大米鎘結合蛋白的分離及理化特性

劉珊珊，陳季旺，2，*，陳　露，丁文平，2，吳永寧，3

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢　430023；2.農產品加工湖北省協同創新中 心，湖北 武漢　430023；3.國家食品安全風 險評估中心，北京　100021）

大米鎘結合蛋白的分離及理化特性

劉珊珊1，陳季旺1，2，*，陳露1，丁文平1，2，吳永寧1，3

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢430023；2.農產品加工湖北省協同創新中 心，湖北 武漢430023；3.國家食品安全風 險評估中心，北京100021）

本實驗選用一種鎘含量較高的大米為原料，采用堿法提取大米蛋白（alkali-extractable protein，AP），依次用熱變性和乙醇沉淀分離AP，制備大米鎘結合蛋白（rice Cd-binding protein，RCBP），并分析了RCBP的紫外吸收特征、氨基酸組成、分子質量及二級結構。結果顯示：AP、熱變性蛋白（thermally denaturated protein，TP）和乙醇沉淀蛋白（ethanol-precipitated protein，EP）均在210 nm波長處有最大吸收峰，氨基酸組成類似；熱變性去除了分子質量為94 kD的蛋白質，分子質量為5 094 kD的蛋白質含量減少，乙醇沉淀進一步減少了分子質量分別為50 kD和14 kD的蛋白質。AP的二級結構主要為α-螺旋和β-轉角，有少量β-折疊；TP的二級結構只含有β-折疊和β-轉角，且以β-折疊為主；EP的二級結構主要為β-折疊和β-轉角，還含有少量α-螺旋和無規卷曲。表明熱變性和乙醇沉淀使得AP中的鎘結合蛋白得到分離，可以作為一種分離RCBP的方法。

大米鎘結合蛋白；熱變性；乙醇沉淀；理化性質

鎘（Cd）具有極大的毒性和致突變性，為環境污染物，由于其易在人體內蓄積且半衰期長達10～30 a，已被美國毒物管理委員會列為第6位危及人類健康的有毒物質［1］。鎘污染的食物、水、空氣，經消化道和呼吸道進入人體并積累，引起慢性中毒，引起腎機能衰退、骨質疏松［2］。鎘的生物有效性［3-5］及在生物體的暴露與積累［6-7］等已受到國內外的普遍關注。大米作為我國大部分地區主要主食之一，應作為重點監測對象，需嚴格控制其鎘含量［8］。因此，研究大米中重金屬鎘具有重要意義。

國內外對金屬鎘與不同來源的蛋白質結合形成的鎘結合蛋白［9-14］已有很多研究，大部分研究集中于含有豐富的巰基、能螯合大量金屬離子［15］的金屬硫蛋白。特別是有關海洋動物［16-19］、昆蟲［20］、小鼠［21］以及植物亞麻籽［22］等中的金屬硫蛋白的報道較多，其研究方法已比較成熟。但有關大米鎘結合蛋白（rice Cd-binding protein，RCBP）的研究報道較少。楊居榮等［23］對污染區稻、麥籽實中鎘的存在形態進行了相關分析，指出在稻、麥籽實主要營養成分中，以鎘與蛋白質相結合的形態為主，同時鎘更易與這2 種谷物的球蛋白和清蛋白結合。該研究只報道了鎘分布位置，尚未明確分析鎘與大米蛋白的結合機制及鎘結合蛋白的理化性質。為了研究RCBP的相關理化性質及結合機理，首先需要研究一套提取分離RCBP的方法。并且，有關RCBP分離、理化性質及形成機理等的研究還未見報道，因此研究RCBP的分離及理化性質具有現實意義。

本實驗選用一種鎘含量較高的大米為原料，采用堿法提取大米蛋白（alkali-extractable protein，AP）、熱變性和乙醇沉淀依次分離AP制備RCBP，并分析RCBP的紫外吸收特征、氨基酸組成、分子質量分布及二級結構，初步判斷大米鎘結合蛋白的類型，為進一步研究RCBP的形成機理奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

