妊娠期大鼠補充蘇氨酸鋅對仔鼠金屬硫蛋白基因MT1表達的影響

王光然，虞俊翔，姜雯雯，馮建萍，胡曉波，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

妊娠期大鼠補充蘇氨酸鋅對仔鼠金屬硫蛋白基因MT1表達的影響

王光然，虞俊翔，姜雯雯，馮建萍，胡曉波，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

為了探討母體補充蘇氨酸鋅對子代生長性能、金屬硫蛋白（metallothionein，MT1）mRNA表達的影響，實驗以蘇氨酸鋅為受試物，將90 只受孕SD大鼠隨機分成5 組，并于妊娠期第6～15天進行灌胃補充不同劑量蘇氨酸鋅。母鼠分娩后將仔鼠進行常規飼養至1 月齡，測量仔鼠的體質量、身長和尾長，將各組仔鼠斷頸處死后取肝臟、腎臟、脾臟和胸骨等組織進行RNA的提取并測定MT1基因相對表達量。結果表明：與空白對照組相比，蘇氨酸鋅各劑量組仔鼠體質量有顯著增加（P＜0.05）。與溶媒對照組和空白對照組相比較，蘇氨酸鋅各劑量組仔鼠的MT1mRNA表達量高，且差異顯著（P＜0.05），并且1 000 mg/kg蘇氨酸鋅處理組各組織中MT1的基因表達量要高于其他組。本結果表明：妊娠期補充蘇氨酸鋅能顯著提高仔鼠MT1mRNA表達水平，并能在一定程度上增加仔鼠體質量。

蘇氨酸鋅；金屬硫蛋白mRNA；相對表達量

鋅是動物的必需微量元素之一，與體內的多種酶類有關，參與體內的多種生命活動，影響著動物的生長發育、生產性能以及免疫功能等［1-4］。鋅同樣是正常胚胎發育所必需的微量元素。妊娠期母體對鋅需求量增加，鋅穩態對維持胎兒的正常生長發育十分重要［5］。鋅缺乏可能造成妊娠不良和胎兒畸形等不利影響，而高鋅攝入有可能引起中毒反應［6］。

大部分學者認為，機體鋅穩恒調控的主要方式是鋅的吸收與內源鋅的分泌［7］。維持細胞內鋅穩態平衡的蛋白質主要有金屬硫蛋白（metallothionein，MT）和鋅轉運蛋白［8］。進入細胞內的鋅可與MT以較低的親和力相結合，形成不穩定鋅池，調節細胞內游離鋅含量。研究證實鋅可在轉錄水平調節MT的合成［9-10］。有文獻報道［11-12］，氨基酸鋅螯合物能夠影響肉雞小腸MT mRNA表達水平，大鼠妊娠期給予補鋅水，能夠上調胎盤和母體小腸組織中MT mRNA表達。

蘇氨酸鋅屬于第三代微量元素添加劑，研究表明氨基酸鋅與無機鋅和有機酸鋅相比較在動物飼養方面具有優良的性能，顯示了廣泛的應用前景［13-15］。本實驗通過對妊娠期大鼠給予蘇氨酸鋅探討妊娠期補鋅對仔鼠金屬硫蛋白基因表達的影響，以探討妊娠期補充蘇氨酸鋅對子代鋅營養水平的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1受試物

蘇氨酸鋅，由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室制備，是由蘇氨酸和氧化鋅采用水熱化學合成法制備的一種氨基酸鋅螯合物，其化學式為C8H16N2O6Zn·2H2O，鋅含量為19.36%，結構見圖1［16］。

圖1　蘇氨酸鋅的結構圖［1166］Fig.1　Structure of zinc threoninate［16］

1.1.2試劑

Trizol試劑（RNA提取試劑） 美國Invitrogen公司；Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（cDNA合成試劑盒） 立陶宛Fermentas公司；SYBR Permix Ex TaqTM（實時定量PCR試劑盒）、0.1%焦碳酸二乙酯處理水 日本TaKaRa公司；96孔PCR板 美國Applied Biosystems公司；無DNA/RNA酶的一次性吸液嘴和EP管美國Axygen公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇均為分析純試劑。

1.1.3實驗動物

SD大鼠，成年未經產8 周齡，雌鼠90 只，200～250 g，雄鼠45 只，300～350 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2011-0003，合格證號：0017269。

1.2儀器與設備

3K15-高速冷凍離心機 德國Sigma公司；PCR儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；7900 HT Fast Real-Time PCR System 美國ABI公司；E-330多功能酶標儀美國Thermo公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1動物及處理

選用SPF級SD大鼠，常規喂養，飼料中的鋅含量為139 mg/kg。

大鼠適應環境7 d后，選取健康的雌雄大鼠每天晚上8點按2∶1合籠，將每天檢出的孕鼠隨機分為5 組，即高、中、低劑量組，溶媒對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na））和空白對照組，每組18 只。各劑量組大鼠于妊娠期第6～15天連續灌胃，分別給予1 000、500、250 mg/kg蘇氨酸鋅，每天灌胃一次，容積為1.5 mL/100 g，溶媒對照組和空白對照組按容積為1.5 mL/100 g給予0.5% CMC-Na和雙蒸水。并在受孕的0、4、8、12、16、20 d稱體質量，根據體質量重新調整灌胃的容積。

對孕鼠自然分娩后得到的健康仔鼠進行母乳喂養，斷奶后改為常規飼養。

1.3.2樣品采集

將1月齡仔鼠斷頸處死，取組仔鼠的肝臟、腎臟、脾臟和胸骨等組織放入1.5 mL的EP管中，于-80 ℃冰箱中保存，以備測定MT1mRNA表達量。

1.4測定項目

1.4.1生長性能

各組隨機選取1 月齡仔鼠24 只，測量體質量、身長和尾長。

1.4.2MT1mRNA的提取與測定

RNA的提取按照試劑盒說明書要求進行，用紫外分光光度計測定所提RNA在260、280 nm波長處的光密度（OD）值，通過OD260nm/OD280nm值檢測RNA純度，并用瓊脂糖凝膠電泳成像分析系統檢測RNA完整性。隨后按照試劑盒要求進行反轉錄與熒光定量（real-time reverse transcription polymerase chain reaction，PCR）。實驗所需引物由大連寶生物有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.5統計分析

實時熒光定量PCR產物利用7900 HT PCR系統軟件分析，可觀察擴增曲線和溶解曲線，并對cDNA含量進行定量分析，計算樣本的ΔΔCt值。所有數據用表示，SPSS 13.0軟件處理數據，多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性t檢驗，以α=0.05為檢驗標準，P＜0.05表明差異具有顯著意義。

2　結果與分析

2.1妊娠期補充蘇氨酸鋅對仔鼠生長性能的影響

由表1可知，1 月齡仔鼠的身長和尾長，蘇氨酸鋅各劑量組和CMC-Na組與空白對照組相比，差異無統計學意義。蘇氨酸鋅各劑量組和溶媒對照組體質量相比，差異有統計學意義（P＜0.05），空白對照組與溶媒對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），蘇氨酸鋅各劑量組之間差異無統計學意義。實驗結果顯示，母體補充蘇氨酸鋅對其子代可充分滿足其生長對鋅營養的需求，其子代在生長性能方面表現突出。

表1　妊娠期補充蘇氨酸鋅對仔鼠生長性能的影響（xTable1　Effect of maternal Thr-Zn supplementation on growth performance of offspring rats

表1　妊娠期補充蘇氨酸鋅對仔鼠生長性能的影響（xTable1　Effect of maternal Thr-Zn supplementation on growth performance of offspring rats

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

組別體質量/g身長/cm尾長/cm空白對照組69.58±3.93b11.10±0.437.94±0.32 CMC-Na組69.58±3.57b11.09±0.437.98±0.55 1 000 mg/（kg·d）蘇氨酸鋅組74.29±3.94a11.47±0.257.98±0.28 500 mg/（kg·d）蘇氨酸鋅組74.64±3.09a11.37±0.677.76±0.41 250 mg/（kg·d）蘇氨酸鋅組77.06±2.40a10.97±0.457.84±0.48

2.2熒光定量PCR結果

2.2.1擴增曲線

圖2為cDNA樣品的擴增曲線。Ct值與起始模板數的對數值成反比的線性關系。圖中兩個重復的擴增曲線與橫軸的交點幾乎重合，說明樣品的重復性良好。

圖2　熒光定量PCR擴增曲線Fig.2　Real time PCR amplification plot

2.2.2熔解曲線

圖3　熒光定量PCR熔解曲線Fig.3　Real time PCR melting curve

表2　樣品的Ct值（Table2　Ct values of samples （x

表2　樣品的Ct值（Table2　Ct values of samples （x

組別肝臟脾臟腎臟胸骨β-肌動蛋白MT1β-肌動蛋白MT1β-肌動蛋白MT1β-肌動蛋白MT1空白對照組20.61±0.2232.64±0.2715.25±0.24 33.52±0.3414.21±0.1631.63±0.5824.75±0.15 35.25±0.72 CMC-Na組14.48±1.1332.36±0.4419.44±0.09 24.58±0.7916.21±0.1632.02±0.8728.62±0.46 31.08±1.21 1 000 mg/（kg·d）蘇氨酸鋅組25.33±0.1131.92±1.1314.59±0.27 31.37±0.4814.00±0.4331.21±1.1624.57±0.23 29.44±0.24 500 mg/（kg·d）蘇氨酸鋅組16.98±0.6230.44±0.8519.76±0.05 33.35±0.8315.92±0.1229.68±0.3725.53±0.29 33.00±1.09 250 mg/（kg·d）蘇氨酸鋅組16.87±0.2734.05±0.2925.11±0.13 32.72±1.5522.94±0.4632.11±0.3227.34±0.20 33.52±1.00

通過熔解曲線的分析確認PCR反應的特異性。圖3為同一cDNA樣品3 個重復的熔解曲線的負一次微分曲線，圖中熔解曲線只有單一的主峰，說明引物特異性較好。

2.2.3樣品的Ct值

利用實時熒光定量PCR技術對基因mRNA的表達水平進行研究，其結果具有可比性和重復性。實時熒光定量PCR實驗時，在整個PCR反應擴增過程中對擴增相關的熒光信號進行了實時監測和連續分析，隨反應時間的延長，監測到的熒光信號的變化可以繪成一條曲線。Ct值是指PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。表2為各樣品實時熒光定量PCR測定的Ct值。

2.3高劑量的蘇氨酸鋅對仔鼠MT1基因表達水平的影響

本實驗采用比較Ct值的相對定量法計算基因的相對表達量［17］，將對照樣品的表達量作為“1”，計算各個樣品的ΔCt、ΔΔCt及2-ΔΔCt值，并將2-ΔΔCt進行統計學分析。表3是各個樣品中MT1基因的相對表達量。

表3　各個組織中MMTT1基因的相對表達量Table3　Relative expression levels ofMMTT1ggeennee

由表3可知，蘇氨酸鋅各劑量組相對于CMC-Na溶媒對照組和空白對照組，在肝臟、脾臟、腎臟和胸骨中金屬硫蛋白MT1的基因表達量都要高，且差異顯著（P＜0.05）。1 000 mg/（kg·d）蘇氨酸鋅處理組，相對于其他各組，在肝臟、脾臟、腎臟和胸骨中MT1基因表達量都要高。結果顯示，MT1基因表達量與鋅的水平表現正相關性，說明蘇氨酸鋅被有效吸收。

3　討 論

黃連瑩［18］在飼糧中添加不同鋅源應用于生長育肥豬的研究中表明，蛋氨酸鋅和甘氨酸鋅比富馬酸鋅更能提高日增質量，并且氨基酸鋅的添加能夠改善飼糧的轉化效率，同時降低生長育肥豬的腹瀉率。景翠等［19］在斷奶仔豬的日糧中添加甘氨酸鋅等不同鋅源實驗，結果顯示添加甘氨酸鋅可以提高斷奶仔豬的采食量、日增質量，提高仔豬免疫力。本實驗中，蘇氨酸鋅各劑量組與溶媒對照組、空白對照組相比，仔鼠體質量明顯提高，這可能是因為氨基酸鋅具有調節食欲、增加采食量、降低腹瀉率、抑制有害細菌生長［20］等功能，因而可改善動物的生長性能。

MT基因的表達受鋅攝入水平的調控，當機體鋅濃度過低時，MT基因表達降低，與鋅的結合減少，以維持血漿中鋅濃度；而鋅濃度過高時，鋅誘導MT基因表達增多，使過量的鋅與MT結合，從而避免血漿鋅濃度過高發生鋅中毒［21］。鄭立鑫等［22］對肉仔雞的實驗發現，相對于硫酸鋅，3 種氨基酸鋅能顯著提高腸道MT mRNA的相對表達量。Cui Li等［23］利用大鼠進行實驗，結果發現飼料缺鋅時肝臟、腎臟以及小腸中的MT1mRNA表達水平明顯降低。劉化偉等［24］利用肉仔雞建立臨界缺鋅模型并飼喂不同鋅源的日糧，發現氨基酸鋅處理組肉雞十二指腸腸黏膜MT mRNA相對表達量明顯高于無機鋅處理組。MT有4 種亞型異構體，其中MT1和 MT2在大多數哺乳動物的內臟器官中廣泛存在，參加其功能調節，且MT1和MT2協同表達；MT3是該家族中的腦部特異成員，MT4主要分布于皮膚等器官的角質細胞和復層鱗狀上皮細胞中［25］。同類型生物的MT在化學組成、結構以及主要功能方面都具有類似性［26］。本實驗選取MT1作為研究對象，研究結果也進一步驗證了對母體補充蘇氨酸鋅后，其子代的鋅營養水平在一定時期內能得到滿足，表現在蘇氨酸鋅各劑量組的子代與溶媒對照組和空白對照組的子代相比較，其肝臟、腎臟、脾臟及胸骨MT1基因表達量顯著提高。

實驗結果分析可知，妊娠期大鼠補充蘇氨酸鋅，大鼠對蘇氨酸鋅的吸收效果較好，對其相應的子代在斷奶飼養至1 月齡后的生長仍然有比較大的影響。同時，仔鼠肝臟、脾臟、腎臟和胸骨中的MT1基因可以作為評價其鋅營養狀況的指標，其中肝臟和腎臟中的MT1基因可以作為一個敏感指標。

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Effect of Oral Zinc Threoninate in Pregnant Rats on the Expression of Metallothionein Gene in Their Offspring

WANG Guangran， YU Junxiang， JIANG Wenwen， FENG Jianping， HU Xiaobo， XIE Mingyong*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China）

To observe the effect of zinc threoninate （Thr-Zn） orally supplemented to pregnant rats on the growth performance and metallothionein （MT） mRNA expression in their o ffspring， 90 pregnant SD rats were randomly divided into 5 groups which were administered daily with Thr-Zn at different doses by gavage during days 6 to 15 of pregnancy. After birthing， the newborn rats were routinely fed for a full month. After measuring the body weight， body length and tail length， the liver， kidney， spleen， and sternum of the offspring rats from each group were harvested for extracting RNA and determining the relative expression levels of MT1gene. Compared with the blank control group， body weights of the offspring of rats treated with Thr-Zn increased significantly （P ＜ 0.05）. Compared with the blank control and solvent control groups， MT1mRNA expression levels in the offspring of rats treated with Thr-Zn were significantly higher （P ＜ 0.05）. The expression level of MT1mRNA in offspring rats with maternal Thr-Zn treatment at a dose of 1 000 mg/kg was higher than that in other groups. Therefore， maternal Thr-Zn supplementation can significantly improve the expression level of MT1mRNA and increase the body weights of offspring rats.

zinc threoninate； metallothionein mRNA； relative expression level

TS201.6

A

1002-6630（2015）13-0235-04

10.7506/spkx1002-6630-201513043

2014-11-26

江西省自然科學基金項目（20132BAB204002）；江西省重大科技創新研究項目（20124ACF00400）；江西省教育廳2011年度產學研合作項目（GJJ11002）；江西省科技支撐計劃項目（20151BBF60040）

王光然（1988—），女，碩士研究生，研究方向為營養保健與功能食品。E-mail：guangr323@163.com

謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品營養學、食品安全、功能保健食品。E-mail：myxie@ncu.edu.cn