的GDH［9］，高于谷氨酸棒桿菌S9114（pH 7.5）［18］、類產(chǎn)堿假單胞菌（pH 8.0）［1］以及雙色蠟?zāi)ⅲ╬H 7.4）［21］中的GDH最適pH值，表明不同來源的GDH的最適pH值具有一定的差異。在pH 5～10范圍內(nèi)，放置3 h后，酶活力均保持在70%以上，表明該酶對酸堿環(huán)境的適應(yīng)力更強，具有較好的應(yīng)用價值。

Cd2+、Co2+、Ca2+對該酶具有較為顯著的抑制作用；Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+對該酶的抑制作用非常強烈，其原因可能是該酶的活性中心與金屬離子直接結(jié)合，從而對該酶活性產(chǎn)生強烈抑制作用［22］；Ba2+、Mg2+、K+、Li+對該酶活性的影響表現(xiàn)出兩重性［15］，這可能是由于低濃度時可以促進底物與該酶的活性部位結(jié)合，形成底物-酶-離子復合物，激活該酶的活性，隨著濃度的不斷增大，Ba2+、Mg2+、K+、Li+聚集從而改變該酶的帶電狀況，該酶的空間結(jié)構(gòu)被影響，導致酶活性下降［23］；其中Li+、Zn2+、Cu2+、Co2+的作用效果與鴨肝GDH［9］及豬腦GDH［10］一致。

目前，牛肝谷氨酸脫氫酶主要依賴于進口，價格昂貴，且在國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)對牛肝GDH的分離純化及其酶學性質(zhì)的相關(guān)研究。本實驗從新鮮牛肝中提取谷氨酸脫氫酶，流程簡易，純度較高，且成本較低，具有很強的可操作性。因此，對國內(nèi)牛肝GDH的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的參考價值。

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Isolation， Purification and Partial Characterization of Glutamate Dehydrogenase from Bovine Liver

WANG Dan， FU Ting， WAN Ji， TANG Yunming*
（Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region， Ministry of Education， Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center， School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Electro phoresis-purity glutamat e dehydrogenase （GDH） from bovine liver was obtained after homogenization，buffer solution extraction， n-butanol degreasing， ammonium sulfate fractional precipitation， DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration. After purification， the specific activity of GDH was 306.06 U/mg， with 93.60-fold purification； meanwhile， the recovery rate was 23.12%. The molecular weight of GDH was approximately 380.2 kD， in which the subunit molecular weight was roughly 61.7 kD. The results of enzymatic characterization illustrated that the optimal r eaction temperature for GDH was 50 ℃， and it was relatively stable at a temperature below 30 ℃. The optimal reaction was pH 8.2， and its Kmwas 0.696 mmol/L towards NADH. The enzyme activity of GDH was inhibited by methanol， ethanol， isopropanol a nd metal ions such as Cd2+， Co2+， Ca2+， Ag+， Pb2+， Zn2+， and Cu2+， but enhanced to some extent by low concentrations of Ba2+， Mg2+， K+， Li+and EDTA.

bovine liver； glutamate dehydrogenase； isolation and purification； enzymatic properties

Q946.5

A

1002-6630（2015）13-0178-06

10.7506/spkx1002-6630-201513033

2014-08-08

重慶市科委科技重點攻關(guān)項目（CSTC，2011AB1027）

王丹（1991—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：wdswu911@163.com

唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn