不同鹽質(zhì)量濃度四川泡菜腐敗前后微生物的分析比較研究

王　猛，蔣云露，楊建濤，常　偉，車(chē)振明，陳　功，饒　瑜，*

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.通威三文魚(yú)研究所，四川 都江堰 611800；3.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 溫江 611130）

不同鹽質(zhì)量濃度四川泡菜腐敗前后微生物的分析比較研究

王猛1，蔣云露1，楊建濤1，常偉2，車(chē)振明1，陳功3，饒瑜1，*

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.通威三文魚(yú)研究所，四川 都江堰 611800；3.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 溫江 611130）

研究不同鹽質(zhì)量濃度四川泡菜正常發(fā)酵后與發(fā)生腐敗后鹽鹵中微生物的數(shù)量、分布及變化。利用不同的選擇培養(yǎng)基對(duì)3 個(gè)鹽質(zhì)量濃度四川泡菜腐敗前后鹽鹵中的微生物進(jìn)行分離純化，得到168 株菌株，并經(jīng)16S rDNA和18S rDNA分子生物學(xué)鑒定其種屬。結(jié)果表明：在不同鹽質(zhì)量濃度泡菜正常發(fā)酵過(guò)程中，以植物乳桿菌和戊糖乳桿菌為主的乳酸菌主導(dǎo)了泡菜發(fā)酵過(guò)程。泡菜腐敗時(shí)，不同鹽質(zhì)量濃度泡菜中的腐敗微生物以芽孢桿菌和酵母為主，其中枯草芽孢桿菌和塔克斯假絲酵母在不同鹽質(zhì)量濃度泡菜腐敗時(shí)均占一定比例；40 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜鹽鹵以甲級(jí)營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母和熱帶念珠酵母為主，60 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜鹽鹵以短小芽孢桿菌、克魯維畢赤酵母和熱帶念珠酵母為主，80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜鹽鹵以奇異變形桿菌、解淀粉芽孢桿菌、白地霉、地衣芽孢桿菌、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母以及克魯維畢赤酵母為主。腐敗泡菜鹽鹵表層的膜璞由細(xì)菌和真菌共同形成，且鹽質(zhì)量濃度越低，細(xì)菌所占的比例越高。

四川泡菜；鹽質(zhì)量濃度；正常發(fā)酵；腐敗；優(yōu)勢(shì)菌群

泡菜是一類(lèi)以各種新鮮蔬菜為原料，在一定鹽濃度溶液中經(jīng)乳酸菌自然發(fā)酵得到的一種蔬菜制品。四川泡菜歷史悠久，以味道咸酸、口感脆生、色澤鮮亮、香味撲鼻而著稱，被稱為“川菜之骨”［1］，泡菜風(fēng)味獨(dú)特，不僅是佐餐佳品，而且還具有刺激食欲，改善腸道環(huán)境，促進(jìn)胃腸健康等功能，廣受消費(fèi)者喜愛(ài)［2-5］。但是在泡菜的制作過(guò)程中，由于泡菜原料未經(jīng)過(guò)滅菌處理，加之其微生物發(fā)酵的自發(fā)性，在泡菜正常發(fā)酵完成后鹽鹵中仍保留了大量微生物，在泡菜貯藏的過(guò)程中會(huì)繼續(xù)進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)酵，造成泡菜的過(guò)熟或腐敗。發(fā)酵或貯藏過(guò)程中條件控制不當(dāng)也會(huì)造成大腐敗微生物的繁殖引起產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。家庭自制泡菜因?yàn)闀r(shí)常加入新的蔬菜或添加白酒等方法，在一定程度上可以避免泡菜的過(guò)熟或腐敗問(wèn)題。而工業(yè)化泡菜生產(chǎn)中如何控制腐敗微生物的生長(zhǎng)，保證產(chǎn)品的品質(zhì)及安全，進(jìn)而推動(dòng)四川傳統(tǒng)泡菜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題［6］。研究四川泡菜的微生物區(qū)系，分離鑒定引起泡菜腐敗的微生物，將對(duì)泡菜腐敗控制起到一定指導(dǎo)作用。

本研究利用不同選擇培養(yǎng)基分離純化不同鹽質(zhì)量濃度四川泡菜正常發(fā)酵后與貯藏腐敗后的各種微生物，并進(jìn)行分子生物學(xué)菌種鑒定。對(duì)比泡菜正常發(fā)酵后與貯藏腐敗后的微生物變化，分析正常發(fā)酵的泡菜中存在的潛在腐敗微生物，探討不同鹽質(zhì)量濃度對(duì)腐敗微生物及腐敗現(xiàn)象的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

四川泡菜：原料為白蘿卜、胡蘿卜及空心菜。將原料洗干凈，晾干。白蘿卜、胡蘿卜切成片狀；空心菜切成條狀；將白蘿卜、胡蘿卜與白菜混在一起裝入1.7 L土陶壇子，將壇子中的蔬菜壓實(shí)，裝到土陶壇子總體積的2/3刻度處，白蘿卜、胡蘿卜與白菜的質(zhì)量比為6∶2∶2。之后在壇子中加入鹽質(zhì)量濃度分別為40、60、80 g/L的冷開(kāi)水，加到土陶壇子總體積的4/5刻度處，料液比大概在2∶1。液封防止空氣進(jìn)去壇子中，置于室溫發(fā)酵。每個(gè)鹽質(zhì)量濃度平行2 組實(shí)驗(yàn)。

1.2儀器與設(shè)備

臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀 北京六一儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1泡菜理化指標(biāo)的測(cè)定

泡菜中亞硝酸鹽是參照GB 5009.33—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定方法》進(jìn)行測(cè)定，氨基態(tài)氮是參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2微生物計(jì)數(shù)

參照GB 4789.2—2010 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》的方法制備樣品稀釋液，選取適當(dāng)?shù)南♂尪韧坎加谂囵B(yǎng)基。NA瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)；MRS瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌的篩選，培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為35 μg/mL的放線菌酮；VRBA瓊脂培養(yǎng)基用于分離大腸菌群；虎紅瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌和酵母菌的分離和計(jì)數(shù)。NA、VRBA瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，MRS、虎紅瓊脂培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng)先培養(yǎng)24～48 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.3不同微生物的分離鑒定

從培養(yǎng)基上挑選不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，使用細(xì)菌或真菌DNA提取試劑盒提取總DNA，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果。以提取的總DNA為模板，細(xì)菌以Eu27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，于95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min條件下進(jìn)行擴(kuò)增16S rDNA全長(zhǎng)片段。真菌以NS1（5'-GCATATCAATAAGC GGAGGAAAAG-3'）和NS4（5'-GGTCCGTGTTTC AAGACGG-3'）為引物，于94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，40 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min條件下進(jìn)行擴(kuò)增18S rDNA部分片段。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，送上海華津生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性分析，并通過(guò)Clustal X軟件多重比對(duì)后用MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同鹽質(zhì)量濃度四川泡菜發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)及微生物變化

如圖1所示，發(fā)酵至第12天時(shí)，40、60、80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜pH值都降至4.0甚至4.0以下，一般認(rèn)為，pH≤4.0時(shí)，泡菜正常發(fā)酵完成［7］。在此發(fā)酵過(guò)程中，40、60、80 g/L這3 種鹽質(zhì)量濃度泡菜鹽鹵中的氨基態(tài)氮、亞硝酸鹽的變化情況與余文華［8］、楊瑞［9］等研究一致，氨基態(tài)氮含量提高了約2 g/100 g，亞硝酸鹽含量在發(fā)酵的第4～5天時(shí)達(dá)到最大值，在第12天時(shí)已下降到初始狀態(tài)。圖2所示為12 d發(fā)酵過(guò)程中，不同鹽質(zhì)量濃度泡菜鹽鹵中不同微生物的生長(zhǎng)變化情況。可以看出，不同鹽質(zhì)量濃度對(duì)四川泡菜的微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生一定影響。四川泡菜的發(fā)酵主要是乳酸菌的發(fā)酵過(guò)程，也是引起泡菜pH值降低的主要原因。40、60、80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜中的乳酸菌數(shù)量分別在第10、9、10天達(dá)到了最大值5.8×106、6.8×106、6.7×106CFU/mL，而60 g/L鹽更適于乳酸菌的生長(zhǎng)（圖2B），這與Suzanne等［10］的研究一致。真菌和大腸菌群在該過(guò)程中也有一定生長(zhǎng)，在發(fā)酵第12天時(shí)，3 種鹽質(zhì)量濃度泡菜的真菌總數(shù)都達(dá)到了104CFU/mL，但不同鹽質(zhì)量濃度中真菌生長(zhǎng)速率有一定差異（圖2D）。大腸菌群在正常發(fā)酵后期達(dá)到了104CFU/mL，鹽質(zhì)量濃度越高，生長(zhǎng)速率越快（圖2C）。梭菌在該期間數(shù)量很少并無(wú)明顯變化（結(jié)果未顯示）。

圖1　不同鹽質(zhì)量濃度泡菜中理化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化Fig.1　Dynamic changes of physical and chemical indicators in pickles with different salt concentrations

圖2　不同鹽質(zhì)量濃度四川泡菜發(fā)酵過(guò)程中不同微生物的生長(zhǎng)變化Fig.2　Growth curves of different microorganisms in Sichuan pickles with different salt concentrations

2.2不同鹽質(zhì)量濃度四川泡菜腐敗后理化及微生物指標(biāo)

當(dāng)泡菜表面出現(xiàn)白色膜璞［11-13］，鹽鹵出現(xiàn)混濁時(shí)，認(rèn)為泡菜已發(fā)生腐敗。40、60、80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜分別于第35、47、37天出現(xiàn)腐敗，在鹽鹵表面出現(xiàn)白色生物膜。40 g/L和80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜鹵水較60 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜混濁，已不具有泡菜特有香味，有一定惡臭氣味［7］。泡菜腐敗后理化以及微生物指標(biāo)如表1、2所示。

表1　不同鹽質(zhì)量濃度泡菜正常發(fā)酵與腐敗后理化指標(biāo)Table1　Comparison of physical and chemical indicators in pickles with different salt concentrations before and after spoilage

表2　不同鹽質(zhì)量濃度泡菜正常發(fā)酵與腐敗后的微生物數(shù)量Table2　Comparison of microbiological indicators in pickles with different salt concentrations before and after spoilage CFU/mL

由表1可知，泡菜腐敗時(shí)，鹽鹵的pH值會(huì)有所升高，其中80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜的pH值變化最大，在腐敗時(shí)（第37天）pH值已升至6.17。如表2所示，在泡菜發(fā)酵腐敗后，40、60、80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜中微生物數(shù)量均變化顯著，總數(shù)下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，乳酸菌數(shù)量均下降了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。其中以80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜中乳酸菌數(shù)量下降最為明顯，由發(fā)酵第12天的6.1×106CFU/mL下降至2.2×104CFU/mL。40、60、80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜中真菌的數(shù)量有一定波動(dòng)，40 g/L和80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜在腐敗后真菌數(shù)量分別增加了0.5×104CFU/mL和1.5×104CFU/mL，而60 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜腐敗后真菌數(shù)量下降了1.7× 104CFU/mL。大腸菌群的數(shù)量在不同鹽質(zhì)量濃度泡菜腐敗后均提高了3～4倍，其中40 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜腐敗后（第35天）大腸菌群的數(shù)量達(dá)到了9.2×104CFU/mL，為3 個(gè)鹽質(zhì)量濃度泡菜腐敗后大腸菌群數(shù)量中最高。

