米粉及食鹽添加量對發酵酸肉蛋白質降解及γ-氨基丁酸形成的影響

李成龍，袁　軍，劉淑貞，周才瓊*

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 40071 5）

米粉及食鹽添加量對發酵酸肉蛋白質降解及γ-氨基丁酸形成的影響

李成龍，袁軍，劉淑貞，周才瓊*

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 40071 5）

以新鮮豬瘦肉為原料，研究米粉及食鹽添加量對發酵60 d成品酸肉蛋白質降解及γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）含量的影響，并利用響應面法對酸肉發酵工藝條件進行優化以獲取高GABA含量的酸肉。結果表明：米粉和食鹽添加量可影響蛋白質降解及GABA的形成，制備高GABA含量酸肉的最佳發酵工藝條件為米粉添加量12.73%、食鹽添加量4.74%、發酵溫度16.50 ℃。此時發酵60 d的成品酸肉中GABA含量最高為282.36 mg/100 g。

發酵酸肉；發酵條件；蛋白質降解；響應面法；γ-氨基丁酸

酸肉主要流行于貴州、四川、重慶、湖南等少數民族地區和漢族與少數民族雜居地區，是一種自然乳酸發酵的特色豬肉制品，至今已有兩千多年的歷史。相關研究表明［1-7］，經腌制發酵后的酸肉由于微生物生長繁殖，其蛋白質、總糖、脂肪、多肽氮及有機酸等含量變化，氨基酸組成改變，除了形成酸肉特有的清香、酯香和醬香風味外，其營養價值也發生了深刻變化。有報道從乳酸發酵產品中分離出可產生γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）的乳酸菌［8-10］，作為現代營養學研究中重要的功能成分之一，GABA具有多種生物學功能，如抗高血壓活性、免疫調節效應和抗氧化活性等［11］?？紤]酸肉厭氧發酵特點及發酵過程中乳酸菌大量生長繁殖，以及GABA富集的機理，本實驗擬研究米粉添加量和食鹽添加量對發酵60 d酸肉成品蛋白質降解及GABA形成的影響，為傳統酸肉的功能化開發提供基礎研究資料。

1　材料與方法

1.1材料

新鮮豬瘦肉、大米 市售；大米粉，粳米淘洗后炒至微黃后磨成粉，過20 目篩。

1.2試劑

NaCl、無水乙醇、次氯酸鈉均為分析純 成都市科龍化工試劑廠；K2SO4、CuSO4、苯酚、硼酸等均為分析純 重慶川東化工有限公司；GABA標準品 美國Sigma公司。

1.3儀器與設備

722型可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；RE-52旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；Avant J-3DI型離心機 美國Beckman Coulter公司；101-1A型恒溫鼓風干燥箱 上海東星建材實驗設備有限公司；KjelFlex-360全自動凱氏定氮儀 北京德泉興業商貿有限公司沈陽分公司。

1.4方法

1.4.1酸肉腌制工藝流程

原料肉→清洗→切成厚度約4 mm片狀→加調味料（鹽、米粉等）→揉制裝壇→一定溫度下密封發酵60 d→成品

1.4.2不同食鹽添加量對發酵60 d成品酸肉的影響

以米粉添加量12%、食鹽添加量分別為1%、2%、3%、4.5%、6%和8%的條件下進行揉制裝壇，置于15 ℃條件下密封發酵60 d。

1.4.3不同米粉添加量對發酵60 d成品酸肉的影響

以食鹽添加量4.5%，米粉添加量分別為2%、4%、8%、12%、16%和20%的條件下進行揉制裝壇，置于15 ℃條件下密封發酵60 d。

1.4.4響應面優化設計

根據1.4.2、1.4.3節試驗結果選出食鹽添加量和米粉添加量，并參考文獻［12］選擇發酵溫度作為主要影響因素，進行響應面優化試驗設計，進行Box-Behnken試驗［13］。

1.4.5分析方法

1.4.5.1測試樣品前處理

取發酵60 d的酸肉，刷掉表面黏附的米粉、剔除可見的脂肪和筋膜。

1.4.5.2粗蛋白和游離氨基酸含量測定

粗蛋白含量：按照GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》；游離氨基酸含量：采用GB/T 8314—2002《茶 游離氨基酸總量測定》中的茚三酮比色法測定。

1.4.5.3肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、非蛋白氮和多肽氮

采用張亞軍等［14］的方法：微量凱氏定氮法。

1.4.5.4GABA含量的測定［15］

精確稱取5.000 0 g切碎樣品，磨細勻漿，置于150 mL圓底燒瓶中，加入體積分數60%乙醇溶液20 mL，然后置于88 ℃水浴回流萃取2 h后過濾，濾渣用10 mL 60%乙醇溶液分2 次洗滌，然后將3 次濾液合并于離心管中，3 000 r/min離心20 min，將離心管中上清液轉入小燒杯內，置沸水浴蒸干，用8 mL蒸餾水充分溶解蒸干后的殘渣并轉入離心管，3 000 r/min離心20 min，取上清液備用。吸取處理后的樣液0.5 mL于試管中，加入濃度為0.2 mol/L的硼酸緩沖液1.0 mL和質量分數為6%的苯酚1.0 mL，混勻后加入0.6 mL次氯酸鈉溶液（有效氯≥5.1%），振蕩。于沸水浴中加熱10 min置于冰浴中20 min，待溶液出現藍色后，加入2.0 mL 60%的乙醇，于吸收波長645 nm處測定吸光度，通過GABA質量濃度標準曲線，得到GABA的回歸方程Y=1.999 6X+0.063 7（R2=0.994 4），從而計算得到GABA含量。

1.5數據分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，采用Design Expert 7.0軟件對響應面試驗數據進行分析，運用Excel軟件作圖。

2　結果與分析

2.1不同食鹽添加量和米粉添加量對發酵60 d酸肉GABA含量的影響

2.1.1不同食鹽添加量對發酵60 d酸肉GABA含量的影響

圖1　不同食鹽添加量處理對發酵酸肉GABA含量的影響Fig.1　Impact of salt concentration on GABA amount in fermented pork

豬瘦肉按照1.4.2節的方法分別添加12%的米粉和不同質量分數的食鹽后在15 ℃條件下密封發酵，并測定發酵60 d成品酸肉GABA含量，結果如圖1。GABA含量隨食鹽添加量的增加呈先增后降趨勢，在277.84～282.30 mg/100 g之間，食鹽添加量為4.5%時GABA含量最高，顯著高于其他各處理組（P＜0.05）。這可能與微生物的生長繁殖和蛋白質的降解有關，GABA是由谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下產生的，在食鹽添加量低時，食鹽添加量的增加，破壞原料肉蛋白質的結構，使蛋白酶更易作用于蛋白，加快蛋白質的降解，游離氨基酸增加，但食鹽添加量過高則抑制了蛋白分解酶和微生物的活性，影響乳酸菌谷氨酸脫羧酶的產生。

2.1.2不同米粉添加量對發酵60 d酸肉GABA含量的影響

豬瘦肉按照1.4.3節的方法分別添加4.5%的食鹽和不同質量分數的米粉后在15 ℃條件下密封發酵，并測定發酵60 d成品酸肉中GABA含量，結果如圖2。GABA含量隨米粉添加量的增加呈先增后降趨勢，在277.50～282.30 mg/100 g之間，米粉添加量為12%時酸肉GABA含量最高，顯著高于米粉添加量分別為2%、4%、8%的處理（P＜0.05），與米粉添加量為16%時酸肉中GABA含量之間無顯著性差異（P＞0.05）?？赡芪⑸飳τ谧鳛樘荚吹拿追鄞嬖陲柡同F象，外源米粉的添加量超過一定比例時，發酵酸肉原料中蛋白質含量下降較多，導致產品中GABA含量開始下降。

圖2　不同米粉添加量處理對發酵酸肉GABA含量的影響Fig.2　Impact of rice flour amount on GABA amount in fermented pork

2.2不同食鹽添加量和米粉添加量對發酵60 d酸肉蛋白質降解的影響

2.2.1不同食鹽添加量對發酵60 d酸肉蛋白質及降解的影響

豬瘦肉按照1.4.2節的方法分別添加12%的米粉和不同質量分數的食鹽后在15 ℃條件下密封發酵，并測定發酵60 d成品酸肉蛋白質及降解產物含量變化，結果見表1，酸肉各蛋白含量均有所下降，而蛋白降解產物則有升高趨勢，在食鹽添加量4.5%時蛋白質含量降到最低。各蛋白和蛋白降解產物變化與GABA含量變化顯著相關（P＜0.05），其中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量最高分別下降了2.07 g/100 g和2.28 g/100 g，非蛋白氮、多肽氮和游離氨基酸最高分別增加了0.61、0.41 g/100 g和0.41 g/100 g?？紤]發酵中酸肉含水量的變化，以100 g干基計，則肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量最高分別下降了5.28 g和5.54 g，非蛋白氮、多肽氮和游離氨基酸最高分別增加了0.94、0.79 g和0.90 g。

表1　不同食鹽添加量對發酵酸肉蛋白質降解的影響Table1　Impact of salt concentration on protein degradation in fermented pork g/100 g

2.2.2不同米粉添加量對發酵60 d酸肉蛋白質降解的影響

豬瘦肉按1.4.3節方法分別添加4.5%的食鹽和不同質量分數的米粉后在15 ℃條件下密封發酵，并測定發酵60 d成品酸肉中蛋白質及降解產物。結果見表2，酸肉各蛋白質含量均有所下降，而蛋白降解產物則有升高趨勢，在米粉添加量12%時蛋白質降解達到最大。各蛋白和蛋白降解產物變化與GABA含量變化顯著相關（P＜0.05），其中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白含量最高分別下降了3.06 g和3.08 g，非蛋白氮、多肽氮和游離氨基酸最高分別增加了0.97、0.40 g和0.51 g?？紤]到發酵中酸肉含水量的差異，以100 g干基計，則肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量最高分別下降了9.10 g和10.39 g，非蛋白氮、多肽氮和游離氨基酸最高分別增加了1.38、0.63 g和0.89 g。酸肉發酵中蛋白質的降低主要來自肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解，多肽氮、非蛋白氮和游離氨基酸的增加對發酵酸肉形成特有的風味或特定功能成分如GABA有利。

表2　不同米粉添加量處理對發酵酸肉蛋白質降解的影響Table2　Impact of rice flour content on protein degradation in fermented pork g/100 g

2.3響應面法優化對發酵酸肉GABA富集的影響

以上述單因素試驗為基礎，選擇米粉添加量、食鹽添加量、發酵溫度進行三因素三水平Box-Behnken響應面試驗設計，以發酵60 d成品酸肉中GABA含量為指標，通過Design Expert7.0軟件對試驗數據進行回歸分析，預測發酵條件對GABA含量的最佳工藝參數。試驗結果見表3，回歸分析見表4。

表3　響應面試驗設計方案及結果Table3　Response surface experimental design and results

經分析得到發酵條件與GABA含量之間的二次多項式模型為：Y=282.37+0.30A+0.26B+0.33C-0.088AB+ 0.21AC+0.14BC-1.03A2-1.13B2-1.21C2。

對上述回歸模型進行方差分析，結果如表4。該模型P=0.000 1＜0.01，說明方差模型差異顯著；模型失擬項P=0.064 3＞0.05，即模型失擬項差異不顯著，模型選擇合適［16-17］。模型決定系數R2=0.972 3，即由3 個影響因素引起GABA含量的變異為97.23%，說明此模型相關性良好，可用此方程對不同發酵條件下酸肉中GABA含量進行預測。由表4可知，因素A、B、C對酸肉中GABA含量影響顯著（P＜0.05），AB、AC、BC對酸肉中GABA含量影響不顯著（P＞0.05），A2、B2、C2對酸肉中GABA含量的影響極顯著（P＜0.01）。

表4　以GABA含量為響應值的回歸模型方差分析Table4　Analysis of variance of regression model with GABA amount as response value

當發酵溫度為15 ℃時，米粉添加量和食鹽添加量交互作用對GABA含量的影響如圖3。從響應面曲線可知，米粉添加量和食鹽添加量對酸肉GABA含量影響的交互作用不顯著（P＞0.05）。隨米粉添加量和食鹽添加量增加，GABA含量呈先增后減趨勢，在米粉添加量12%左右，食鹽添加量4.5%左右時，GABA含量達最大值。

圖3　米粉添加量和食鹽添加量交互作用對GABA含量影響的響應面和等高線圖Fig.3　Response surface and contour plots for the effect of rice flour and salt content on GABA amount

當食鹽添加量為4.5%時，米粉添加量和發酵溫度交互作用對GABA含量的影響如圖4。米粉添加量和發酵溫度對酸肉中GABA含量影響的交互作用不顯著（P＞0.05）。隨米粉添加量的增加和發酵溫度升高，GABA含量呈先增后減的趨勢，米粉添加量在12%左右，發酵溫度15 ℃左右時，GABA含量達最大值。

圖4　米粉添加量和發酵溫度交互作用對GABA含量影響的響應面和等高線圖Fig.4　Response surface and contour plots for the effect of rice flour amount and fermentation temperature on GABA amount