秈米X9（鎘含量157 μg/kg，蛋白質含量6.86 g/100 g，水分含量14.55 g/100 g，以濕質量計）購于武漢市武商量販常青花園店。

鎘標準儲備液國家有色金屬及電子材料分析測試中心；β-巰基乙醇成都科龍化工試劑廠；蛋白質分子質量標準品武漢楚誠正茂科技工程有限公司；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒武漢市碧云天生物科技研究所；硝酸、雙氧水、硫酸、三羥甲基氨基甲 烷（Tris）、SDS、溴酚藍、考馬斯亮藍R-250、無水乙醇國藥集團化學試劑有限公司；硝酸、硫酸、高氯酸為優級純，其余試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

TAS-990原子吸收分光光譜儀（配GFH-990石墨爐）、鎘空心陰極燈北京普析通用儀器有限公司；DELTA 320 pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RE-52C 型旋轉蒸發儀鞏義市英峪予華儀器廠；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵鄭州長城科工貿公司；TGL-16C高速離心機上海安亭科學儀器有限公司；PerkinElmer Lambda 25紫外可見分光光度計美國珀金埃爾默公司；Bio-Rad Mini-PROTEAN-3電泳儀（配電泳槽）美國Bio-rad公司；NEXUS 670型傅里葉變換紅外光譜儀美國尼高力儀器公司。

1.3方法

1.3.1堿法提取大米蛋白

參考陳季旺等［24］的方法并加以改進。大米樣品經超微粉碎機粉碎，過80 目篩。稱取20 g大米粉于500 mL的燒杯中，加入120 mL 質量分數1%的NaOH溶液，攪拌混勻，常溫浸提1 h，然后用質量分數1%的NaOH調pH值至11，40 ℃磁力攪拌水浴鍋中浸提2 h（攪拌速率為120 r/min），提取液4 000 r/min離心10 min，得上清液（AP）100 mL。

1.3.2RCBP分離

參考徐振彪等［25］提取玉米金屬硫蛋白的方法。取100 mL AP于100 ℃水浴加熱5 min，4 ℃、7 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，得到上清液即熱變性蛋白（thermally denaturated protein，TP）；TP中加入3 倍體積預冷的無水乙醇，攪拌混勻后置于-20 ℃過夜沉淀，4 ℃ 7 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，40 ℃條件下旋轉蒸發上清液除去變性劑乙醇，得乙醇沉淀蛋白（ethanolprecipitated protein，EP）。

1.3.3鎘含量測定

參考袁秀金等［8］的方法。將1 g待測大米和樣品（AP、TP、EP）經硝酸、過氧化氫和3～5 滴硫酸消化后用石墨爐原子吸收分光光譜儀測定其中鎘的含量。

1.3.4蛋白質含量測定

采用GB5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中的半微量凱氏定氮法，轉換系數F為5.95。

1.3.5RCBP紫外掃描

采用硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液（pH 10）配制質量濃度為1 mg/mL的AP、TP、EP各1 mL，備用。開機預熱10 min，掃描的波長范圍為190～450 nm，以硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液（pH 10）為空白校正液，加入樣品，關上暗箱，點擊“掃描”；掃描完成后，加入下一個樣品。

1.3.6氨基酸組成分析

分別量取一定體積的AP、TP、EP（相當于1 g大米）于玻璃試管中，加入15 mL 6 mol/L HCl，試管抽真空，充氮氣封管，置于108 ℃恒溫干燥箱內水解24 h，待冷卻后，過濾，定容至100 mL，吸取濾液20 μL于40 ℃真空干燥器中進行干燥，用0.2 mol/L HCl定容至1 mL。采用氨基酸分析儀測定各樣品中氨基酸含量。

1.3.7SDS-PAGE分析

取蛋白質質量濃度均為6.78 mg/mL的AP、TP、EP各80 μL分別于1.5 mL離心管中，加入5×SDS的上樣緩沖液20 μL，混勻，沸水浴10 min。采用質量分數12%分離膠、質量分數5%濃縮膠、1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH 8.3），將10 μL樣品注入樣品池，電壓先調到60 V，40 min后改為110 V，待指示劑溴酚藍跑至膠邊緣時停止電泳。剝膠，用0.1%考馬斯亮藍R-250染色4 h，用10%醋酸-5%乙醇洗脫液脫色，直至蛋白條帶清晰［26］。

1.3.8傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析

參考Ferreira等［27］的方法并加以改進。用脫脂棉蘸取無水酒精將研缽、鑷子、壓片等用具擦試干凈，放在紅外燈下照射以使酒精快速揮發干燥。在研缽中加入適量KBr粉末，按照約1∶100的質量比例加入樣品，充分研磨混勻，壓片，壓片盡量薄而透明，以保證較高的透光率。用傅里葉變換紅外光譜儀測定紅外吸收光譜圖，以KBr粉末作為空白背景，設定分辨率4 cm-1，掃描次數為16 次，進行全波長（4 000～500 cm-1）掃描。

2　結果與分析

2.1AP、TP、EP中蛋白質和鎘含量及損失率

表1　AP、TP和EP中蛋白質和鎘含量及損失率Table 1 Contents of protein and Cd， and loss rates of AP， TP， and EP

由表1可知，堿法提取的AP依次進行加熱變性、乙醇沉淀處理后，TP、EP中的蛋白質和鎘含量均逐漸減少，但減少的幅度不同。熱變性處理后蛋白質損失率為9.63%，鎘損失僅有1.44%，說明熱變性去除了不耐熱的雜蛋白，使得目標蛋白的純度得到初步提高；另外，高速離心過程也能起到去除一些非蛋白類物質（如少量不溶性淀粉等）。TP經乙醇沉淀后蛋白質損失14.16%，鎘則損失39.40%，這可能是由于乙醇沉淀去除雜蛋白的同時對鎘結合蛋白的結構也有一定的破壞，使得部分鎘從鎘結合蛋白上脫落，造成較大程度的損失，但大部分鎘（60.6%）仍存在于EP中。因此，采用熱變性和乙醇沉淀依次分離堿法提取AP中的結合蛋白，能實現鎘結合蛋白的富集，可以作為分離RCBP的一種方法。

2.2AP、TP、EP中蛋白溶液的紫外掃描圖

對AP、TP、EP溶液進行紫外掃描實驗，觀察3 種蛋白質在紫外光區光吸收值的變化，結果見圖1。掃描AP、TP、EP溶液得到的吸收峰均分布在200～220 nm之間，其中，AP在210 nm波長左右吸收峰最高，TP、EP峰值依次降低，峰型依次變弱。這與2.1節中蛋白質含量逐漸降低的結果一致，進一步說明依次熱變性和乙醇沉淀去除了AP中的雜蛋白，鎘結合蛋白得到了分離。

圖1　AP、TP和EP的紫外光譜掃描曲線Fig.1　UV ab　sorption spectra of AP， TP and EP

2.3氨基酸組成分析結果

表2　AP、TP和EP的氨基酸組成Table 2　Amino acid composition of AP， TP and EP

由表2可知，與AP相比，TP中甘氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、精氨酸和谷氨酸含量增加，而苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、組氨酸和脯氨酸含量減少，含硫氨基酸含量增加2.38 g/100 g pro，芳香族氨基酸含量減少0.89 g/100 g pro，帶電荷氨基酸含量減少1.52 g/100 g pro，疏水性氨基酸含量增加0.10%；與TP相比，EP中天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸含量增加，苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、組氨酸、甲硫氨酸含量減少。含硫氨基酸含量增加0.01 g/100 g pro，芳香族氨基酸含量減少1.89 g/100 g pro，帶電荷氨基酸含量增加0.71 g/100 g pro，疏水性氨基酸含量減少2.86 g/100 g pro；與AP相比，EP中含硫氨基酸含量增加2.39 g/100 g pro，芳香族氨基酸含量減少2.78 g/100 g pro，帶電荷氨基酸含量減少0.81 g/100 g pro，疏水性氨基酸含量減少2.76 g/100 g pro。由表2還可知，AP、TP、EP帶電荷氨基酸含量最高，大于43 g/100 g pro，疏水性氨基酸次之，約為30 g/100 g pro，芳香族氨基酸為10 g/100 g pro左右，含硫氨基酸約占5 g/100 g pro。

AP經熱變性和乙醇沉淀處理后，半胱氨酸和甲硫氨酸含量有少許增加，但含量很低（2%）。然而，AP、TP、EP中帶電荷氨基酸和疏水性氨基酸含量均較高，初步推斷RCBP可能是一類富含帶電荷氨基酸或疏水性氨基酸的鎘結合蛋白。

2.4SDS-PAGE分析結果

圖2　AP、TP和EP的SDS-PAGEE圖譜Fig.2　SDS-PAGE patterns of AP， TP and EP

由圖2可知，AP的分子質量分布在94、50、32、16 、14 kD處，TP的分子質量分布在50、32、16 、14 kD處，EP的分子質量分布在32 kD和16 kD處。從AP、TP到EP，蛋白質條帶數量逐漸減少、條帶顏色變淺，熱變性去除了分子質量為94 kD的蛋白質、減少了分子質量為50 kD的蛋白質，乙醇沉淀進一步去除了部分分子質量為50 kD和14 kD的蛋白質。EP中只有2 個條帶，可能是2 種不同分子質量的蛋白質或1 種含有兩個亞基的蛋白質。

由于大米中清蛋白和球蛋白的分子質量較低，因此，推斷鎘是與大米中低分子質量的清蛋白或球蛋白結合形成鎘結合蛋白，這與楊居榮等［23］的結果類似。

2.5FTIR分析結果

采用FTIR分析AP、TP、EP的二級結構，結果見圖3。采用軟件Omnic 8.0對FTIR光譜圖去卷積處理，再用軟件Peakfit v4.1對去卷積曲線進行擬合、積分，得擬合峰面積，結果見表3。

圖3　AP、TP、EP傅里葉變換紅外光譜Fig.3　FTIR spectra of AP， TP and EP

表3　AP、TP和EP中N—H相對于C=O構型峰面積Table 3 Peak area of N-H relative to C=O in AP， TP and EP from FTIR spectra

由表3及圖3可知，AP在波數1 545.31 cm-1處有吸收峰，峰面積為274.39；TP在波數1 555.00 cm-1及1 446.95 cm-1處有吸收峰，峰面積分別為169.03和124.84；EP在波數1 560.96 cm-1及1 440.51 cm-1處有吸收峰，峰面積分別為107.83和41.37。AP中N—H相對于C=O只以反式構型形式存在，TP和EP中N—H相對于C=O主要以反式構型形式存在，且TP中N—H相對于C=O反式構型和順式構型的含量均高于EP。說明熱變性使得AP中部分N—H相對于C=O的反式構型轉變成順式構型，乙醇沉淀則破壞了TP中部分N—H相對于C=O構型。

表4　AP、TP、EP在不同紅外光譜波數區間的二級結構峰面積Table 4　Peak areas of secondary structures of AP， TP and EP from FTIR spectra tra