一般認(rèn)為，在泡菜發(fā)酵后期，由于pH值降至4.0左右，乳酸菌的生長(zhǎng)在該pH值條件下會(huì)受到抑制［14-17］，在圖2B中可看出乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵第9～12天時(shí)已有所下降，并在泡菜貯藏 的過(guò)程中一直受到抑制并出現(xiàn)數(shù)量大幅降低（表2）。泡菜發(fā)酵后，基質(zhì)中殘存的糖將被以酵母為主的真菌所利用，也可能利用由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、醋酸等有機(jī)酸引起基質(zhì)pH值的上升［18-19］。本實(shí)驗(yàn)中，真菌在泡菜發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)（圖2D），在貯藏過(guò)程中數(shù)量也有一定增加（表3），但60 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜中真菌數(shù)量有小幅度下降。Franco等［18］報(bào)道在酸黃瓜的腐敗過(guò)程中，大腸菌群也是重要的腐敗菌之一，腐敗真菌生長(zhǎng)引起的pH值上升和基質(zhì)的還原為大腸菌群的生長(zhǎng)提供了條件。本實(shí)驗(yàn)中，泡菜發(fā)酵后期（第9～12天）低pH值條件下，大腸菌群受到抑制，數(shù)量有所下降，但在貯藏過(guò)程中卻大量生長(zhǎng)，腐敗后泡菜中大腸菌群的數(shù)量已超過(guò)了乳酸菌和真菌，這應(yīng)該與真菌在腐敗過(guò)程中改變泡菜基質(zhì)條件有關(guān)。

pH值主要是來(lái)自原料在發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌代謝乳酸和在腐敗后腐敗微生物消耗有機(jī)酸。氨基態(tài)氮主要來(lái)自于原料中蛋白質(zhì)的水解和微生物的自溶［20］。在泡菜腐敗過(guò)程中，pH值的升高的原因是腐敗微生物利用泡菜中的乳酸、醋酸等有機(jī)酸以及殘?zhí)莵?lái)代謝生長(zhǎng)［18-19］。在本實(shí)驗(yàn)中，40 g/L和80 g/L鹽質(zhì)量濃度的泡菜腐敗微生物生長(zhǎng)較厲害，有機(jī)酸被大量利用，造成pH值上升，所以在腐敗后40 g/L和80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜的pH值較60 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜要高。在泡菜腐敗的過(guò)程，氨基態(tài)氮的變化是原料中蛋白的水解和微生物的自溶。40 g/L和80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜中的腐敗微生物的大量快速生長(zhǎng)，造成氨基態(tài)氮的破壞，所以氨基態(tài)氮的含量減少。

2.3四川泡菜正常發(fā)酵后與腐敗后腐敗細(xì)菌的分離與比較

表3　不同鹽質(zhì)量濃度泡菜正常發(fā)酵與腐敗后優(yōu)勢(shì)微生物的挑選Table3　Dominant microorganisms in normal and spoiled pickles with different salt concentrations

將3 種鹽質(zhì)量濃度泡菜在發(fā)酵第12天和泡菜腐敗后，分別取樣稀釋并涂布于NA、MRS、VRBA、虎紅4 種瓊脂培養(yǎng)基上并培養(yǎng)，分離培養(yǎng)數(shù)量較多的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，菌株挑選數(shù)量與分布如表3所示，共挑選菌株168 株。圖3、4分別為部分菌株的基因組和16S rDNA/18S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3　部分真菌（A）、細(xì)菌（B、C）基因組瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3　Agarose gel electrophoresis of genomic DNAs from fungi （A） and bacteria （B， C）

圖4　部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增18S rDNA（A）、16S rDNA（B）瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4　Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified products from 18S rDNA （A） and 16S rDNA （B）

PCR擴(kuò)增的16S rDNA或18S rDNA片段經(jīng)測(cè)序并BLAST分析及多重比對(duì)后，構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。Devereux等［21］認(rèn)為當(dāng)16S rDNA的序列同源性≥97%時(shí)可以認(rèn)為是一個(gè)屬，同源性≥98%時(shí)則可以認(rèn)為是同一個(gè)種。進(jìn)行鑒定的168 株菌株分別屬于16 個(gè)菌種，包括11 種細(xì)菌，分別是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，21 株）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，6 株）、甲級(jí)營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus，4 株）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus，5 株）、蘇金云芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，5 株）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens，7 株）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus，4 株）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，5 株）、路德腸桿菌（Enterobacter ludwigii，15 株）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae，19 株）和奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，7 株）；5 種真菌，分別是庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii，16 株）、白地霉（Galactomyces geotrichum，17 株）、塔克斯假絲酵母（Candida tanzawaensis，13 株）、熱帶念珠酵母（Candida tropicalis，10 株）和克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri var. cephalocereana，14 株）。這些微生物在不同鹽質(zhì)量濃度泡菜正常發(fā)酵第12天和腐敗后樣品中的分布如圖5、6所示。

圖5　基于16S rDNA構(gòu)建的發(fā)酵第12天與腐敗后不同鹽質(zhì)量濃度泡菜鹵水中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5　Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strains from 12-day fermented and spoiled pickle brines with different salt concentrations

由圖5可知，發(fā)酵后（第12天）的不同鹽質(zhì)量濃度泡菜中微生物以乳酸菌為主，主要為植物乳桿菌和戊糖乳桿菌，共占微生物總數(shù)的48%左右，這與Yan Pingmei等［22-24］的研究一致。中國(guó)泡菜發(fā)酵過(guò)程中的主要微生物包括植物乳桿菌（43.6%）、戊糖乳桿菌（19.1%）、短乳桿菌（11.0%）和腸系膜明串珠球菌（7.3%）等乳酸菌。在泡菜發(fā)生腐敗后，不同鹽質(zhì)量濃度泡菜中乳酸菌數(shù)量下降明顯，由發(fā)酵第12天的106CFU/mL下降至104CFU/mL。

由圖5可知，在泡菜發(fā)酵（第12天）和泡菜腐敗后，泡菜鹽鹵中均篩選出枯草芽孢桿菌，數(shù)量級(jí)基本都在105CFU/mL，說(shuō)明不同鹽質(zhì)量濃度的泡菜在發(fā)酵前（第12天）和腐敗后枯草芽孢桿菌的數(shù)量差別不大。在發(fā)酵后第12天的泡菜鹽鹵中，大腸菌群以路德腸桿菌、陰溝腸桿菌為主，但泡菜腐敗后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這兩株菌株。雖然表2中，泡菜腐敗后樣品在VRBA上生長(zhǎng)的微生物數(shù)量達(dá)到104CFU/mL，但卻不是大腸菌群而主要是枯草芽孢桿菌。

地衣芽孢桿菌、甲級(jí)營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蘇金云芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、路德腸桿菌、陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌在腐敗泡菜中出現(xiàn)，這應(yīng)該是隨著pH值的升高，低pH值對(duì)腐敗菌抑制解除的結(jié)果。例如Franco等［18］在對(duì)黃瓜的二次發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，隨著酸黃瓜pH值的升高，陰溝腸桿菌等腐敗微生物逐漸富集。

圖6　部分基于18S rDNA構(gòu)建的發(fā)酵第12天與腐敗后不同鹽質(zhì)量濃度泡菜鹵水中真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6　Phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences of 12-day fermented and spoiled pickle brines with different salt concentrations

由圖6可知，發(fā)酵后（第12天）的泡菜鹽鹵真菌以庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母、白地霉、塔克斯假絲酵母、熱帶念珠酵母和克魯 維畢赤酵母為主。泡菜腐敗時(shí)5 株真菌的數(shù)量有所增加，數(shù)量是發(fā)酵后（第12天）的1～3 倍。泡菜腐敗時(shí)，40 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜鹽鹵以庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母、塔克斯假絲酵母和熱帶念珠酵母為主，60 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜鹽鹵以克魯維畢赤酵母、熱帶念珠酵母以及塔克斯假絲酵母為主，80 g/L鹽質(zhì)量濃度泡菜鹽鹵以庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母、白地霉、塔克斯假絲酵母以及克魯維畢赤酵母為主。有文獻(xiàn)報(bào)道這5 株真菌均為腐敗菌［7，11，25］。

圖7　不同鹽質(zhì)量濃度泡菜樣品中細(xì)菌及真菌的分布Fig.7　Bacterial and fungal distribution in pickle brines with different salt concentrations

一般認(rèn)為，腐敗泡菜表面形成的膜醭（俗稱生花）主要由真菌組成［3，7］，但本實(shí)驗(yàn)中，泡菜腐敗時(shí)鹽鹵所形成生物膜是由真菌和細(xì)菌共同組成（圖7），且鹽質(zhì)量濃度越低，膜醭中細(xì)菌所占微生物總數(shù)的比例越高（圖7A）。

