超高壓對木瓜蛋白酶構象及酶活力的影響

劉　平，胡志和*，吳子健，薛　璐，王鳳玲

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津　300134）

超高壓對木瓜蛋白酶構象及酶活力的影響

劉平，胡志和*，吳子健，薛璐，王鳳玲

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134）

為研究超高壓對木瓜蛋白酶構象變化與酶活力的影響，本研究利用紅外光譜法和熒光光譜法對木瓜蛋白酶經超高壓處理后的結構變化及特定氨基酸微環境變化進行了分析。結果表明：與常壓相比，超高壓處理對木瓜蛋白酶活力均有顯著影響（P＜0.05）。其中，200 MPa、37 ℃、20 min處理時，酶活力在所選處理范圍內達到最大，較常壓下的酶活力提高了6.8%；紅外光譜結果表明：超高壓處理后，木瓜蛋白酶二級結構變化與酶活力變化相關性較差；熒光光譜結果顯示：200 MPa、37 ℃處理木瓜蛋白酶20 min，228 nm波長激發后木瓜蛋白酶的外源性熒光強度達到最低（2 023），熒光強度變化與酶活力變化規律有良好的相關性。因此，木瓜蛋白酶活性變化與疏水性氨基酸的暴露程度有關，暴露程度越小，酶活力越大。

高壓技術；木瓜蛋白酶；酶活力；空間構象；紅外光譜；熒光光譜

木瓜蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族中具有廣泛特異性的肽鏈內切酶。目前，關于木瓜蛋白酶的應用［1-2］，提取［3-4］以及其他方面［5-11］的研究不少。其活性部位存在于兩個結構域之間的裂縫。其中Cys25和His159分別在活性中心的兩邊，His159咪唑基一部分與Trp177形成疏水性區域，靠氫鍵與Asn175相連。根據其二級結構，兩個結構域分別主要由α-螺旋和β-折疊構成［12-14］。劉偉等［15］用動態高壓微射流處理木瓜蛋白酶，熒光光譜分析結果發現，木瓜蛋白酶中色氨酸殘基暴露出來，形成了較為穩定的新分子構象。王公軻等［16］研究了乙硫異煙胺與木瓜蛋白酶的分子作用機制，發現乙硫異煙胺與木瓜蛋白酶的相互作用不僅存在疏水作用，而且有氫鍵作用。張存瀅等［17］研究Hg2+和Cu2+對木瓜蛋白酶活性與構象的影響，發現木瓜蛋白酶分子構象的有序度與其活性成正相關。有關超高壓處理木瓜蛋白酶引發結構變化與酶活性之間關系研究鮮有報道。對于木瓜蛋白酶空間結構與酶活性關系的研究也不多。本實驗采用超高壓技術處理木瓜蛋白酶，用紅外光譜和熒光光譜分析處理后木瓜蛋白酶的空間結構變化，探討木瓜蛋白酶空間結構變化與酶活力之間的關系。為探究通過改變空間結構來提高木瓜蛋白酶活力提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1試劑

木瓜蛋白酶、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilinolnaphthalenesulfonic acid，ANS）美國Sigma公司；KBr（光譜級）上海化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

HPP.L2-800/2.5超高壓設備天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；DC-2030節能型智能恒溫槽、Scientz-50N冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀美國尼高力儀器公司；F-4600熒光光度計日立高新技術公司；VELP漩渦振蕩器德祥科技有限公司；PB-10 pH計德國賽多利斯（北京）有限公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3方法

1.3.1超高壓處理木瓜蛋白酶

將木瓜蛋白酶溶液（質量濃度為2.5 mg/mL，磷酸鹽緩沖液pH值為6.5）真空密封后，進行超高壓處理。選擇保壓時間20 min、溫度37 ℃，壓力分別為0.1、100、200、300、400、500、600 MPa，以常壓（0.1 MPa）條件下的酶溶液作為對照組。