采用軟件Omnic 8.0對FTIR光譜圖去卷積處理，再用軟件Peakfit v4.1對去卷積曲線進行擬合、積分，得二級結構的峰面積見表4。AP中α-螺旋的峰面積為326.36，β-折疊的峰面積為99.28，β-轉角的峰面積為224.35；TP中β-折疊的峰面積為192.31，β-轉角的峰面積為99.94；EP中α-螺旋的峰面積為32.28，β-折疊的峰面積為234.76，β-轉角的峰面積為298.93，無規卷曲的峰面積為44.96。說明AP的二級結構以α-螺旋和β-轉角為主，還含有少量β-折疊；T P的二級結構只含有β-折疊和β-轉角，且以β-折疊為主；EP的二級結構則以β-折疊和β-轉角為主，還含有少量α-螺旋和無規卷曲。

與AP相比，TP中的α-螺旋和β-轉角含量減少，β-折疊增加；與TP相比，EP中α-螺旋、β-折疊和β-轉角含量均增加，其中β-轉角含量增加最多，另有少量的無規卷曲形成。因此，熱變性破壞了部分α-螺旋，增加了β-折疊，即熱變性使部分α-螺旋轉變成β-折疊，這與Xie Ling等［28］研究熱變性 影響葡萄球菌核酸酶結構的結論類似；α-螺旋和β-折疊是蛋白質中具有高度穩定性的二級結構，是2 種有序的蛋白質二級結構；而β-轉角和無規卷曲則是2 種無序的蛋白質二級結構［29］，乙醇沉淀使得TP中某些被熱變性破壞的二級結構重新形成，但形成的主要是不穩定的無序的二級結構。

3　結 論

采用熱變性和乙醇沉淀去除了AP中的大部分雜蛋白及非蛋白物質，達到了富集鎘結合蛋白的目的，可以作為分離RCBP的一種方法。

經熱變性和乙醇沉淀分離得到的RCBP可能是一類富含帶電荷氨基酸或疏水性氨基酸的鎘結合蛋白，分子質量主要分布在32 kD和16 kD左右。

熱變性使AP中部分α-螺旋轉變成β-折疊，而乙醇沉淀使得TP中某些 被熱變性破壞的二級結構重新形成，但形成的主要是不穩定的無序的二級結構。

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Separation and Physicochemical Characteristics of Cd-Binding Protein in Rice

LIU Shanshan1， CHEN Jiwang1，2，*， CHEN Lu1， DING Wenping1，2， WU Yongning1，3
（1. College of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan430023， China；2. Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products， Wuhan430023， China；3. China National Center for Food Safety Risk Assessment， Beijing100021， China）

Rice Cd-binding protein （RCBP） was obtained from high-Cd rice using alkali extraction， thermal denaturation and ethanol precipitation. Physicochemical characteristics including UV absorbance， amino acid composition， molecular weight and secondary structures were investigated. The results showed that all the alkali-extractable protein （AP）， thermally denaturated protein （TP） and ethanol-precipitated protein （EP） had the maximum absorption peak at 210 nm and similar amino acid composition. The 94-kD protein was completely removed and the 5 094-kD protein was decreased by the thermal denaturation. Moreover， the ethanol precipitation resulted in a further reduction of the 50-kD and 14-kD proteins. The major secondary structures of AP were α-helical and β-turn， while β-sheet and β-turn were found in TP. On the other hand， β-sheet and β-turn were predominant in EP. These results indicated that thermal denaturation and ethanol precipitation could be used to separate RCBP from AP.

rice Cd-binding protein； thermal denaturation； ethanol precipitation； physicochemical characteristic

TS254.4

A

1002-6630（2015）23-0100-05

10.7506/spkx1002-6630-201523019

2015-04-02

糧食公益性行業科研專項（201513006）；武漢輕工大學重大項目培育專項（2011Z05）；武漢市國際合作項目（201231234466）；湖北省自然科學基金項目（2014CFB888）；武漢輕工大學研究生創新基金項目（2012cx012；2013cx011）

劉珊珊（1988—），女，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：ashleyss@163.com

陳季旺（1970—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jiwangchen1970@126.com