原料乳中氧氟沙星殘留量對S. thermophilus grx02發酵乳質構及流變特性的影響

陳　霞，包一楓，陳大衛，趙海晴，顧瑞霞*

（揚州大學 江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州　225127）

原料乳中氧氟沙星殘留量對S. thermophilus grx02發酵乳質構及流變特性的影響

陳霞，包一楓，陳大衛，趙海晴，顧瑞霞*

（揚州大學 江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州225127）

選擇對氧氟沙星敏感的嗜熱鏈球菌（S. the rmophilus）grx02作為發酵微生物，研究了不同氧氟沙星殘留量對其生長曲線及發酵乳質構和流變特性的影響。結果表明：當原料乳中氧氟沙星殘留量達到1.0 μg/mL時，會使S. thermophilus grx02的生長速率、發酵乳的黏附性、膠黏性和咀嚼性顯著降低；當氧氟沙星殘留量達到0.5 μg/mL時，會對S. thermophilus grx02發酵乳的流變特性產生顯著影響，使其凝膠穩定性降低，抗機械運動和溫度變化的能力降低（P＜0.05）。上述結果表明，用于發酵乳制品生產的原料乳中氧氟沙星的殘留限量應該控制在0.5 μg/mL以下。

氧氟沙星；嗜熱鏈球菌；發酵乳；質構；流變特性

近年來，牛乳中的抗生素殘留問題已經引起人們的廣泛重視。原料乳中的抗生素殘留不僅會引起一系列的食品安全問題，同時可能導致牛乳發酵遲緩，甚至不能正常凝乳，嚴重影響了發酵乳制品的品質［1-2］。氧氟沙星（ofloxacin，OFX）屬于氟喹諾酮類抗生素，由于其價格較低、抗菌譜廣、高效低毒等特點［3］，被廣泛用于奶牛乳房炎的預防和治療，使得原料乳中的氧氟沙星殘留問題較普遍［4-5］。前期的研究發現，0.75 μg/mL的氧氟沙星會延長嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）grx02發酵乳的凝乳時間，降低其產酸能力和產黏能力［6］。而低質量濃度的氧氟沙星對發酵乳的質構和流變特性會產生怎樣的影響，目前還未見報道。

發酵乳是一種較復雜的流體，其最理想的狀態是半固體狀［7］。高品質的發酵乳應當質地均勻細膩，并具有一定的硬度、彈性、膠黏性和黏度［8］，以確保其在運輸和貯藏過程中的穩定性。近年來，由于原料乳中的抗生素殘留較普遍，使得發酵乳的凝膠狀態受到了一定的影響［9-10］。利用食品質構儀和旋轉流變儀，可以研究原料乳中低質量濃度的抗生素殘留對發酵乳凝膠的硬度、彈性、膠黏性和黏度等一系列物理性質的影響［11-12］，可以了解發酵乳的流動和變形隨時間、溫度、剪切力的變化而表現出的一系列性質［13］，是檢測發酵乳質量和穩定性的重要手段之一［14-15］。本實驗通過靜態分析法來研究不同氧氟沙星殘留量對發酵乳質構和流變特性的影響，以期為乳品企業加強原料乳的質量控制，不斷提高發酵乳產品的質量提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料、菌種與試劑

脫脂乳粉、全脂乳粉新西蘭恒天然公司。

S. thermophilus grx02為揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室分離、篩選和保存的專利菌株。

氧氟沙星（粉狀，100 g/瓶，醫藥級）加拿大BBI公司。

1.2儀器與設備

SX-500高壓滅菌器日本Tomy公司；APV 1000高壓均質儀丹麥APV公司；FP-110-C全自動生長曲線分析儀芬蘭Bioscreen公司；TMS-Pro食品質構儀美國FTC公司；Allegra X-22R臺式冷凍離心機德國貝克曼公司；Kinexus Pro旋轉流變儀英國馬爾文公司；XMTD-8222恒溫培養箱上海精宏實驗設備有限公司。

1.3方法

1.3.1S. thermophilus grx02的活化培養

將凍干保存的S. thermophilus grx02菌種接種于脫脂乳培養基中培養，42 ℃活化兩代，4 ℃冷藏備用。

1.3.2S. thermophilus grx02生長曲線的測定

將活化好的S. thermophilus grx02以2.0%（V/V）的量接種到MRS液體培養基中，各藥物組分別加入0.1、0.5、1.0 μg/mL的氧氟沙星，利用全自動生長曲線儀測定在42 ℃恒溫培養過程中的OD600nm值，并繪制生長曲線。

1.3.3發酵乳樣品的制備

發酵乳樣品的制備方法參照陳霞等［16］的方法進行。對照組不加氧氟沙星，各藥物組分別加入0.1、0.5、1.0 μg/mL的氧氟沙星，于42 ℃培養至凝乳后，迅速置于冰水中冷卻至4 ℃，并于4 ℃冷藏24 h后進行質構和流變特性的測定。

1.3.4發酵乳質構特性的測定

發酵乳質構特性測定參照李達等［17］的方法，對測定參數略作改動，用TMS-Pro食品質構儀進行測定。將從4 ℃冰箱取出的發酵乳樣品立即在室溫條件下進行測定。測定探頭：P/25柱形探頭，測定參數：測試前速率5.0 mm/s，測試速率2.0 mm/s，測試 后速率2.0 mm/s，起始力0.03 N，穿入距離10 mm，兩次壓縮之間停留5 s。利用質構數據分析軟件由全質構曲線計算得到硬度（hardness）、最大黏附力（cohesiveness）、黏附性（adhesiveness）、彈性（springiness）、膠黏性（gumminess）和咀嚼性（chewiness）等指標值。

1.3.5發酵乳流變特性的測定

發酵乳流變特性測定參照王松松等［18］的方法進行，并對部分測定參數略作改動。利用馬爾文Kinexus Pro旋轉流變儀，采用CP2/50 SR0162 SS探頭對發酵乳樣品分別進行以下流變特性指標的檢測。

1.3.5.1表觀黏度隨時間變化的測定

在恒溫25 ℃、恒定剪切速率1.0 s-1、剪切時間2 min條件下，每2 s采集一個數據點，檢測樣品的表觀黏度隨時間的變化情況。

1.3.5.2觸變性及觸變環面積的測定

在恒溫25 ℃條件下，首先剪切速率由0.1 s-1線性升高到100 s-1，每2 s采集一個數據，測定時間為2 min；剪切速率到達100 s-1后再線性降速到0.1 s-1，每2 s采集一個數據，測定時間為2 min，測定發酵乳樣品的剪切應力、表觀黏度隨剪切速率的變化關系。

1.3.5.3應變掃描

在恒溫25 ℃條件下，掃描頻率為1 Hz，應變量由0.1%上升到100%，對發酵乳樣品進行應變掃描，采集數據點30 個。

1.3.5.4溫度掃描

在剪切速率恒定為0.1 s-1條件下，對樣品進行從4 ℃階梯升溫至30 ℃溫度掃描，升溫速率為6 ℃/m in，采集的數據點為20 個。

1.4數據統計與分析

數據統計與分析均采用SPSS 17.0軟件進行，采用Excel 2003作圖。

2　結果與分析

2.1不同質量濃度氧氟沙星對S. thermophilus grx02生長特性的影響

圖1　不同質量濃度氧氟沙星作用下S. thermophiilluuss grx02的生長曲線Fig.1　Growth curves of S. thermophilus grx02 under different ofloxacin concentrations

由圖1可知，加入1.0 μg/mL氧氟沙星后S. thermophilus grx02生長速率顯著低于其他3 組，而0.5 μg/mL和0.1 μg/mL組的生長曲線與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。對照組、0.5 μg/m L和0.1 μg/mL組的S. thermophilus grx02在培養6 h時開始進入對數生長期，而1.0 μg/mL組在培養8 h時進入對數生長期。說明當氧氟沙星殘留量較高時，能夠對S. thermophilus grx02的生長產生明顯的抑制作用，能夠顯著降低S. thermophilus grx02的生長速率；而較低質量濃度的氧氟沙星對S. thermophilus grx02生長的抑制作用較弱。

[7][9] Michael D. Swaine, “China’s Assertive Behavior Part One: On ‘Core Interests’”, China Leadership Monitor, February 22, 2011, pp. 8-11, pp. 9-10.

2.2不同質量濃度氧氟沙星對S. thermophilus grx02發酵乳質構特性的影響

表1　不同質量濃度氧氟沙星對S. thermophilus grx02發酵乳質構特性的影響（x =3）Table 1 Effect of ofloxacin concentration on texture properties of S. thermophilus grx02 fermented milk（x ± ， n = 3）

在4 ℃貯藏24 h后各發酵乳樣品的質構特性測定結果如表1所示，氧氟沙星各質量濃度組與對照組相比，發酵乳的硬度、最大黏附力和彈性間無顯著性差異。但從黏附性和膠黏性來看，1.0 μg/mL組顯著低于對照組（P＜0.05），而0.5 μg/mL和0.1 μg/mL組與對照組之間差異不顯著。說明當原料乳中氧氟沙星的殘留量較高時，會使發酵乳的黏附性和膠黏性降低，對其口感產生一定的影響。從咀嚼性來看，1.0 μg/mL組顯著低于對照組和0.1 μg/mL組，而0.5 μg/mL組與其他組之間差異不顯著。說明當氧氟沙星的殘留量較高時，會使發酵乳的結實度降低，口感變差，這也與陳霞等［19］的研究結果相一致。這是因為較高殘留量的氧氟沙星會對乳酸菌的生長產生一定的抑制作用，降低了凝乳酶的產生量，使其產酸和產黏能力降低，從而使得發酵乳的結實度受到影響。而當氧氟沙星的殘留量較低時，對乳酸菌的生長抑制作用較小，因而對其產酸和產黏能力的影響也較小。

2.3恒溫恒速下S. thermophilus grx02發酵乳的表觀黏度隨時間的變化

圖2　恒溫恒速下發酵乳樣品表觀黏度隨時間的變化曲線Fig.2　Evolution of with shear time of apparent viscosity at constant temperature and rotation speed for fermented milk

在恒溫25 ℃、剪切速率1 s-1條件下，含不同質量濃度氧氟沙星的發酵乳樣品的表觀黏度隨時間變化情況如圖2所示，各發酵乳樣品的表觀黏度都隨著時間的延長而逐漸降低，說明各發酵乳樣品都具有時間因素的切稀現象，屬于正觸變性流體。當發酵乳樣品中的氧氟沙星質量濃度為0.5 μg/mL時，發酵乳樣品的表觀黏度明顯低于對照組和0.1 μg/mL組；且隨著氧氟沙星質量濃度的升高，各發酵乳樣品的表觀黏度隨之下降；而0.1 μg/mL組發酵乳的表觀黏度與對照組比較接近，說明當氧氟沙星質量濃度達到0.5 μg/mL時，就會使發酵乳凝膠的網絡結構變的松散，使其結實度降低，從而影響了發酵乳的穩定性。

2.4S. thermophilus grx02發酵乳樣品剪切應力隨剪切速率的變化情況

圖3　恒溫條件下各發酵乳樣品的剪切應力隨剪切速率的變化曲線Fig.3　Curves of shear stress versus shear rate of fermented milk at constant temperature

在恒溫25 ℃條件下，含不同質量濃度氧氟沙星的發酵乳樣品的剪切應力隨剪切速率的變化情況如圖3所示。在升速剪切過程中，各發酵乳樣品的剪切應力都隨著剪切速率的增大而逐漸降低；當剪切速率達到最大值時開始降速剪切，各發酵乳樣品的剪切應力又隨著剪切速率的降低而進一步減小。起始剪切應力最大，這是因為此時發酵乳處于固體狀，轉子需要克服酸乳凝膠的屈服應力較大；而當發酵乳的凝膠狀態被破壞后，剪切應力會迅速降低。在相同剪切速率條件下，1.0 μg/mL組的剪切應力明顯小于其他3 組，而0.5 μg/mL組和0.1 μg/mL組與對照組比較接近。說明當氧氟沙星質量濃度達到1.0 μg/mL時，會降低發酵乳的凝膠強度，使其在運輸和貯藏過程中，會因為很小的外力作用或輕微的晃動而發生破乳現象。由圖3還可以看出，各發酵乳樣品的升速曲線和降速曲線并不重合，有滯后現象，形成滯后環（觸變環）。滯后環是觸變性流體的典型特征［20］，說明各發酵乳樣品均屬于觸變性流體，其凝膠結構在剪切力的作用下受到破壞后將無法恢復到初始狀態。

圖4　恒溫恒定頻率下各發酵乳樣品應變掃描曲線Fig.4　Strain sweep curves at constant temperature and frequency for fermented milk

在恒溫25 ℃條件下，掃描頻率為1 Hz，對不同質量濃度氧氟沙星的發酵乳樣品的應變掃描結果如圖4所示。通過應變掃描可以得到彈性模量（G'）和黏性模量（G”）兩組數據，它們可以反映發酵乳內在凝膠結構的穩定性強弱［21］。G'表示當物體受到外力作用時的變形程度，G'越大說明物體受到外力作用時的變形程度越小；而G”表示的是物體受到外力作用時阻礙其流動的特性，G”越大說明物體受到外力作用時越不容易流動［22］。G'與G”的大小決定了物體的流動特性，當G'＞G”時，樣品的彈性形變優于黏性形變，物體呈現出一定的剛性特征，呈現出固體特性；當G'＜G”時，樣品的黏性形變優于彈性形變，物體表現出一定的流體特性［14］。通過應變掃描還可以得到發酵乳樣品的線性黏彈區，線性黏彈區的大小表示樣品在本身結構不受影響的情況下所能承受的最大應變或應力［23］。由圖4可知，在線性黏彈性區域內各發酵乳樣品的G'和G”的變化不明顯，且在這一區域內G'＞G”，說明此時發酵乳樣品的網絡結構還未被破壞，顯示出相對較強的彈性，表現為固體特性；隨著應變幅度的不斷增大，達到臨界應變量（γc）時，G'和G”值均開始逐漸減小，說明發酵乳凝膠的網絡結構受到破壞，但此時其G'仍大于G”，發酵乳樣品仍具有一定的彈性，其凝膠狀態仍可以恢復；當應變增大到63.07%時，4 組發酵乳的G'均小于G”，此時發酵乳開始流動，顯示出流體特性。由圖4還可以看出，在相同的應變量（γ）條件下，隨著氧氟沙星質量濃度的升高，G'和G”值均隨之降低，而0.1 μg/mL組與對照組比較接近，說明隨著氧氟沙星殘留量的升高，發酵乳的穩定性隨之降低；而當氧氟沙星的殘留量較低時，對發酵乳的穩定性的影響較小。4 種發酵乳制品的臨界應變量（γc）和臨界應變量時的G'和G”如表2所示。

表2　4 種發酵乳制品臨界應變量及其彈性模量和黏性模量Table 2 Critical strain， elastic modulus and viscous modulus of fermented milk as a function of the amount of residual ofloxacin

臨界應變量（γc）可以反映樣品的線性黏彈區的大小，發酵乳制品的線性黏彈區寬度及其彈性模量和黏性模量的大小也反映了發酵乳內在網絡結構穩定性的強弱［23］。由表2可知，0.1 μg/mL組的發酵乳制品線性黏彈區與對照組的范圍比較接近，而1.0 μg/mL和0.5 μg/mL組的線性黏彈區范圍明顯變窄，且彈性模量和黏性模量均隨著氧氟沙星質量濃度的升高而明顯降低。說明氧氟沙星的殘留量達到0.5 μg/mL時均會在一定程度上降低發酵乳組織結構的穩定性，使其凝膠強度減弱，在運輸時會由于晃動和沖擊而引起破乳。

2.6溫度掃描結果

圖5　發酵乳樣品表觀黏度隨溫度的變化曲線Fig.5　Apparent viscosity curves of fermented milk as a function of temperature

在剪切速率恒定為0.1 s-1條件下，對不同質量濃度氧氟沙星的發酵乳樣品的溫度掃描結果如圖5所示。發酵乳制品在運輸過程中，經常會遇到溫度的突然變化，也會造成發酵乳內部組織結構的變化。研究在恒定剪切速率下發酵乳表觀黏度隨溫度的變化，能在一定程度上反映發酵乳制品在生產運輸過程中對溫度變化的耐受能力［24］。由圖5可知，各發酵乳樣品的表觀黏度均隨著溫度的升高而逐漸降低，在一定溫度范圍內，1.0 μg/mL組的表觀黏度均明顯低于其他組，其他3 組在升溫過程中表觀黏度較接近。溫度掃描結果進一步說明氧氟沙星的殘留量較高時，會使發酵乳對溫度變化的耐受性降低，使其在運輸過程會由于溫度的變化而使發酵乳產品的穩定性降低。

3　結 論

本實驗選擇對氧氟沙星敏感的S. thermophilus grx02作為發酵劑菌種，研究了不同殘留量的氧氟沙星對S. thermophilus grx02生長曲線的影響，以及對S. thermophilus grx02發酵乳的質構和流變特性的影響。結果表明：當氧氟沙星的質量濃度達到1.0 μg/mL時，會使S. thermophilus grx02生長速率顯著降低（P＜0.05）；當氧氟沙星的質量濃度達到1.0 μg/mL時，會使S. thermophilus grx02發酵乳的黏附性、膠黏性和咀嚼性顯著降低（P＜0.05）；當氧氟沙星的質量濃度達到0.5 μg/mL時，會對S. thermophilus grx02發酵乳的流變特性產生一定影響，使其凝膠穩定性降低，抗機械運動和溫度變化的能力降低。因此，用于發酵乳制品生產的原料乳中氧氟沙星的殘留限量應該控制在0.5 μg/mL以下。

［1］陳云， 李洪亮， 張冬潔， 等. 乳中抗生素殘留及其檢測方法的研究進展［J］. 中國乳品工業， 2012， 40（9）： 35-38.

［2］王文輝， 劉慧艷， 王玉玨， 等. 牛奶中抗生素殘留快速檢測方法分析［J］.中國乳品工業， 2011， 39（7）： 53-55.

［3］AMINIMANIZANI A， BERINGER P， JELLIFFE R. Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of the newer fluoroquinolone antibacterials［J］. Clinical Pharmacokinetics， 2001， 40（3）： 169-187.

［4］ROTSCHAFER J C， ULLMAN M A， SULLIVAN C J. Optimal use of fluoroquinolones in the intensive care unit setting［J］. Veterinarski Glasnik， 2011， 27（1）： 95-106.

［5］王建軍， 黃菲菲， 趙嘉胤， 等. 生鮮乳中農獸藥殘留限量分析比對［J］.中國乳品工業， 2011， 39（4）： 42-44.

［6］陳霞. 低濃度喹諾酮對嗜熱鏈球菌生理特性及蛋白組表達的影響研究［D］. 揚州： 揚州大學， 2014.

［7］PENG Y， SERRA M， HORNE D S， et al. Effect of fortification with various types of milk proteins on the rheological properties and permeability of nonfat set yogurt［J］. Journal of Food Science， 2009，74（9）： 666-673.

［8］MIGUEL M D E O， PEDRO E D A， ADRIANO G D A C， et al. Effect of dynamic high pressure on milk fermentation kinetics and rheological properties of probiotic fermented milk［J］. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2014， 26（12）： 67-75.

［9］FOLKENBERG D M， DEJMEK P， SKRIVER A， et al. Sensory and rheological screening of exopolysaccharide producing strains of bacterial yoghurt cultures［J］. International Dairy Journal， 2006， 16（2）：111-118.

［10］ RIMADA P， ABRAHAM A G. Kefiran improves rheological properties of 462 glucono lactona induced skim milk gels［J］. International Dairy Journal， 2006， 16（1）： 33-39.

［11］ 李全陽， 夏文水. 酸乳流變學特性的初步研究［J］. 食品與發酵工業，2003， 29（12）： 35-39.

［12］ GOMEZ-DIAZ D， NAVAZA J M. Rheology of food stabilizers blends［J］. Journal of Food Engineering， 2004， 64（2）： 143-149.

［13］ BILIADERIS C G， KHAN M M， BLANK G. Rheological and sensoryproperties of yogurt from skimand ultrafiltered retentates［J］. International Dairy Journal， 1992， 2（5）： 311-323.

［14］ TABILO-MUNIZAGA G， BARBOSA-C.NOVAS G V. Rheology for the food industry［J］. Journal of Food Engineering， 2005， 67（1）：147-156.

［15］ HASSAN A N， IPSEN R， JANZEN T， et al. Microstructure and rheology of yogurt made with cultures differing only in their ability to produce exopolysaccharides［J］. Journal of Dairy Science， 2003， 86（5）：1632-1638.

［16］ 陳霞， 吳琳楠， 黃玉軍， 等. 環丙沙星殘留量對嗜熱鏈球菌grx02發酵乳品質的影響［J］. 食品科學， 2012， 33（13）： 176-179.

［17］ 李達， 張雪， 張莉， 等. 西藏靈菇中產胞外多糖嗜熱鏈球菌的分離篩選及其發酵性能測定［J］. 食品科學， 2011， 32（13）： 225-228.

［18］ 王松松， 陳慶森. 3種發酵乳制品流變性質的比較與分析［J］. 食品科學， 2011， 32（19）： 7-11.

［19］ 陳霞， 郭飛翔， 黃玉軍， 等. 氧氟沙星對嗜熱鏈球菌grx02發酵性能的影響［J］. 食品研究與開發， 2014， 35（1）： 88-91.

［20］ GENTES M C， ST-GELAIS D， TURGEON S L. Gel formation and rheological properties of fermented milk with in situ exopolysaccharide production by lactic acid bacteria［J］. Dairy Science & Technology，2011， 91（5）： 1-17.

［21］ AYALA-HERNANDEZ I， HASSAN A N， GOFF H D， et al. Effect of protein supplementation on the rheological characteristics of milk permeates fermented with exopolysaccharide-producing Lactococcus lactis subsp. cremoris［J］. Food Hydrocolloids， 2009， 23（5）： 1299-1304.

［22］ RAMCHANDRAN L， SHAH N P. Proteolytic profiles and angiotensin-I converting enzyme and alpha-glucosidase inhibitory activities of selected lactic acid bacteria［J］. Journal of Food Science，2008， 73（2）： 75-81.

［23］ DEBON J， PRUDêNCIO E S， PETRUS J C C. Rheological and physicochemical characterization of prebiotic microfiltered fermented milk［J］. Journal of Food Engineering， 2010， 99（2）： 128-135.

［24］ CRUZ A G， CAVALCANTI R N， GUERREIRO L M R， et al. Developing a prebiotic yogurt： rheological， physico-chemical and microbiological aspects and adequacy of survival analysis methodology［J］. Journal of Food Engineering， 2013， 114： 323-330.

Effect of Residual Ofloxacin in Raw Milk on Texture and Rheological Behavior of Fermented Milk Produced by S. thermophilus grx02

CHEN Xia， BAO Yifeng， CHEN Dawei， ZHAO Haiqing， GU Ruixia*
（Jiangsu Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control， Yangzhou University， Yangzhou225127， China）

S. thermophilus grx02， a strain sensitive to ofloxacin， was used as starter culture to produce fermented milk， and the effect of residual ofloxacin on the growth curve of the strain and the texture and rheological behavior of fermented milk was studied. The results showed that the growth rate of S. thermophilus grx02 was markedly decreased when the amount of residual loxacin was 1.0 μg/mL. At the same time， the adhesiveness， gumminess and chewiness of fermented milk were also reduced remarkably. When the residual amount of ofloxacin rose to 0.5 μg/mL， the storage stability and rheological properties of fermented milk changed significantly， and the gel stability and resistance to mechanical movement and temperature variations also declined （P ＜ 0.05）. These findings suggest that the residual amount of ofloxacin in raw milk used for the processing of fermented dairy product should be lower than 0.5 μg/mL.

ofloxacin； S. thermophilus； fermented milk； texture； rheological behavior

Q931

A

1002-6630（2015）23-0018-05

10.7506/spkx1002-6630-201523004

2015-01-27

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201393）；江蘇省高校自然科學研究重大項目（12KJA550003）

陳霞（1976—），女，副教授，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：chenxia@yzu.edu.cn

顧瑞霞（1963—），男，教授，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：rxgu@yzu.edu.cn