3　結(jié) 論

在不同鹽質(zhì)量濃度四川泡菜的正常發(fā)酵過(guò)程中，以植物乳桿菌和戊糖乳桿菌為主要優(yōu)勢(shì)菌群。當(dāng)泡菜發(fā)生腐敗后，不同鹽質(zhì)量濃度泡菜中的腐敗微生物都以芽孢桿菌和酵母為主，但不同鹽質(zhì)量濃度腐敗泡菜鹽鹵中芽孢桿菌和酵母種類(lèi)有所差異；腐敗泡菜鹽鹵表層的膜醭是由細(xì)菌和真菌共同形成的。該研究結(jié)果為四川泡菜的腐敗防控提供了理論參考。

［1］ 田偉， 張琦， 鄧珍珍， 等. 利用16S rRNA分析傳統(tǒng)四川發(fā)酵泡菜中的細(xì)菌多樣性［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（17）： 215-218. doi： 10.7506/ spkx1002-6630-201317046.

［2］ 林燕文， 黃君紅， 黃建杏， 等. 泡菜營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品的研制初探［J］. 食品科技， 2001， 26（2）： 28-29.

［3］ 羅冬英， 尹傳武. 乳酸菌制劑對(duì)人體保健功效的機(jī)理探討［J］. 鄂州大學(xué)學(xué)報(bào)， 2002（4）： 53-54.

［4］ CHOI S M， JEON Y S， RHEE S H， et al. Red pepper powder and kimichi reduce body weight and blood and tissue lipids in rats fed a high fat diet［J］. Nutraceuticals and Food， 2002， 7（2）： 162-167.

［5］ 蔣和體， 盧新軍. 泡菜對(duì)大鼠血脂的調(diào)節(jié)作用研究［J］. 食品科學(xué)，2008， 29（1）： 314-316.

［6］ 鐘少樞， 吳克剛， 柴向華， 等. 七種單離食用香料對(duì)食品腐敗菌抑菌活性的研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2009， 30（5）： 68-71.

［7］ 饒瑜， 常偉， 龔麗， 等. 四川泡菜生花酵母的分離與鑒定［J］. 食品與發(fā)酵科技， 2013， 49（3）： 19-22.

［8］ 余文華， 張蜀艷， 陳功， 等. 直投式功能菌對(duì)青菜鹽漬發(fā)酵過(guò)程中各指標(biāo)變化研究［J］. 食品與發(fā)酵科技， 2011， 47（6）： 22-25.

［9］ 楊瑞， 張偉， 徐小會(huì). 泡菜發(fā)酵過(guò)程中主要化學(xué)成分變化規(guī)律的研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2005， 26（2）： 95-98.

［10］ SUZANNE D J， FRANCO W， PEREZ-DIAZ I M， et al. Influence of Sodium chloride， pH， and lactic acid bacteria on anaerobic lactic acid utilization during fermented cucumber spoilage［J］. Food Microbiology，2012， 77（7）： 394-404.

［11］ 敖曉琳， 蔡義民， 夏姣， 等. 引起泡菜“生花”腐敗微生物的分離鑒定［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（21）： 95-98. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201321042.

［12］ 鄯晉曉. 四川泡菜菌系分離、篩選及發(fā)酵劑的研究［D］. 重慶： 西南大學(xué)， 2008： 5-9.

［13］ 何玲， 李勤振. 漿水芹菜發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群的分離、鑒定及變化［J］.食品科技， 2010， 35（5）： 36-40.

［14］ FRANCO W， PEREZ-DIAZ I M， JOHANNINGSMEIER S， et al. Characteristics of spoilage-associated secondary cucumber fermentation［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2013，78（4）： 1273-1284.

［15］ XIONG Tao， GUAN Qiangqian， SONG Suhua， et al. Dynamic changes of lactic acid bacteria flora during Chinese sauerkraut fermentation［J］. Food Control， 2012， 26（1）： 178-181.

［16］ PLENGVIDHYA V， BREIDT F， LU Zhongjing， et al. DNA fingerprinting of lactic acid bacteria in sauerkraut fermentations［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（23）： 7697-7702.

［17］ YU Jie， GAO Wa， SUN Zhihong， et al. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated from traditional pickles in Sichuan， China［J］. Journal of General and Applied Microbiology，2012， 58（3）： 163-172.

［18］ FRANCO W， PEREZ-DIAZ I M. Role of selected oxidative yeasts and bacteria in cucumber secondary fermentation associated with spoilage of the fermented fruit［J］. Food Microbiology， 2012， 32（2）： 338-344.

［19］ FRANCO W， PEREZ-DIAZ I M. Development of a model system for the study of spoilage associated secondary cucumber fermentation during long-term storage［J］. Journal of Food Science， 2012， 77（10）：586-592.

［20］ 李由. 提高郫縣豆瓣氨基碳氮含量關(guān)鍵技術(shù)的研究［D］. 成都： 西華大學(xué)， 2010： 3-4.

［21］ DEVEREUX R， HE S H， DOYLE C L， et al. Diversity and origin of Desulfovibrio species： phylogenetic definition of a family［J］. Journal of Bacteriology， 1990， 172（7）： 3609-3619.

［22］ YAN Pingmei， XUE Wentong， TAN S S， et al. Effect of inoculating lactic acid bacteria starter cultures on the nitrite concentration of fermenting Chinese paocai［J］. Food Control， 2008， 19（1）： 50-55.

［23］ OH C K， OH M C， KIM S H. The depletion of sodium nitrite by lactic acid bacteria isolated from kimchi［J］. Journal of Medicinal Food，2004， 7（1）： 38-44.

［24］ OH M C， OH C K， KIM S H. Depletion of nitrite by lactic acid bacteria isolated from commercial kimchi［J］. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition， 2009， 38（7）： 892-901.

［25］ MOON S H， CHANG Mi， KIM H Y. Pichia kudriavzevii is the major yeast involved in film-formation， off-odor production， and texturesoftening in over-ripened kimchi［J］. Food Science and Biotechnology，2014， 23（2）： 489-497.

Comparative Analysis of Microflora Profile in Spoilage Sichuan Pickles with Different Salt Concentrations before and after Spoilage

WANG Meng1， JIANG Yunlu1， YANG Jiantao1， CHANG Wei2， CHE Zhenming1， CHEN Gong3， RAO Yu1，*
（1. College of Bioengineering， Xihua University， Chengdu 610039， China； 2. Institute of Salmon， Tongwei Group Co. Ltd.，Dujiangyan 611800， China； 3. Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries， Wenjiang 611130， China）

The microbial population， diversity and dynamics of Sichuan pickles with different salt concentrations were assessed. Using different selective media， 168 microbes were isolated from pickle brines with three different salt concentrations and identified by 16S rDNA or 18S rDNA analysis. The results showed the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum and Lactobacillus pentosus dominated the normal process of Sichuan pickle fermentation. When Sichuan pickle was deteriorated， Bacillus and yeast especially Bacillus subtilis and Candida tanzawaensis were the dominant flora in the pickle samples. Furthermore， Bacillus methylotrophicus， Bacillus licheniformis， Pichia kudriavzevii and Candida tropicalis were isolated from pickle brine with 40 g/L salt. Bacillus pumilus， Pichia kluyveri var. cephalocereana and Candida tropicalis were the most abundant isolates from pickle brine with 60 g/L salt. The major representatives of spoilage-causing microbes involved in pickle brine with 80 g/L salt were Proteus mirabilis， Bacillus amyloliquefaciens， Galactomyces geotrichum， Bacillus licheniformis， Pichia kudriavzevii and Pichia kluyveri var. cephalocereana. The biofilms formed on the surface of spoiled pickle brines consisted of bacteria and fungi. When the salt concentration was higher in the pickle brine，the more proportion of bacteria existed in the biofilm.

Sichuan pickles； salt concentration； normal fermentation； spoilage； dominant flora

TS201.3

A

1002-6630（2015）13-0184-06

10.7506/spkx1002-6630-201513034

2014-09-15

四川省教育廳科研重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZA0026）；西華大學(xué)開(kāi)放基金項(xiàng)目（szjj2013-047）；西華大學(xué)“西華杯”大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2014134）；西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（ycjj2014105）

王猛（1988—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称饭こ獭-mail：164651862@qq.com

饒瑜（1982—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：ryfish@163.com