食源性乳桿菌中耐藥基因的轉移研究

馬沁沁，付　雨，孫　群，*

（1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都　610064；2.四川師范大學生命科學學院，四川 成都　610101）

食源性乳桿菌中耐藥基因的轉移研究

馬沁沁1，2，付雨1，孫群1，*

（1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都610064；2.四川師范大學生命科學學院，四川 成都610101）

為評估食品中乳桿菌（Lactobacillus spp.）耐藥基因轉移所引起的食品安全風險，對耐藥乳桿菌菌株進行了紅霉素、萬古霉素和氟喹諾酮類藥物耐藥基因的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）中檢測到紅霉素耐藥基因msrC，萬古霉素和氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測結果為陰性。以供體菌和受體菌菌液體積比為10∶1，通過濾膜雜交法，進行乳桿菌耐藥基因msrC對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的體外轉移，但僅獲得1 個接合子菌落；乳桿菌對糞腸球菌（Enterococcus faecalis）msrC基因體外轉移頻率約為2.2×10-2，與敏感菌相比，接合子生長速率減緩。在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）裸鼠腸道內進行的L. delbrueckii對E. faecalis的msrC基因體內轉移中未檢測到接合子。結果表明，乳桿菌攜帶的可轉移耐藥基因在腸道內傳遞至致病菌或機會致病菌的機率很小，且接合子生長比敏感菌緩慢，在抗生素選擇壓降低或消失的條件下易被淘汰。因此，目前食源性乳桿菌中耐藥基因可能引起的食品安全風險較小。

耐藥性；乳桿菌；基因轉移；接合子；食品安全

自抗生素臨床應用以來，細菌耐藥性的產生和傳播就成為威脅公眾健康的主要因素之一。細菌的抗生素耐藥性分為固有耐藥和獲得性耐藥。獲得性耐藥是通過細菌的突變或通過基因水平轉移（horizontal genetransfer，HGT）獲得外源耐藥遺傳因子而產生，可以在細菌間傳播［1］。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）提出具有固有耐藥或由染色體突變獲得耐藥性的菌株可以用作飼料添加劑，而攜帶可轉移耐藥基因的菌株發生耐藥基因橫向轉移的風險最大，不應被引入食物鏈［2］。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）被廣泛用于食品生產，一直被認為是對人體沒有危害的天然發酵劑和益生菌，能夠平衡腸道菌群，對人體健康有益［3］。但最近發現LAB攜帶多種抗生素耐藥基因，可能作為抗生素耐藥基因的儲存庫［4-5］，在一定條件下通過HGT轉移至致病菌或機會致病菌。目前關于乳桿菌（Lactobacillus spp.）耐藥基因轉移的報道有限，且不同研究中，結果不盡相同。后基因組學的分析發現在人腸道的天然微生物群落和致病菌之間的基因轉移可能存在某種屏障［6］。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）攜帶的紅霉素耐藥基因ermB對糞腸球菌（Enterococcus faecalis）的轉移頻率在無菌小鼠體內比在體外提高了3～4 個數量級［7］，而羅伊乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的四環素耐藥基因tetW在人腸道內并未與腸球菌（Enterococcus spp.）、雙歧桿菌（Bifi dobacteria spp.）、乳桿菌發生水平轉移［8］。

本實驗室研究發現分離自四川地區人腸道及發酵食品的52 株乳桿菌中，60%以上的菌株分別對紅霉素、萬古霉素、諾氟沙星和環丙沙星耐藥，且受試菌株對上述抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibition concentration，MIC）分布均呈現雙峰或多峰分布，因此耐藥菌株的耐藥性很可能是獲得性耐藥［3，9］。本研究擬對耐藥乳桿菌菌株是否攜帶可轉移的耐藥基因進行鑒定，并進行乳桿菌對腸道致病菌和機會致病菌的耐藥基因體外及體內轉移研究，為食品中乳桿菌耐藥性可能引起的食品安全風險評估提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

四川大學公共衛生學院保存的分離自健康人腸道及四川大學生命科學學院實驗室分離自酸奶及四川泡菜的乳桿菌菌株共52 株；對紅霉素敏感的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213及E. faecalis ATCC 29212，購自北京中原公司。

1.1.2實驗動物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）BALB/c裸鼠由四川大學實驗動物中心提供，小鼠平均年齡2 個月。

1.1.3試劑

細菌基因組DNA小量提取試劑盒及2×Taq Plus PCR MasterMix北京天根生化科技有限公司；質粒DNA小量提取試劑盒美國Axygen公司；膠回收試劑盒美國Omega公司；PCR引物英濰捷基（上海）貿易有限公司合成；紅霉素美國Sigma-Aldrich公司；MRS瓊脂及MRS肉湯培養基廣州環凱生物制品有限公司；糞腸球菌瓊脂及甘露醇-氯化鈉瓊脂培養基青島海博生物技術有限公司；濾膜及濾頭上海新亞凈化器件廠。

1.2儀器與設備

PTC-200型PCR儀、DYY-Ⅱ恒壓恒流電泳儀、凝膠成像儀美國Bio-Rad公司；生物安全柜青島海爾集團；隔水式恒溫培養箱上海一恒科學儀器有限公司；恒溫振蕩培養箱上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1耐藥基因的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測

提取耐藥乳桿菌菌株基因組DNA，PCR檢測紅霉素、萬古霉素及氟喹諾酮類藥物耐藥基因。PCR擴增引物見表1。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，45～62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 次循環；72 ℃ 10 min。對目的條帶用膠回收試劑盒回收，送上海美吉生物科技有限公司測序。

表1　抗生素耐藥基因擴增引物Table 1 Primers chosen for detection of antimicrobial resistance determinants

續表1

1.3.2質粒中紅霉素耐藥基因的檢測及體外基因轉移

提取紅霉素耐藥乳桿菌菌株質粒DNA，以此為模板，分別擴增mefA/E基因和msrC基因。

分離自酸奶的德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）M1號菌株為供體，對紅霉素敏感的E. faecalis ATCC 29212和S. aureus ATCC 29213為受體，供體菌和受體菌菌液體積比為10∶1，以濾膜雜交法［3］進行耐藥基因體外轉移，重復3 次。

1.3.3接合子的鑒定

挑取ATCC 29213接合子（29213C）及3 個ATCC 29212接合子（29212C）單菌落接種于含有5 μg/mL紅霉素的BHI肉湯培養基中，37 ℃培養48～72 h后提取質粒DNA，PCR檢測msrC基因。

1.3.4接合子MIC的測定

采用美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）公布的瓊脂稀釋法測定接合子的MIC值［14］。

1.3.5體內基因轉移

將小鼠分為實驗組、對照組和空白組，每組3 只小鼠，均為雄性小鼠。

根據酸奶中乳桿菌的濃度［15］及泡菜汁中乳桿菌的濃度［16-17］，以及實驗用裸鼠與我國18～69 歲健康漢族成年人平均體質量比［18］，確定M1和E. faecalis ATCC 29212的灌喂量［7，19］。

向實驗組小鼠灌喂109CFU/d ATCC 29212，喂食3 d后向實驗組小鼠灌喂108CFU/d M1號菌株和109CFU/d ATCC 29212，喂食3 d。向對照組小鼠灌喂109CFU/d ATCC 29212，喂食6 d。向空白組小鼠灌喂滅菌生理鹽水6 d。

取小鼠腸道剪碎，加入適量無菌生理鹽水研磨，研磨后將研磨液轉入10 mL離心管中，渦旋1 min。取研磨液進行10 倍梯度稀釋，取實驗組和對照組研磨液及稀釋液100 μL分別涂布于含5 μg/mL紅霉素的糞腸球菌瓊脂和MRS瓊脂，將空白組研磨液及稀釋液涂布于不含抗生素的糞腸球菌瓊脂，37 ℃培養24～72 h后進行菌落計數。

2　結果與分析

2.1乳桿菌耐藥基因的擴增

在受試菌株中未得到12 個已知萬古霉素耐藥基因及10 個已知氟喹諾酮類藥物耐藥基因陽性片段。對紅霉素耐藥基因的擴增中，在8 株紅霉素耐藥的L. plantarum中檢測到mefA/E基因；分別有2 株L. delbrueckii、1 株發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、1 株嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）以及22 株L. plantarum攜帶msrC基因（圖1）。在紅霉素耐藥菌株的質粒中均檢測到相應紅霉素耐藥基因。

圖1　部分乳桿菌菌株質粒mefAmefA/E及msrCmsrC基因擴增結果Fig.1　PCR of mefA/E and msrC gene from plasmids in partial selected Lactobacillus strains

2.2M1與受體菌的耐藥基因體外轉移

經鑒定，L. delbrueckii M1號菌株質粒攜帶msrC基因，以M1為供體與S. aureus ATCC 29213雜交的3 次重復實驗中，只有1 次實驗一組平行的10-4稀釋液于48 h后有一個可見菌落生長，直徑約1 mm。其余樣品及對照組均無菌落生長。M1與E. faecalis ATCC 29212的接合子在72 h后出現可見菌落，平均轉移頻率為2.2×10-2。敏感受體菌ATCC 29212和ATCC 29213在培養18～24 h后菌落可見。

2.3接合子的鑒定

通過PCR檢測，接合子29212C和29213C的質粒DNA中擴增到msrC基因，而從陰性對照ATCC 29212和ATCC 29213的質粒DNA未擴增到陽性條帶（圖2），表明msrC基因通過濾膜雜交成功轉移至受體菌ATCC 29213和ATCC 29212。

圖2　接合子mmssrrCC基因的PCRR鑒定結果Fig.2　msrC gene in the exconjugants identified by PCR

2.4接合子MIC的測定結果

29212C和29213C對紅霉素的MIC值為8 μg/mL，高于非接合子的正常MIC值（ATCC 29213為0.25～1 μg/mL，ATCC 29212為1～4 μg/mL），并達到CLSI提出的折點（8 μg/mL），說明ATCC 29212和ATCC 29213通過濾膜雜交，從M1獲得紅霉素耐藥基因msrC，并產生了對紅霉素的耐藥性。

2.5體內基因轉移

在SPF裸鼠體內進行的M1對E. faecalis ATCC 29212的耐藥基因轉移中，實驗組未檢出ATCC 29212接合子。對照組及空白組均無菌落生長。

3　討 論

本研究在L. plantarum、L. acidophilus和L. delbrueckii中檢測到msrC基因。Portillo［20］和Werner［21］等發現部分對紅霉素敏感的E. faecalis菌株也攜帶msrC基因，而Singh等［22］卻發現msrC基因的突變會導致E. faecalis菌株對紅霉素的MIC明顯降低。因此，msrC基因是否引起紅霉素耐藥，仍存爭議。本研究中，敏感受體菌獲得msrC基因后均產生了紅霉素耐藥性，表明msrC對紅霉素耐藥性確有貢獻。受試乳桿菌中未檢測到已知的萬古霉素及氟喹諾酮類藥物耐藥基因，與其他研究結果相同［9-10］，其耐藥機制需進一步探討。

可轉移的抗生素耐藥基因大都位于質粒和整合接合因子（integrative and conjugative elements，ICEs），而質粒和ICEs主要通過接合的方式發生HGT［23］，因此目前耐藥基因體外轉移實驗通常采用濾膜雜交法［3，7，24］。不同的供受體菌株的體外基因轉移情況不同，四環素耐藥基因能從屎腸球菌（Enterococcus faecium）水平轉移至乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）［25］，從乳桿菌轉移至L. lactis和E. faecalis，但從乳桿菌到S. aureus的體外轉移卻未能實現［24］。本研究中乳桿菌對S. aureus的紅霉素耐藥基因體外轉移獲得成功，但僅有1 個接合子生長，轉移頻率為1.1×10-9，與乳桿菌在紅霉素選擇壓下產生獲得性耐藥的突變頻率（＜10-11～10-5）相當［26］。M1與E. faecalis ATCC 29212的濾膜雜交實驗中，平均轉移頻率為2.2×10-2。Gevers等［24］得到乳桿菌四環素耐藥基因tetM對E. faecalis的體外轉移頻率為10-4～10-6，而L. plantarum攜帶的紅霉素耐藥基因ermB對E. faecalis的體外轉移頻率為5.7×10-8［7］。供受體菌株的種類和接合子培養時間可能會對轉移頻率有影響。

值得注意的是，S. aureus接合子和E. faecalis接合子出現可見菌落的時間比敏感菌滯后約24～48 h，表明受體菌在獲得外源紅霉素耐藥基因msrC后，付出了生長速率降低的適應性代價。若其在腸道內與敏感菌共存，當抗生素選擇壓降低或消失時，易在與敏感菌的競爭中被淘汰［27］。

已有關于乳桿菌耐藥基因體內轉移的研究結果不一，且乳桿菌和受體菌的灌喂量與我國成年人日常攝食的習慣不符［7-8］。本研究根據自然條件下我國成年人每天可能攝食乳桿菌的最大量，確定供體菌M1及受體菌E. faecalis ATCC 29212對裸鼠的灌喂量比例為1∶10，未檢出接合子，而實際每日的乳桿菌攝入量還可能低于此劑量。在本研究基因體內轉移的條件下，乳桿菌攜帶的可轉移紅霉素耐藥基因msrC未轉移至E. faecalis，據此可推斷我國健康成年人通過日常攝入乳桿菌而將其攜帶的紅霉素耐藥基因轉移給腸道致病菌和機會致病菌的風險很低。因此，本研究結果表明按照中國人食用乳桿菌的習慣，發酵食品中添加的乳桿菌即便攜帶耐藥基因，在腸道內水平轉移至腸道致病菌及機會致病菌的風險也很小，且獲得外源耐藥基因的菌株生長能力降低，競爭力減弱，易被淘汰。因此發酵食品中乳桿菌攜帶的耐藥基因可能導致的食品安全風險較低。

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Antimicrobial Resistant Gene Transfer of Foodborne Lactobacilli

MA Qinqin1，2，FU Yu1， SUN Qun1，*
（1. Key Laboratory of Bio-resource and Eco-environment， Ministry of Education， College of Life Sciences， Sichuan University，Chengdu610064， China； 2. College of Life Sciences， Sichuan Normal University， Chengdu610101， China）

To assess the risk of antimicrobial resistant gene transfer from foodborne Lactobacillus strains to human pathogens or opportunistic pathogens， we performed the detection of the resistant genes of erythromycin， vancomycin and fluoroquinolones in resistant Lactobacillus strains. Erythromycin resistant gene msrC was shown in the plasmids of Lactobacillus plantarum， Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus delbrueckii， while negative results were obtained for vancomycin and fluoroquinol ones. Filter mating was carried out at a donor/recipient ratio of 10：1 with Staphylococcus aureus and E. faecalis as the recipients and L. delbrueckii the donors， respectively. In L. delbrueckii and S. aureus mating pair， only one exconjugant was obtained， and the average gene transfer frequency of L. delbrueckii to E. faecalis was 2.2 × 10-2， indicating that the mobile resistant gene from lactobacilli could disseminate to pathogens. The growth rate of exconjugants was lower than the control， so exconjugants might be washed out more easily than their susceptible counterpart when antimicrobial selective pressure was absent. The transfer of msrC from L. delbrueckii to E. faecalis was not observed in gnotobiotic rats. Accordingly， lactobacilli widely used in foods now may not increase the antimicrobial resistance in pathogens， thus threatening public health severely.

antimicrobial resistance； Lactobacillus； gene transfer； exconjugant； food safety

Q939.99

A

1002-6630（2015）23-0167-05

10.7506/spkx1002-6630-201523031

2015-01-26

科技部國際科技合作專項（2011DFR31220；2015DFR31060）；四川省科技支撐計劃項目（14ZC1482）；四川師范大學校級科研項目（10QNL02）

馬沁沁（1978—），女，講師，博士研究生，研究方向為應用微生物。E-mail：qqma@sicnu.edu.cn

孫群（1967—），女，教授，博士，研究方向為微生物學。E-mail：qunsun@scu.edu.cn