梅香魚發(fā)酵菌株的篩選及對品質(zhì)的影響

朱雯娟，安俊瑩，張雪梅，劉　穎*，孫力軍，王雅玲，劉喚明

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實驗室，廣東 湛江 524088）

梅香魚發(fā)酵菌株的篩選及對品質(zhì)的影響

朱雯娟，安俊瑩，張雪梅，劉穎*，孫力軍，王雅玲，劉喚明

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實驗室，廣東 湛江 524088）

為有效控制產(chǎn)品的品質(zhì)，從自然發(fā)酵的梅香魚中分離篩選適合作為發(fā)酵劑的菌株，并研究不同菌種之間的配比對發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，篩選出的嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）及腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）符合發(fā)酵要求。與單菌株發(fā)酵及未接菌的對照組相比，3株菌制得的混合發(fā)酵劑（比例為1∶1∶1）制備的發(fā)酵魚感官上總體可接受程度最優(yōu)，其咀嚼性和彈性也最高，并且組胺和揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的產(chǎn)生得到了有效抑制。該研究可為實現(xiàn)定向接種、人工控制以及規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

梅香魚；發(fā)酵；菌株篩選；品質(zhì)

發(fā)酵魚是一種具有獨(dú)特的風(fēng)味與口感以及良好耐貯性的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，受到中國、日本、朝鮮等亞洲人民的喜愛。由于乳酸菌、微球菌、霉菌、酵母菌等微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醛類、酮類、烯烴類等芳香代謝物質(zhì)［1-3］，賦予了發(fā)酵食品特殊的風(fēng)味與色澤［4-5］，甚至有的微生物還可以產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素及過氧化氫等抑菌物質(zhì)，從而抑制了食品腐敗菌和致病菌的產(chǎn)生［6-9］。不同類型的微生物發(fā)酵產(chǎn)品具有各自的特點(diǎn)，Gelman等［10］利用戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進(jìn)行混合發(fā)酵，發(fā)酵的腌鮪魚不僅表現(xiàn)出多汁的質(zhì)構(gòu)風(fēng)味，而且腐敗菌的生長得到了很好抑制，有效地延長了貨架期。Riebory等［11］用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和葡萄球菌BT52（Staphylococcus BT52）在30 ℃條件下混合發(fā)酵黃笛鯛，不僅縮短了生產(chǎn)周期，而且增加了魚肉的彈性、咀嚼性，明顯改善了魚的質(zhì)構(gòu)和口感。用于接種發(fā)酵的微生物通常是從傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中分離優(yōu)勢微生物這一策略獲得的［12-13］。梅香魚（又名酶香魚）是廣東、福建等氣溫較高地區(qū)的一種鹽漬自然發(fā)酵制品，由于在鹽漬過程中利用魚體內(nèi)源酶類的自溶作用以及微生物的發(fā)酵作用，產(chǎn)生復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，最終形成特殊的梅香氣味而得名［14-15］。本研究從自然發(fā)酵的梅香魚中篩選分離出適合作為發(fā)酵劑的微生物，繼而研究不同菌種之間的配比對發(fā)酵產(chǎn)品的影響。為實現(xiàn)定向接種、人工控制以及規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

梅香魚，購于廣東省湛江市東風(fēng)市場。

MRS固體培養(yǎng)基英國Oxoid公司；GAM（gifu anaerobic medium）固體培養(yǎng)基、GAM半流動培養(yǎng)基、GAM液體培養(yǎng)基日本日水制藥株式會社；TSA（trypticase soy agar）固體培養(yǎng)基美國BD公司；組胺試劑盒日本Kikkoman公司。

1.2儀器與設(shè)備

HORIBA B-211小巧型pH計、HORIBA B-721鹽度計日本Horiba公司；RE2-33005S流變儀日本Yamaden公司；AquaLab Series 3高精確度臺式水分活度測定儀美國AquaLab公司；IUL Masticator均質(zhì)器西班牙IUL公司。

1.3方法

1.3.1菌種的分離純化

無菌稱取25 g梅香魚裝入均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，高速均質(zhì)30 s，過濾取上清液，采用平板涂布法，分別接種于MRS、GAM和TSA培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h。挑取形態(tài)特征不同的菌落，反復(fù)純化，并通過革蘭氏染色、顯微鏡觀察直至得到純的培養(yǎng)物。將革蘭氏陽性菌株接種到GAM斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，置4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2發(fā)酵菌株的確定

通常適合作發(fā)酵的菌株應(yīng)滿足不產(chǎn)生生物胺、過氧化氫酶實驗呈陽性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣、耐鹽，并具有良好的抗菌活性［16-17］。抗菌活性采用紙片擴(kuò)散法［18］，其他指標(biāo)測定采用《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［19］方法。

1.3.3發(fā)酵菌株的16S rDNA鑒定

采用27 F與1492 R細(xì)菌通用引物作為正反向引物，利用MightyAmp DNA Polymerase進(jìn)行細(xì)菌菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增［20］，反應(yīng)體系：Eubac 27 F（10 μmol/L）1.5 μL，Eubac 1492 R（10 μmol/L） 1.5 μL，MightyAmp DNA Polymerase 1.5 μL，2×MightyAmp Buffer 30 μL，ddH2O 25.5 μL；反應(yīng)條件：98 ℃（預(yù)變性）2 min，98 ℃（變性）10 s，55 ℃（復(fù)性）15 s，68 ℃（延伸）90 s，72 ℃（延伸）10 min，從變性到第一次延伸這個過程循環(huán)40 次。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物寄送上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州實驗室進(jìn)行序列測定。根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果，利用DDBJBLAST搜 索程序從GenBank進(jìn)行同源性檢索，并下載相似性高的模式菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行分析。

1.3.4發(fā)酵菌株在不同溫度下的生長曲線測定

將發(fā)酵菌株分別接種于GAM液體培養(yǎng)基中，并分別在10、20、30 ℃溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔4 h測定OD600nm，直至達(dá)到微生物生長穩(wěn)定期，記錄不同溫度下所需要的時間，選取適合發(fā)酵的溫度和時間。

1.3.5接種發(fā)酵實驗

選取表面光澤、新鮮、體質(zhì)量約120 g的沙丁魚25 條，去腮、去內(nèi)臟，用清水洗凈表面和內(nèi)部血污，瀝干水分。按m（魚）∶m（鹽）=5∶1的比例添加食鹽，均勻涂布于魚體的表面和魚肚內(nèi)部，并平整堆疊在合適容器中，保鮮膜封口，10 ℃條件下腌制，過夜取出。將25 條魚隨機(jī)分成5 組，將適合發(fā)酵的菌株各自配制成107CFU/mL菌懸液進(jìn)行單獨(dú)接種，同時等比例混合發(fā)酵菌株后進(jìn)行接種，以不接菌作空白對照。接種量2%，并采用噴灑方式接入到腌制的魚體中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度與時間按1.3.4節(jié)確定的溫度與時間。

1.3.6發(fā)酵魚感官評定

挑選10 位有食品感官評定經(jīng)驗的評定者，對自然發(fā)酵的和人工接種發(fā)酵劑的發(fā)酵魚制品的外觀、氣味、滋味、口感進(jìn)行評定，滿分為10 分，各因素的權(quán)重按層次分析法確定［21］，評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Meixiang fish

1.3.7理化指標(biāo)測定

發(fā)酵后的魚用絞肉機(jī)絞碎，稱取一定量用于理 化指標(biāo)測定。水分活度：ERH水分活度測試法；pH值：pH計法；鹽度：鹽度計法；組胺：按照組胺試劑盒中操作說明進(jìn)行檢測；亞硝酸鹽：采用美國化學(xué)師協(xié)會的比色法［22］；揮發(fā)性鹽基氮：采用GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》［23］中的微量擴(kuò)散法。

1.3.8質(zhì)構(gòu)測定

采用裝有一個圓柱形柱塞（5 mm直徑）的流變儀測定發(fā)酵沙丁魚的物理強(qiáng)度。取主骨附近的魚肉，剪取約10 mm×10 mm×10 mm的正方體魚肉，柱塞以魚肉中心為軸，以1 mm/s的速率平行插入魚肉中。測定魚肉發(fā)生形變時的距離和力度。每一樣品測試3次，取測量的平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.9大腸菌群及致病菌的檢測

大腸菌群的測定采用GB/T 4789.3—2010《食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》［24］方法。

沙門氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌檢測根據(jù)GB 29921—2013《食品中致病菌限量》［25］中水產(chǎn)制品致病菌檢測方法進(jìn)行檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種的分離純化及發(fā)酵菌株的鑒定

采用MRS、GAM和TSA培養(yǎng)基從梅香魚中分離純化得到158 株菌，其中G+菌株95株。進(jìn)一步發(fā)酵菌株篩選實驗，符合過氧化氫酶陽性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、可耐受20% NaCl、不產(chǎn)生組胺、且對大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有明顯抑制作用的菌株共3 株（菌株1～3），菌株1在MRS培養(yǎng)基的菌落濕潤黏稠、易挑取、表面光滑呈較透明的白色、質(zhì)地均勻，且邊緣與中央部位顏色一致；菌株2的菌落不透明、呈白色、扁形、表面較濕潤、菌落邊緣光滑；菌株3圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、不透明。顯微觀察3 株菌均為球狀，排列成對、四聯(lián)或成片。

對3 株菌株進(jìn)行16S rDNA測序，經(jīng)Blast在線比對得知，菌株1與嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）相似度高達(dá)99%，菌株2與木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）有96%的相似度，疑似潛在新種。菌株3與腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）有99%的相似。將序列提交至NCBI，編號分別是Tetragenococcus halophilus strain CAMT 20661，登錄號是KP 845287，Staphylococcus xylosus strain CAMT 29661，登錄號是KP 845286，Staphylococcus saprophyticus strain CAMT 29662，登錄號是KP 845285。

2.23 株菌在不同發(fā)酵溫度條件下的生長規(guī)律

圖1　3 株菌在不同溫度下的生長曲線Fig.1　Growth curves of three selected bacteria at different temperatures

3 株菌在10、20、30 ℃的生長曲線見圖1。嗜鹽四聯(lián)球菌在10 ℃培養(yǎng)時，8 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，84 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在20和30 ℃條件下均在4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，20 ℃時在44 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，30 ℃時在40 h后達(dá)到穩(wěn)定期，見圖1a；木糖葡萄球菌在10 ℃時進(jìn)入對數(shù)生長期的時間8 h，84 h后達(dá)到穩(wěn)定期，20 ℃和30 ℃時均在4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，40 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，見圖1b；腐生葡萄球菌在10、20、30 ℃下進(jìn)入對數(shù)生長期的時間依次是8、4、4 h，達(dá)到穩(wěn)定期的時間依次是88、40、36 h，見圖1c。3 株菌在20 ℃與30 ℃培養(yǎng)條件下進(jìn)行入穩(wěn)定期的時間差異不大，最大差僅8 h，但在10 ℃時進(jìn)入穩(wěn)定期卻比20、30 ℃的時候至少推遲了 40 h。一般溫度高發(fā)酵菌株生長快，生產(chǎn)周期短，但溫度高不利于風(fēng)味的保留，低溫雖然能很好地保留風(fēng)味，但是發(fā)酵周期長［26］，所以綜合考慮，選擇20 ℃為最佳發(fā)酵溫度，44 h為最佳發(fā)酵時間。

2.3感官特性評價

對不同實驗組發(fā)酵魚的外觀、氣味、滋味和口感4 個指標(biāo)進(jìn)行感官評價，結(jié)果見圖2。從雷達(dá)圖中可以看出，5 組發(fā)酵魚制品外觀無顯著性差異，均為8 分；氣味方面，混合發(fā)酵劑實驗組9 分，明顯高于其他實驗組，空白對照組的氣味評分最低（5 分）；滋味和口感指標(biāo)方面，混合發(fā)酵劑實驗組的魚制品均優(yōu)于其他實驗組。綜合結(jié)果，混合發(fā)酵劑發(fā)酵魚制品具有較高的總體可接受性（8.94 分），嗜鹽四聯(lián)球菌發(fā)酵的魚制品次之（7.06 分），木糖葡萄球菌和腐生葡萄球菌發(fā)酵的魚制品差別不大，分別為6.67 分和6.38 分，空白對照組發(fā)酵魚制品最低（4.79 分）。

圖2　5 種發(fā)酵魚制品感官評價得分雷達(dá)圖Fig.2　Radar map of four fermented fish samples and unfermented fish

2.4理化特性評價

5 組實驗發(fā)酵魚鹽分、TVB-N、組胺和亞硝酸鹽等主要成分含量的測定結(jié)果見表2。單菌株和混合菌株發(fā)酵的魚制品的pH值均比空白對照組的低，說明這3株菌均具有一定的產(chǎn)酸能力；亞硝酸鹽在 5 組實驗發(fā)酵魚中均未檢測出；混合發(fā)酵劑實驗組和單菌株發(fā)酵實驗組的組胺與TVB-N含量相差不大，但均明顯低于空白對照組組胺（2.48 mg/kg）和TVB-N含量（46.8 mg/100 g），說明這3株菌在發(fā)酵過程可能產(chǎn)生了有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)，從而有效地抑制了腐敗菌的產(chǎn)生，阻礙了組胺與TVB-N的產(chǎn)生。且混合菌株發(fā)酵的魚制品中的組胺含量（0.19 mg/kg）和TVB-N含量（20.8 mg/100 g）遠(yuǎn)低于GB 2733—2005《鮮、凍動物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中的規(guī)定（組胺含量≤30 mg/100 g；TVB-N含量≤30 mg/100 g）。

表2　發(fā)酵魚制品pH值、水分活度及主要成分含量Table 2 pH， water activity and major components in fermented fish products

2.5質(zhì)構(gòu)分析

表3　不同發(fā)酵劑制得的發(fā)酵魚制品質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果Table 3 Textural analysis of fermented fish products

發(fā)酵魚制品質(zhì)構(gòu)結(jié)果見表3。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，4 組接種菌株發(fā)酵魚的魚肉之間的破斷荷重差異均不大，但都高于空白對照組（1.34 N），表明通過3 株菌的發(fā)酵以及混合菌的發(fā)酵可以提高魚肉的硬度，使魚肉更加緊實，而且混合發(fā)酵劑實驗組的魚肉的破斷荷重（2.81 N）高于其他3組單菌株發(fā)酵實驗組，說明混合發(fā)酵增加魚肉硬度的效果優(yōu)于3 株菌分別發(fā)酵。從破斷變形和彈性率可以看出，混合發(fā)酵實驗組的魚制品的破斷變形（6.00 mm）與彈性率（194 278.5 N/m2）最大，而單菌株發(fā)酵的3 個實驗組的破斷變形和彈性率相差不大，但也遠(yuǎn)大于空白對照組。因此，接種了3 株菌的魚肉具有一定的彈性與咀嚼性，但混合發(fā)酵劑比單菌株發(fā)酵劑改善魚肉的彈性有更好的效果。綜合各方面因素，混合發(fā)酵劑不僅能增強(qiáng)魚肉的硬度，且改善了魚肉的彈性，使其更富有咀嚼性。

2.6大腸菌群與致病菌檢測結(jié)果

在食品安全各項指標(biāo)中，大腸菌群是評價食品是否被污染的一個重要指標(biāo)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB 2726—2005《熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［27］的微生物指標(biāo)中規(guī)定，肉制品的大腸菌群≤150 MPN/100 g。而這5 組發(fā)酵魚的大腸菌群數(shù)量＜3 MPN/100 g，均低于標(biāo)準(zhǔn)。

沙門氏菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌是水產(chǎn)制品中主要的致病菌，根據(jù)GB 29921—2013《食品中致病菌限量》中水產(chǎn)制品總致病菌限量規(guī)定，沙門氏菌不可檢出，副溶血性弧菌≤100 MPN/g，金黃色葡萄球菌≤100 CFU/g。而5 組發(fā)酵魚制品中這3 種致病菌均沒有檢測出，由此可見，從衛(wèi)生指標(biāo)角度看，5 組發(fā)酵魚制品均是安全食品。

3　結(jié) 論

葡萄球菌和微球菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中重要微生物類群，本研究從傳統(tǒng)自然發(fā)酵的梅香魚中分離到嗜鹽四聯(lián)球菌、木糖葡萄球菌及腐生葡萄球菌3株適合發(fā)酵的菌株。其中嗜鹽四聯(lián)球菌屬乳酸菌［28］，美國食品藥品管理局認(rèn)為大多數(shù)乳酸菌是安全的，由于其具有較強(qiáng)的抗菌活性，能抑制食品中的腐敗菌和病原菌，因此常被用于食品加工中，提高產(chǎn)品的保藏性及改善風(fēng)味等［29］。羅立新等［30］曾從發(fā)酵醬油中分離出嗜鹽四聯(lián)球菌，發(fā)現(xiàn)其具有較高的產(chǎn)酸能力，不僅具有一定的抑菌能力，而且也增加了醬油的風(fēng)味。木糖葡萄球菌和腐生葡萄球菌對發(fā)酵食品中的風(fēng)味物質(zhì)的含量有明顯影響，王蕭等［31］曾研究過木糖葡萄球菌對發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味化合物的影響，發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌處理的香腸中酯類和醇類含量較高，這些物質(zhì)對發(fā)酵香腸風(fēng)味的形成起到了重要作用。李想等［32］對發(fā)酵里脊豬肉的研究發(fā)現(xiàn)接種腐生葡萄球菌處理組游離脂肪酸含量顯著增加，且各個發(fā)酵階段的直鏈醛和酮的含量均顯著高于對照處理組。李宗軍［33］在中國傳統(tǒng)發(fā)酵肉中分離得到木糖葡萄球菌和腐生葡萄球菌，經(jīng)毒性實驗表明其安全無毒，無致病性，可以作為肉類發(fā)酵劑的微生物資源。

本研究以嗜鹽四聯(lián)球菌、木糖葡萄球菌和腐生葡萄球菌這3株菌為發(fā)酵劑對沙丁魚分別進(jìn)行單菌株發(fā)酵和混合菌株發(fā)酵，對發(fā)酵過后的沙丁魚進(jìn)行了感官、理化指標(biāo)的評價，從研究結(jié)果可知，3 株菌單菌株發(fā)酵時均可以改善魚制品的風(fēng)味和品質(zhì)，尤其是在魚制品的風(fēng)味方面，3 株菌均不同程度地增加了魚肉的風(fēng)味和香氣，且明顯優(yōu)于未接種發(fā)酵的魚制品，而混合菌株發(fā)酵的魚制品的品質(zhì)更優(yōu)于單菌株發(fā)酵，不僅感官總體可接受程度最高，改善了魚肉的彈性，增加了咀嚼性，而且有效地抑制了腐敗菌的生長，延緩了魚制品的腐敗。所以，既考慮發(fā)酵魚的各項理化及微生物指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，又考慮發(fā)酵魚的風(fēng)味特性，從而確定使用混合發(fā)酵劑（1∶1∶1）進(jìn)行發(fā)酵，能更好地改善魚制品的品質(zhì)。

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Selection of Starter Culture from Traditional Fermented Meixiang Fish and Its Effect on Quality

ZHU Wenjuan， AN Junying， ZHANG Xuemei， LIU Ying*， SUN Lijun， WANG Yaling， LIU Huanming
（Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution， Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety， College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University，Zhanjiang524088， China）

Bacterial strains from naturally fermented Meixiang fish， a traditional Chinese fish product， were isolated and screened for their suitability to produce Meixiang fish as starter culture. Meanwhile， the influence of three selected strains inoculated singly or in combination （1：1：1） on the quality of fermented fish. The results showed that Tetragenococcus halophilus， Staphylococcus xylosus and Staphylococcus saprophyticus， all of which can meet the requirements for fish fermentation， were separated from the naturally fermented fish. Compared to those fermented and not fermented with each of the three strains， the fermented fish produced with their combination had the highest overall sensory acceptability and the best chewiness and elasticity， and inhibited the generation of histamine and total volatile basic nitrogen （TVB-N）. This study can provide reference for targeted inoculation， manual control and large-scale industrial production of Meixiang fish.

Meixiang fish； fermentation； selection； quality

Q815

A

1002-6630（2015）23-0162-05

10.7506/spkx1002-6630-201523030

2015-01-25

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171734）；廣東省科技計劃項目（2014A020217018）；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校工程科研項目（GDOU2013050205；GDOU20014050203）

朱雯娟（1989—），女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：kakarora@qq.com

劉穎（1966—），女，教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：liuyingxk@sina.com