1.3.2木瓜蛋白酶活力的測定［18］

超高壓處理后的木瓜蛋白酶溶液立即進行Folin-酚法檢測，每組3 個平行。酶活力計算如下。

式中：X為樣品的酶活力/（U/g）；A為由標準曲線得出的樣品最終稀釋液的酶活力/（U/mL）；V為溶解樣品所使用的容量瓶的體積/mL；4為反應試劑的總體積/mL；n為樣品的稀釋倍數；m為樣品的質量/g；10為反應時間/min。

1.3.3木瓜蛋白酶的紅外光譜掃描

取100 mg KBr壓片，采用傅里葉紅外光譜儀掃描，扣除背景后，取2 mg高壓處理后凍干樣品與100 mg KBr混合，壓片，掃描波長范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4木瓜蛋白酶的熒光光譜掃描

1.3.4.1木瓜蛋白酶的內源性熒光光譜

超高壓處理的木瓜蛋白酶緩沖溶液（0.1 mg/mL）分別在295 nm和280 nm波長處激發，掃描300～400 nm波長范圍內的發射光譜。狹縫寬度5 nm。

1.3.4.2木瓜蛋白酶的外源性熒光光譜

取超高壓處理的木瓜蛋白酶緩沖溶液（0.1 mg/mL） 4 mL，加入20 μL的ANS（5.0 mmol/L）。避光反應1 h后，228 nm波長激發，掃描310～420 nm波長范圍的發射光譜。狹縫寬度5 nm。

1.4數據統計分析

采用EZ OMNIC軟件分析紅外光譜的變化，實驗數據采用Origin 8.0作圖，SPSS 17.0軟件對實驗數據進行相關性分析。

2　結果與分析

2.1超高壓處理對木瓜蛋白酶活性的影響

圖1　37 ℃、20 min不同壓力處理對木瓜蛋白酶活力的影響Fig.1　Effect of different pressure treatments at 37 ℃ for 20 min on papain activity

由圖1可知，壓力對木瓜蛋白酶活力的影響較對照組（0.1 MPa）相比，變化顯著（P＜0.05）。在所選壓力范圍內（100～600 MPa）處理，酶活力逐漸增加隨后又降低。酶活力達到最大的壓力處理條件為200 MPa，37 ℃，20 min時，比常壓下提高了6.8%。這可能是因為超高壓改變了木瓜蛋白酶的部分空間構象，而這些空間構象影響木瓜蛋白酶的活力［19］。所以改變了木瓜蛋白酶的空間構象，也間接地影響了酶的活力大小。

2.2超高壓處理引發木瓜蛋白酶二級結構的變化與酶活力的關系

圖2　37 ℃、20 min不同壓力處理后木瓜蛋白酶的紅外光譜圖Fig.2　Infrared spectra of papain treated by different pressures at 37 ℃for 20 min

目前，紅外光譜是研究蛋白質二級結構的常用方法之一［20-21］。其中酰氨Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）是對蛋白質結構變化很敏銳的一個譜帶。1 600～1 639 cm-1被認為β-折疊結構，1 661～1 700 cm-1被指認為β-轉角結構，1 651～1 660 cm-1被認為α-螺旋結構；1 640～1 650 cm-1被指認為無規卷曲結構［22］。圖2是不同壓力處理后木瓜蛋白酶的紅外光譜圖；經EZ OMNIC軟件去卷積處理紅外圖譜后其二級結構的變化分析見表1。

表1　木瓜蛋白酶二級結構中-螺旋、-折疊、-轉角的峰面積x± 3）Table 1 Peak areas of -helix， -turn and -sheet in secondary structure of papain （x ， 3）

經SPSS分析，100～600 MPa處理后，木瓜蛋白酶二級結構（α-螺旋、β-轉角、β-折疊）部分峰面積變化較未處理的二級結構變化顯著（P＜0.05）。其中，α-螺旋峰面積大小呈先增大后減小的趨勢，并在300 MPa時峰面積達到最大值。低于或高于300 MPa，α-螺旋峰面積與酶活力大小成正相關（圖3）。說明α-螺旋峰面積在一定的壓力范圍內與木瓜蛋白酶酶活力有關。β-轉角峰面積先減小后增大，之后隨著壓力的持續增加趨于平穩；β-折疊的峰面積隨壓力的增加出現了波動；但從100～600 MPa整個壓力范圍來分析，β-轉角和β-折疊的變化趨勢與酶活力的變化趨勢相關性較差。由此說明，木瓜蛋白酶經過超高壓處理后，雖然不同的二級結構含量發生一定變化，但與酶活力的變化關系不大。

圖3　3　α-螺旋、-　β-折疊和-　β-轉角的峰面積與酶活力之間的關系Fig.3　Relationship between papain activity and peak areas of α-helix，β-turn and β-sheet

2.3高壓處理木瓜蛋白酶引發氨基酸微環境的變化與酶活力的關系

2.3.1木瓜蛋白酶的內源性熒光光譜分析

2.3.1.1295 nm波長處激發時木瓜蛋白酶的熒光光譜分析295 nm波長處激發時木瓜蛋白酶的熒光光譜見圖4。結合木瓜蛋白酶一級氨基酸序列［14］（表2）分析推測其有可能發生變化的氨基酸的位置。

圖4　295 nm激發波長不同高壓條件處理后木瓜蛋白酶的熒光光譜圖Fig.4　Fluorescence spectra of papain treated by different pressures at37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 295 nm

表2　木瓜蛋白酶序列Table 2　Amino acid sequence of papain

圖5　不同高壓條件處理后木瓜蛋白酶熒光強度與酶活力的關系Fig.5　Relationship between fluorescence intensity and papain activitytreated by different pressures at 37 ℃ for 20 min

由圖4可知，不同壓力（0.1～600 MPa）處理的木瓜蛋白酶，295 nm波長處激發后，其發射波長位移變化均在330～332 nm內。結合Burstern提出的色氨酸殘基微環境的特點［23］分析：即1）λmax=330～332 nm，埋藏在非極性區域內，2）λmax=340～342 nm，固定于蛋白質分子表面，且與水的接觸受到限制，3）λmax=350～352 nm，徹底暴露于水中（其中λmax為熒光發射光譜的峰位），所以處理前后的木瓜蛋白酶結構中色氨酸殘基埋藏在非極性區域內。在200～600 MPa處理后，與對照組（0.1 MPa）相比熒光強度變化顯著（P＜0.05），且熒光強度在逐漸變大。說明色氨酸的暴露程度隨壓力增加而增大。由其一級結構（表2），木瓜蛋白酶內部色氨酸共有5 個，分別位于第7、36、69、177和181位。極有可能是上述位置的色氨酸殘基的微環境發生了變化，分析其熒光強度變化與酶活力的關系（圖5），發現相關性較小。

2.3.1.2280 nm波長處激發時不同壓力處理的木瓜蛋白酶熒光光譜分析

圖6　280 nm激發波長不同高壓條件處理后木瓜蛋白酶的熒光光譜圖Fig.6　Fluorescence spectra of papain treated by different pressures at37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 280 nm

280 nm波長處激發時，不同壓力處理的木瓜蛋白酶熒光光譜見圖6。100～600 MPa處理的木瓜蛋白酶熒光強度與對照組（0.1 MPa）相比變化顯著（P＜0.05）。說明隨壓力漸變，木瓜蛋白酶內部Trp和Tyr微環境也處于漸變的狀態。但隨壓力變化，木瓜蛋白酶熒光強度呈現先升高又降低的反復性變化，可見隨著壓力不同程度的改變，Trp和Tyr二者或各自暴露，掩埋或同時暴露掩埋，亦或一種暴露另外一種掩埋。但二者所表現出來的總的熒光強度變化沒有呈現良好的規律性，且其變化與酶活力的相關性較小（圖5）。根據其一級結構分析，在其結構中的212 個氨基酸內，共有5 個Trp和18 個Tyr，共占氨基酸總數的10%，但其表現出來的最大熒光強度比未經高壓處理的熒光強度提高122%。

2.3.2木瓜蛋白酶的外源性熒光光譜分析

圖7　228 nm波長激發不同高壓條件處理后木瓜蛋白酶的熒光光譜圖Fig.7　Fluorescence spectra of papain treated by different pressures at 37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 228 nm

木瓜蛋白酶經不同壓力處理后，加入熒光探針ANS［24］，研究高壓對木瓜蛋白酶表面疏水性的影響。選擇228 nm波長處激發，其熒光光譜見圖7。228 nm波長處激發，不同超高壓處理的木瓜蛋白酶熒光強度與對照組（0.1 MPa）相比變化顯著（P＜0.05），說明高壓處理后木瓜蛋白酶內疏水氨基酸的微環境發生了顯著變化。100～600 MPa處理后，其熒光強度呈先下降后增加的趨勢，說明在超高壓處理的過程中，疏水氨基酸有部分掩埋和暴露。在200 MPa時，疏水氨基酸熒光強度最小（2 023），比對照組（0.1 MPa）的熒光強度降低了52%。根據木瓜蛋白酶一級結構，其中疏水性氨基酸共74 個，占所有氨基酸總數的34.9%。根據Lim［25］規則，在一級結構中的第1～5，12～16，26～30，27～31，28～32，30～34，34～38，68～72，71～75，72～76，130～134，132～136，133～137，134～138，148～152，157～161，160～164和168～172位置極易在空間形成疏水結構。推測不同高壓條件處理后，可能是上述位置的氨基酸微環境發生變化。研究其變化與酶活力的關系（圖5）發現，疏水性氨基酸的暴露程度與酶活力有很好的相關性，二者同時在200 MPa時達到極值，酶活力最大為20 411 U/g；熒光強度最小為2 023。因此，疏水氨基酸的暴露程度與酶活力大小有關。疏水氨基酸殘基的暴露程度越小，酶活力越大。

3　結 論

高壓會改變木瓜蛋白酶的二三級結構，并影響其酶活力大小。其中，高壓后木瓜蛋白酶的二級結構呈波動性變化，但其變化與木瓜蛋白酶酶活力大小之間沒有顯著的相關性。對于木瓜蛋白酶的三級結構，其表面疏水性氨基酸的暴露程度與木瓜蛋白酶酶活力大小具有一定的相關性，可能高壓處理所改變的疏水氨基酸的空間位置與酶活性中心的構象有關，高壓后疏水氨基酸的暴露程度越小，酶活力越大。

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Effect of Ultra High Pressure Treatment on the Conformation and Enzyme Activity of Papain

LIU Ping， HU Zhihe*， WU Zijian， XUE Lu， WANG Fengling
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， School of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin300134， China）

In order to examine the impact of ultra high pressure （UHP） on the enzyme activity and conformational change of papain， infrared spectroscopy and fluorescence spectroscopy were used to analyze structural and specific amino acid changes in UHP-treated papain. The results showed that compared with untreated sample， UHP treatments at various pressure had a significant effect on papain activity （P ＜ 0.05）. After being treated with 200 MPa， at 37 ℃ for 20 min， the activity of papain reached the maximum level， indicating a 6.8% increase compared with the untreated one. The infrared spectroscopic showed that there was a poor relationship between papain activity and conformation. The fluorescence spectroscopic analysis suggested that the exogenous fluorescence intensity of papain treated with 200 MPa at 37 ℃ for 20 min reached the minimum level （2 023） at an excitation wavelength of 228 nm. There was an excellent correlation between papain activity and fluorescence intensity. Therefore， papain activity was negatively related to the exposure degree of hydrophobic amino acids.

high-pressure technology； papain； enzyme activity； spatial conformation； infrared spectroscopy； fluorescence spectroscopy

Q71

A

1002-6630（2015）23-0023-05

10.7506/spkx1002-6630-201523005

2015-03-18

國家自然科學基金面上項目（31271841）；天津市高等學校創新團隊項目（TD12-5049）

劉平（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：liuping0402@126.com

胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向為專用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn