毛霉發酵豆粕工藝條件的優化

潘進權，劉玉婷，劉夏婷

（嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江　524048）

毛霉發酵豆粕工藝條件的優化

潘進權，劉玉婷，劉夏婷

（嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江524048）

為探討豆粕固態發酵同步制備多肽及可溶性膳食纖維的工藝條件，選用雅致放射毛霉AS3.2778為發酵菌株，采用響應面分析方法考察了影響發酵工藝的若干因素，并對發酵工藝條件進行了優化。由此確定了最佳的毛霉固態發酵豆粕的工藝條件：豆粕發酵培養基中添加質量分數3%木糖、0.3% KH2PO4、0.1%吐溫-80、0.39% CaCl2，含水量52.7%，初始pH 5.68，27 ℃發酵3 d。在優化的工藝條件下，毛霉發酵豆粕可實現多肽及可溶性膳食纖維的同步高效轉化，其得率分別可達到16.1%與18.5%。結果表明毛霉固態發酵豆粕同步制備多肽及可溶性膳食纖維的生產工藝具有可行性。

毛霉；豆粕；固態發酵；多肽；可溶性膳食纖維

豆粕是大豆經榨油后產出的一種副產物，是大豆除去油脂及脂溶性成分后的殘渣，因保留了大豆中原有的大量營養成分，尤其是富含蛋白質及膳食纖維等，因此它是一種優良的食品加工原料，具有較好的應用潛力［1］。然而，豆粕中除含有豐富的營養成分外，還共存有多種抗營養因子，如大豆抗原蛋白、蛋白酶抑制劑及植酸等［2-3］。這些抗營養因子在很大程度上限制了豆粕中有效營養成分的利用。因此，關于豆粕資源的開發利用較多的研究停留在如何解除其抗營養因子，提高其生物利用率方面［4-5］。

已有大量研究表明，大豆蛋白質經水解制備所得的多肽具有優于蛋白質及混合氨基酸的營養價值［6-7］，而且具有一定的生理保健功能，因此大豆多肽已成為保健食品領域的重要功能因子［8-10］。此外，來源于大豆的大豆膳食纖維，尤其是可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）因具有多重保健意義，已成為眾多保健食品的重要原材料［11-12］。因此，開展豆粕向多肽及可溶性膳食纖維的轉化研究對于消除豆粕抗營養因子，提高豆粕的利用率及附加值有更重要的意義［13-14］。

毛霉因含有豐富的胞外酶系，包含有多種蛋白酶及纖維素酶［15-16］，其在大豆蛋白水解及膳食纖維制備方面已有良好的表現［17-19］，針對毛霉這一特點，本研究開展了毛霉固態發酵制備多肽及可溶性膳食纖維的工藝研究，以對工藝的可行性進行分析。

1　材料與方法

1.1材料

豆粕湛江渤海農業發展有限公司。

1.2菌種與培養基

毛霉（Actinomucor elegans）AS3.2778嶺南師范學院酶工程實驗室保藏菌種。

斜面培養基：采用PDA培養基。種子培養基：采用麩皮培養基，每支三角瓶中裝入干麩皮10 g，加水10 mL，攪拌均勻后在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后備用。

豆粕基礎發酵培養基：在每支250 mL的三角瓶中裝入干豆粕20 g，加入20 mL水，攪拌均勻滅菌后備用。

1.3方法

1.3.1種子活化

從已活化的試管斜面菌種挑取一環孢子轉接到麩皮種子培養基上，充分混勻后將其放置在生化培養箱內，28 ℃恒溫培養3 d。

1.3.2毛霉孢子懸浮液的制備

向已培養好的麩皮種子中加入無菌水100 mL，充分搖勻后用4 層無菌紗布過濾，收集所得的濾液即為毛霉孢子懸浮液。

1.3.3豆粕發酵實驗

在每支已滅菌后的三角瓶發酵培養基中接入1 mL孢子懸浮液，旋搖三角瓶使之充分混勻，然后將三角瓶放置在生化培養箱中28 ℃恒溫培養3 d。

1.3.4發酵豆粕中SDF的提取及得率計算

SDF的提取［19］：發酵結束后，將三角瓶中發酵好的豆粕分散在600 mL蒸餾水中（固液比為1∶30（m/V）），調pH值到4.0，在80 ℃恒溫水浴鍋中加熱120 min，抽濾得到濾液。加入4 倍濾液體積的無水乙醇，靜置30 min，抽濾，并用80%乙醇洗滌濾渣，所得濾渣即為可溶性膳食纖維。將濾渣置于烘箱中105 ℃烘干至恒質量并稱質量，根據下式計算SDF得率。

式中：m1為發酵豆粕提取得到的可溶性膳食纖維的質量/g；m為發酵豆粕中原干豆粕的質量/g。

1.3.5發酵豆粕中多肽的提取及得率計算

發酵豆粕中多肽含量的檢測參照酸溶蛋白含量的測定方法［20］，準確稱取發酵豆粕10 g于100 mL燒杯中，準確加入15%三氯乙酸溶液50 mL混合均勻，靜置5 min，將提取物轉移至離心管，在4 000 r/min離心10 min，其上清液10 mL于消化管中，按半微量凱氏定氮法測定粗蛋白質含量，即為多肽的含量，根據下式計算多肽得率。

式中：m2為發酵豆粕提取所得多肽的總質量/g；m為發酵豆粕中原干豆粕的質量/g。

1.3.6單因素試驗

培養基中成分強化物對毛霉發酵豆粕的影響：在基礎發酵培養基中以干豆粕為基準分別添加質量分數3%的碳源（分別為蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖）、質量分數0.3%的無機鹽（分別為ZnSO4、FeSO4、MnSO4、MgCl2、CaCl2、NaCl）、質量分數0.5%的無機鹽（分別為KH2PO4、K2HPO4）及質量分數0.1%的吐溫-80，其他成分保持不變，進行固體發酵，由此考察若干成分強化物對毛霉發酵豆粕的影響。

培養基初始pH值對毛霉發酵豆粕的影響：在控制發酵培養基成分及總含水量不變的前提下，分別調節其初始pH值至3.5～8.5的范圍，然后按1.3.3節進行發酵試驗，由此考察培養基初始pH值對毛霉發酵豆粕的影響。

培養基含水量對毛霉發酵豆粕的影響：分別調節發酵培養基的含水量到35%～80%范圍，然后按1.3.3節進行固體發酵試驗，考察培養基含水量對毛霉發酵豆粕的影響。

發酵溫度對毛霉發酵豆粕的影響：采用基礎發酵培養基分別在18、21、24、27、30、33、36 ℃條件下按1.3.3節進行豆粕發酵試驗，考察發酵溫度對毛霉發酵豆粕的影響。

1.3.7部分析因試驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用Minitab統計軟件，采用兩水平試驗設計［21］，對毛霉發酵豆粕有促進作用的因素做進一步分析，以篩選出對毛霉發酵有顯著促進作用的若干因素，并初步確定各因素的合適取值范圍。

1.3.8響應面分析設計

在部分析因試驗的基礎上，利用SAS 8.2統計軟件，采用響應面分析法中的中心組合試驗設計［21］，對部分析因設計篩選出的因素做進一步優化，并由此確定豆粕發酵制備多肽及可溶性膳食纖維的工藝條件。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1發酵培養基中成分強化物對毛霉發酵豆粕的影響分別在發酵培養基中添加不同的物質，考察成分添加物對毛霉發酵豆粕的影響，由此篩選對毛霉發酵豆粕有促進作用的物質，結果見表1。

表1　成分強化物對毛霉發酵豆粕的影響Table 1 Effects of nutritional supplements on the fermentation of soybean meal by Mucor

由表1可知，原基礎發酵培養基中的物質成分已基本可滿足毛霉菌體的生長及發酵產酶，因此空白對照樣品中多肽及可溶性膳食纖維的得率均可達到10%以上；在培養基中添加某些物質，如木糖、CaCl2、KH2PO4、吐溫-80對毛霉發酵、多肽及可溶性膳食纖維轉化有較明顯的促進作用；而有些物質（如果糖、葡萄糖等）則對毛霉發酵表現出抑制作用，這可能是由于這些添加物的存在對毛霉發酵產酶表現出了抑制效應。通過試驗初步篩選出對毛霉固體發酵豆粕有促進作用的4 個物質成分：木糖、CaCl2、KH2PO4、吐溫-80。

2.1.2培養基初始pH值對毛霉發酵豆粕的影響

對于豆粕固態發酵制備多肽及膳食纖維的工藝而言，發酵培養基的初始pH值既會影響毛霉菌的正常生長、產酶效率，同時也會影響發酵培養基中蛋白酶及纖維素酶的穩定性及水解效率。由圖1可知，培養基的初始pH值對毛霉發酵豆粕有較顯著的影響。毛霉菌體生長及產酶適宜于在偏酸性的環境；對于多肽轉化而言，適宜的初始pH值范圍在5.0～6.5；對于可溶性膳食纖維的轉化而言，培養基適宜的初始pH值范圍在4.0～5.5；多肽轉化與SDF轉化所需的最適初始pH值略有不同，這應該與這兩類酶的分泌及催化適宜條件有關系。通過以上試驗初步確定毛霉發酵豆粕的合適培養基初始pH值范圍為4.0～6.5。

圖1　培養基初始pH值對毛霉發酵豆粕的影響Fig.1　Effect of initial medium pH on the fermentation of soybean meal by Mucor

2.1.3培養基含水量對毛霉發酵豆粕的影響

對于毛霉固體發酵豆粕轉化多肽及膳食纖維的生產工藝而言，發酵培養基的含水量是一個重要的影響因素，培養基含水量的高低除了會影響菌體的正常生長及產酶，同時它還會影響培養基中各物質的溶解及酶解反應，進而影響多肽及膳食纖維的轉化效率［22-23］。為了確定發酵培養基的合適含水量，分別于培養基不同含水量的條件下進行固體發酵試驗，考察了培養基含水量對毛霉固體發酵豆粕的影響，結果見圖2。培養基含水量對毛霉發酵豆粕確有顯著影響，當發酵培養基的含水量低至35%或是高于65%時，豆粕中多肽及可溶性膳食纖維的轉化得率明顯偏低。通過以上試驗可確定發酵培養基的合適含水量范圍在40%～60%。

圖2　培養基含水量對毛霉發酵豆粕的影響Fig.2　Effect of water content in the medium on the fermentation of soybean meal by Mucor

2.1.4發酵溫度對毛霉發酵豆粕的影響

圖3　發酵溫度對毛霉發酵豆粕的影響Fig.3　Effect of temperature on the fermentation of soybean meal by Mucor

由圖3可知，發酵溫度對毛霉生長及發酵豆粕有較顯著影響。毛霉是一種典型的適低溫型菌，在相對較高的溫度下（超過33 ℃）菌體生長及產酶較困難，從而導致多肽及SDF的得率明顯偏低；而環境溫度過低（低于18 ℃）時，菌體生長比較緩慢，酶的分泌及催化效率下降，多肽與SDF得率也不高。通過試驗可初步確定毛霉生長及豆粕發酵的適宜溫度范圍在24～30 ℃。

2.2部分析因試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，采用部分析因設計中的兩水平試驗設計方法對上述篩選的影響因子做進一步分析，以確定對毛霉發酵豆粕有顯著促進作用的影響因子。表2、3分別給出了部分析因設計的試驗設計方案及結果的方差分析。

以多肽與SDF的得率總和（Y）為目標，對部分析因試驗的結果進行方差分析，結果如表4所示。在選取的7 個因素及各自對應的取值范圍內，因素B、E、F對毛霉發酵豆粕有極顯著的影響（P＜0.01）；因素A對毛霉發酵豆粕有顯著的影響（P＜0.05）；此外，曲率分析（表4中Ct Pt項）的結果則表明，上述因素的二次項對毛霉發酵豆粕也有顯著的影響，由這些因素所確定的試驗空間是一個顯著的曲面（P＜0.01），曲面上必然存在極值響應點。為了找出這一極值響應點及各因素對應的取值，以極顯著性影響因素B、E及F為對象開展了后續的響應面分析試驗，與此同時固定其他因素的取值均為中水平。

表2　部分析因試驗設計因素水平表Table 2 Factors and levels used in fractional factorial design

表3　部分析因試驗設計及結果Table 3　Fractional f　actorial design scheme and corresponding experimental results　lts

表4　部分析因試驗結果的方差分析Table 4　Analysis of variance （ANOVA） of the experimental results of fractional factorial design ign

2.3響應面分析及優化結果

以部分析因設計篩選出的極顯著性影響因素B、E、F為對象，在上述試驗空間內進行中心組合試驗設計，以確定這3 個因素的最佳取值，試驗設計及結果如表5所示。

表5　中心組合試驗設計及結果Table 5 Central composite design scheme and corresponding experimental results

分別以多肽得率（Y1）、SDF得率（Y2）及總得率（Y）為響應值，對表5的試驗結果進行回歸分析可以得到以下數學模型：

圖4　培養基初始pHH值　（E）與含水量（F）對多肽及SDFF　總得率（Y）的影響Fig.4　Effect of pH （E） and water content （F） in the medium on the total yield of polypeptide and SDF （Y）

方差分析的結果顯示，回歸模型均有非常高的顯著性（P＜0.01），其R2為0.913 0，說明該模型可解釋91.30%的試驗結果。圖4～6給出了模型（5）的響應曲面，由圖可見該響應曲面是一典型的凸面，在其表面存在最大響應點。通過SAS軟件分析可確定出該曲面的最大響應值為Y=（34.27±0.73）%，此時對應的因素B、E、F的取值分別為CaCl2質量分數0.39%、pH 5.68、含水量52.7%。

圖5　CaaCCll2質量分數（B）與培養基初始ppHH值　（E）對多肽及SDFF　總得率（Y）的影響Fig.5　Effect of CaCl2（B） and medium pH （E） on the total yield of polypeptide and SDF （Y）

圖6　CaaCCll2質量分數（B）與培養基含水量（F）對多肽及SDFF　總得率（Y）的影響Fig.6　Effect of CaCl2（B） and water content （F） in the medium on the total yield of polypeptide and SDF （Y）

通過上述優化試驗可確定出毛霉固體發酵豆粕的最佳工藝條件為：豆粕發酵培養基中添加3%木糖、0.3% KH2PO4、0.1%吐溫-80、0.39% CaCl2、含水量52.7%、pH 5.68，在27 ℃發酵3 d。在此優化條件下進行多次發酵實驗，總得率的平均值為34.6%，結果與模型的預測值相吻合，進一步驗證了模型的可靠性。在此優化的發酵條件下，多肽與SDF的總得率分別為16.1%、18.5%。

3　結 論

本研究以開發豆粕中具有高附加值的保健活性物質，多肽及可溶性膳食纖維的綜合利用為目標，選用具有復合酶系的毛霉為菌株，擬通過毛霉固態發酵豆粕實現多肽及可溶性膳食纖維的同步高效轉化。本實驗探討了毛霉發酵豆粕轉化為多肽及可溶性膳食纖維的生產工藝，并對工藝條件進行了優化，最終確定了毛霉發酵豆粕的合適工藝條件為：豆粕發酵培養基中添加質量分數3%木糖、0.3% KH2PO4、0.1%吐溫-80、0.39% CaCl2，含水量52.7%，pH 5.68，27 ℃發酵3 d。在優化的工藝條件下，毛霉發酵豆粕確實可實現多肽及可溶性膳食纖維的同步高效轉化，兩者的得率分別可達到16.1%與18.5%，此結果高于同類文獻報道［24-25］。本實驗結果表明，以豆粕為原料通過毛霉發酵可顯著提高多肽及可溶性膳食纖維的轉化得率，生產工藝具有可行性。

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Optimization of the Fermentation Process of Soybean Meal by Mucor

PAN Jinquan， LIU Yuting， LIU Xiating
（School of Life Science and Technology， Lingnan Normal University， Zhanjiang524048， China）

The production process of polypeptide and soluble dietary fiber （SDF） from soybean meal with solid-state fermentation by Mucor was investigated and optimized with response surface methodology. After optimization， the optimal process conditions were determined as 20 g of soybean meal in a 250 mL shake flask with the addition of 3.0% xylose （g/g soybean meal）， 0.3% KH2PO4， 0.1% Tween-80 and 0.39% CaCl2as the nutrient supplements， initial water content of 52.7%，pH 5.68， fermentation temperature of 27 ℃ and fermentation time of 3 days. Under these conditions， the yield of polypeptide and SDF could reach 16.1% and 18.5%， respectively. The experiment results show that the production process is feasible.

Mucor； soybean meal； solid-state fermentation； polypeptide； soluble dietary fiber

TS201.1

A

1002-6630（2015）23-0178-05

10.7506/spkx1002-6630-201523033

2015-01-12

國家星火計劃項目（2013GA780084）

潘進權（1978—），男，副教授，博士，研究方向為酶與發酵工程。E-mail：pjq78@sina.com