當米粉添加量為12%時，食鹽添加量和發酵溫度交互作用對GABA含量的影響如圖5。食鹽添加量和發酵溫度對酸肉中GABA含量影響的交互作用不顯著（P＞0.05）。隨食鹽添加量和發酵溫度升高，GABA含量呈先增后減趨勢，食鹽添加量在4.5%左右，發酵溫度15 ℃左右時，GABA含量達最大值。

根據Box-Behnken試驗所得結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert軟件獲得了發酵60 d成品酸肉GABA含量最高時各因素最佳條件為：米粉添加量12.73%、食鹽添加量4.74%、發酵溫度16.50 ℃。在此條件下，GABA含量預測值282.44 mg/100 g。為檢驗模型預測準確性，在此工藝條件下測定發酵60 d酸肉GABA含量為282.36 mg/100 g，與預測值接近。表明優化得到的富集工藝參數準確可靠，模型合適有效，有實踐參考價值。

圖5　食鹽添加量和發酵溫度交互作用對GABA含量影響的響應面和等高線圖Fig.5　Response surface and contour plots for the effect of salt amount and fermentation temperature on GABA amount

3　討論與結論

渝黔地區傳統發酵酸肉為自然乳酸發酵食品，有大量微生物特別是乳酸菌的生長，乳酸菌優勢菌群主要是片球菌屬（Pediococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）［5］。相關研究顯示乳酸菌、酵母菌和微球菌等可分泌胞外酶［18-19］，微生物胞外蛋白酶可降解蛋白質產生活性肽類及游離氨基酸［20］，在蛋白質降解中也可形成一定的揮發性鹽基氮，已有報道顯示發酵60 d的酸肉瘦肉的揮發性鹽基氮為19.56 mg/100 g［6］，符合國家標準中的二級鮮度15～25 mg/100 g。酸肉發酵中米粉添加量、食鹽添加量及發酵溫度都會影響微生物的生長繁殖，進而影響蛋白質的降解和GABA的形成。米粉為乳酸菌等微生物的生長及分解活動提供碳源，隨碳源增加，微生物活動增加，微生物胞外蛋白酶導致蛋白質降解、非蛋白氮增加和GABA形成；當碳源飽和時其影響變小。食鹽添加量變化會影響乳酸菌生長，從而影響谷氨酸轉化成GABA。

GABA是由谷氨酸在谷氨酸脫羧酶作用下產生，谷氨酸由蛋白質和多肽降解而來，酸肉中乳酸菌生長產生胞外酶如谷氨酸脫羧酶可作用于谷氨酸產生GABA，推測低質量分數食鹽可破壞原料肉蛋白質結構，使蛋白酶更易作用于蛋白，利于谷氨酸產生，高質量分數食鹽對乳酸菌生長有一定抑制，影響乳酸菌胞外酶的生產。食鹽不僅對谷氨酸脫羧酶有弱抑制作用，還能增加谷氨酸脫羧酶的膠體體系穩定性，二者共同作用降低谷氨酸脫羧酶活性，不利于GABA積累［21］。

本實驗結果表明米粉添加量、食鹽添加量和發酵溫度均對發酵60 d酸肉中GABA含量有顯著影響（P＜0.05），酸肉發酵工藝優化條件為米粉添加量12.73%、食鹽添加量4.74%、發酵溫度16.50 ℃時，發酵60 d的成品酸肉中GABA含量最高。

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Impact of Amounts of Rice Flour and Salt Added to Fermented Pork on Protein Degradation and γ-Amino Butyric Acid （GABA） Formation

LI Chenglong， YUAN Jun， LIU Shuzhen， ZHOU Caiqiong*
（Chongqing Special Food Engineering and Technology Research Center， College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400715， China）

The fermentation process of fresh lean pork with added rice fl our and salt to produce sour pork was optimized for higher content of γ-amino butyric acid （GABA） by response surface methodology. The effect of different amounts of rice fl our and salt on protein degradation and GABA content after 60 days of fermentation was assessed. Results indicated that the amounts of rice fl our amount and salt could affect the formation of GABA and protein degradation. The optimum fermentation conditions for sour pork were addition of 12.73% of rice fl our and 4.74% of salt and fermentation at 16.50 ℃. Under these optimized conditions， the maximum content of GABA was 282.36 mg/100 g.

fermented pork； fermentation conditions； protein degradation； response surface methodology； γ-amino butyric acid （GABA）

TS251.1

A

1002-6630（2015）13-0202-05

10.7506/spkx1002-6630-201513037

2014-09-01

李成龍（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養學。E-mail：654196032@qq.com

周才瓊（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品營養化學。E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn