培養基初始pH值和照射光波長對杜氏藻中類胡蘿卜素含量的影響

王　梓，惠伯棣*，宮　平

（北京聯合大學應用文理學院，北京　100191）

培養基初始pH值和照射光波長對杜氏藻中類胡蘿卜素含量的影響

王梓，惠伯棣*，宮平

（北京聯合大學應用文理學院，北京100191）

研究杜氏藻在實驗室培養過程中初始pH值和照射光波長對其體內類胡蘿卜素（β-胡蘿卜素和葉黃素）積累的影響。在實驗中，配制不同初始pH值的培養基，用其培養105 d，測定培養液中藻細胞數和β-胡蘿卜素及葉黃素的含量。用pH 7的培養基，在白光（全波）、紅光（630 nm）和藍光（430 nm）照射下培養藻40 d，測定培養液中藻細胞數和β-胡蘿卜素、葉黃素的含量。結果表明：1）杜氏藻本身具有調節環境pH值向中性發生變化的能力。培養105 d后，不同初始pH值范圍的培養液（pH 10～13、pH 1～3和pH 4～9）中藻養殖密度依次增加。初始pH 4時，培養液中藻細胞數量可達1 851 個/mL，達到最大值；初始pH值范圍為7～9時，培養液中β-胡蘿卜素（0.489～0.561 μg/mL）和葉黃素（0.610～0.700 μg/mL）積累量較高；初始pH值范圍為11～13時，單個細胞內β-胡蘿卜素（0.603～0.730 ng）和葉黃素（0.897～0.979 ng）積累量較高。2）杜氏藻養殖密度在全波光、紅光（630 nm）和藍光（430 nm）條件下均可增加。紅光和藍光均可誘導單個細胞中β-胡蘿卜素和葉黃素積累量增加，藍光效果最佳，單個細胞中葉黃素含量達到0.524 ng，β-胡蘿卜素含量達到0.589 ng。

杜氏藻；類胡蘿卜素；葉黃素；β-胡蘿卜素

綠藻門，杜氏藻屬（Dunaliella）中的嗜鹽單細胞藻類可以生長在高鹽度的海水、鹽田和內陸鹽湖之中。該屬根據其形態和生理特征可鑒定出至少23 個種［1-2］，但根據對其18S rRNA基因、內轉錄間隔區、DNA序列比較以及限制性片段的研究結果，這個屬中能鑒定出的藻種數量要少于23 個［3］。Dunaliella salina是其中的一個種，稱為杜氏藻，又名鹽藻。

為了適應高鹽環境，Dunaliella salina體內能夠積累一定濃度的次生代謝產物：類胡蘿卜素（carotenoid）和甘油。在其體內積累的類胡蘿卜素中，β-胡蘿卜素和葉黃素所占數量最多。二者的分子結構見圖1。β-胡蘿卜素的半系統名稱為β，β-胡蘿卜素（β，β-carotene），習慣名稱為β-胡蘿卜素（β-carotene）。由于其在人體的小腸中可被水解成視黃醇（retinol），β-胡蘿卜素又被認為是VA源。加之其整體分子優秀的抗氧化能力，β-胡蘿卜素已被認為是我國消費者日常膳食中重要的營養素和健康功能因子。鑒于杜氏藻體內積累有豐富的β-胡蘿卜素，其已被用于制備天然β-胡蘿卜素。到目前為止，我國是世界上杜氏藻源β-胡蘿卜素的最大消費國，并已在內蒙和甘肅建成兩個杜氏藻養殖生產基地。但其產量遠遠不能滿足國內市場的需求。在今后相當長的時間內，發展我國的杜氏藻養殖產業都具有很強的迫切性。因此，研究影響其生長的環境因素、優化養殖技術、提高β-胡蘿卜素的產量具有很現實的意義。

圖1　1　β，β-胡蘿卜素（a）和葉黃素（b）的分子結構Fig.1　Molecular structures of β，β-carotene （a） and lutein （b）

杜氏藻個體的生長經歷了比較復雜的生命周期，可進行營養和有性生殖［4-6］。關于杜氏藻生長條件的研究分為露天養殖和室內養殖。國外研究表明：在露天養殖條件下，杜氏藻生長的最優生長鹽質量濃度為100～150 g/L，甚至可達到190 g/L［7-8］；天然生長的杜氏藻可在135 g/L的質量濃度下生長［9］，密度可達4×104個/mL［10］，藻的群落結構變化與鹽度、光強度、水溫以及pH值的變化相關。在人工培養條件下，杜氏藻可在60～230 g/L的NaCl溶液中和pH 6～9的范圍內生長，鈣、鎂離子在高質量濃度下亦可抑制其生長；在質量濃度20～80 g/L的NaCl溶液中杜氏藻生長較快［11］，當鹽質量濃度高于150 g/L后，生長緩慢［8］。同時，杜氏藻人工培養的最佳鹽質量濃度可能隨種、亞種而變化，有些為60 g/L，有些為120 g/L左右［6］。這說明可生長杜氏藻的露天鹽田和鹽湖的實際鹽質量濃度總是遠遠高于實驗室條件下杜氏藻的最佳生長鹽質量濃度。這反映了一個事實：杜氏藻選擇的生長環境不一定是最佳生長環境。但在這個環境中，杜氏藻可能最具生存競爭能力。相對而言，國內研究更多集中于室內養殖，研究內容除了在碳源、氮源、維生素和金屬離子等營養物質量上進行調整之外，還進行了鹽度、光照、溫度、pH值等方面進行的探索。焉翠蔚等［12］研究了不同質量濃度NaCl對杜氏藻生長的影響，結論是杜氏藻生長的最適鹽質量濃度為140 g/L。韋芳三等［13］的研究表明：在鹽質量濃度為400 g/L時，杜氏藻體內能夠積累最高的脂肪量。王富平等［14］的研究表明：較低質量濃度鹽有利于杜氏藻細胞的生長，而較高質量濃度鹽有利于積累較高的類胡蘿卜素。秦彩云等［15］的研究表明：杜氏藻在白、紅、黃、藍光下均能生長，并在10 d時達到最大養殖密度，且紅光條件下的細胞密度最大。鄭亞君等［16］研究不同溫度對鹽生杜氏藻生長及脂肪酸組成的影響，隨著培養溫度的升高和光照強度的增加，藻株內飽和脂肪酸所占百分比例增加，多不飽和脂肪酸所占百分比例減小。pH值變化研究方面，除用緩沖鹽控制培養環境pH值外［17］，還有人嘗試通過充入CO2氣體的方式控制培養體系的pH值［18］。這些方面的研究主要集中在物理條件對細胞生長方面的影響上，與體內類胡蘿卜素的積累的相關性不足。

本研究探索培養液pH值和不同照射光波長對實驗室條件下養殖杜氏藻中類胡蘿卜素積累量的影響，為提高杜氏藻養殖中β-胡蘿卜素的含量摸索出可行的方法與技術。

1　材料與方法

1.1藻種與試劑

杜氏藻藻種購自上海光語生物科技有限公司。根據其形態學和生理特征，經18S rRNA基因分析，鑒定為Dunaliella salina。

Na2SiO3·9H2O、乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，Na2EDTA）、FeCl3、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2MoO4·2H2O、MnCl2·4H2O、CuSO4、NaNO3、甲醇、HCl、NaOH均為分析純試劑北京化學試劑公司；VB1、VB12、生物素為藥品級（純度≥97%）市售；海水鹽Formular Distributor公司；乙腈、乙酸乙酯均為色譜純重慶迪馬工業有限責任公司；β-胡蘿卜素及參比樣品（C/N：22040-1G-F；紫外檢測純度≥97%）美國Sigma公司；葉黃素（高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測純度≥99%）浙江新昌制藥廠。

1.2儀器與設備

HPLC（由PU-2080和UV-2075組成）儀、白色（全波，25 W）、藍色（430 nm，25 W）、紅色（630 nm，25 W）水草燈日本Jasco公司；DiamonsilTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）迪馬公司；ST-80C型照度計北京師范大學光電儀器廠；DM500型顯微鏡德國Leica公司。

1.3方法

1.3.1培養液母液配制

用蒸餾水配制母液A（NaNO3：75 g/L）、B（NaH2PO4· 2H2O：5 g/L）、C（Na2SiO3·9H2O：20 g/L）、D（Na2EDTA：4.36 g/L）、E（FeCl3·6H2O：3.16 g/L）、F（CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O分別為：0.01、0.023、0.012、0.18、0.07 g/L）和G（VB1、VB12、生物素分別為：0.01、0.05×10-3、0.05×10-3g/L）備用。根據如前所述文獻報道［8-10，12］，在本研究中配制人工海水的海鹽質量濃度為160 g/L。將配制的人工海水和A、B、C、D、E、F液在121 ℃條件下滅菌20 min。用5 mL的一次性針頭吸取G母液，過0.22 μm濾膜，收集濾液。

1.3.2杜氏藻的培養及密度測定

在pH值實驗中，采用血球板計數法測定藻種每毫升培養液中的藻細胞數量（即藻養殖密度，單位：個/mL）。依次加0.2 mL的A、B、C、D、E、F、G母液于0.2 L的人工海水中，配成工作液。取3 mL工作液于10 mL試管中，用HCl和NaOH分別調每個試管中工作液的pH值，第1管調為pH 1，至第13管調為pH 13，合計13 管，為第1組。共做4 組，合計52 管。每管按V（藻種液）∶V（工作液）=1∶1接種。培養條件：溫度為23 ℃；白光水草燈照射；光照時間為每日14 h；光照度：4 000 lx。每天定時振搖試管2～3 次，使藻種保持良好懸浮狀態并與空氣充分接觸。分別于15、45、75、105 d計數1、2、3、4組中每管中的藻養殖密度。測定培養105 d藻液的pH值和培養液中β-胡蘿卜素和葉黃素的含量。

在不同照射光波長實驗中，采用血球板計數法測定藻種每毫升培養液中的藻細胞數量（即藻養殖密度）。依次加0.5 mL的A、B、C、D、E、F、G母液于0.5 L的人工海水中，配成工作液。取50 mL工作液于250 mL錐形瓶中，合計6 瓶，分3 組，每組2 瓶，分別用紅光、藍光、白光光源照射培養。每瓶按V（藻種液）∶V（工作液）=1∶1接種。培養條件：溫度為23 ℃；光照時間為每日14 h；光照度：4 000 lx。每天定時搖瓶2～3 次，使藻種保持良好懸浮狀態并與空氣充分接觸。分別于20、40 d計數每瓶中的藻養殖密度。測定40 d培養液中β-胡蘿卜素和葉黃素的含量。

1.3.3培養液中類胡蘿卜素的萃取

取3 mL培養液于10 mL離心管中，2 000 r/min離心3 min，棄去上清。向管中沉淀加入1 mL甲醇，超聲30 s，渦旋振蕩30 s，2 000 r/min離心1 min，收集甲醇萃取液，向黃色沉淀中加入1 mL乙酸乙酯，超聲30 s，渦旋振蕩30 s，2 000 r/min離心1 min，沉淀為白色，收集萃取液，與甲醇萃取液合并，濾液用甲醇定容至5 mL，過0.45 μm濾膜，供C18-HPLC分析。

1.3.4類胡蘿卜素組分的C18-HPLC檢測

HPLC條件：色譜柱為C18DiamonsilTM（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相A為乙腈-水（9∶1，V/V），流動相B為乙酸乙酯，流速為1 mL/min；檢測波長為450 nm；進樣量為20 μL；梯度：在20 min內，流動相B由0%上升至100%（線性）。根據與β-胡蘿卜素和葉黃素參比樣品的保留時間和光譜特征的比較，對樣品中β-胡蘿卜素和葉黃素組分定性。用葉黃素和β-胡蘿卜素參比樣品分別制作標準曲線。每根曲線由6 個點組成（包括原點），R2＞0.992 0。外標法定量樣品中β-胡蘿卜素和葉黃素組分。

1.3.5藻細胞中類胡蘿卜素含量的計算

藻細胞中各類胡蘿卜素組分（β-胡蘿卜素和葉黃素）的含量計算見下式。

式中：x為每個藻細胞中類胡蘿卜素組分的含量/（ng/個）；a為培養液類胡蘿卜素組分含量/（μg/mL）；b為每毫升培養液中藻細胞數量，即藻養殖密度/（個/mL）。

所有實驗重復3 次以上，取平行數據計算結果。藻計數和類胡蘿卜素含量分析數據的相對誤差均小于7%。

2　結果與分析

2.1 杜氏藻中類胡蘿卜素的C18-HPLC分離

圖2　杜氏藻萃取物的CC1188-HHPPLLCC圖Fig.2　C18-HPLC chromatogram of extracts from Dunaliella salina

圖2是一個典型的光合生物體脂溶性萃取物的C18-HPLC圖。主要脂溶性色素包括：葉綠素c、葉綠素d、葉黃素、β-胡蘿卜素等［19］。通過與β-胡蘿卜素和葉黃素參比樣品的保留時間和光譜特征比較，鑒定色譜圖上峰I和Ⅱ分別為葉黃素和β-胡蘿卜素。其中，β-胡蘿卜素作為葉黃素合成的前體而存在［20］。

2.2杜氏藻對環境pH值的調節能力

圖3　培養過程中培養液pH值的變化Fig.3　Variation in medium pH during culture

由圖3可知，盡管培養液的初始pH值不同（從1～13），經過105 d的藻培養，所有培養液的pH值均發生變化，趨向中性。初始pH值為1和2的培養液變成2；初始pH值為3和4的培養液變為5；初始pH值為5和6的培養液變為6；初始pH值為7～9的培養液最終變為7；初始pH值為10～13的培養液最終變為9。這是一個可能引起興趣的現象，合理的解釋是：杜氏藻作為一種生物，可以自身合成一些物質，并釋放到體外，調節環境的pH值，使環境發生有利于自己生存的變化。這一現象也可以解釋為酸性和堿性環境對于杜氏藻來說屬于逆境。這些逆境條件可以刺激杜氏藻體內的次生代謝系統合成某些次生代謝產物，用以調節環境pH值，使之向對自身生存有利的方向變化。當然，這些解釋需要通過進一步的實驗來證實。

目前，我國的主要杜氏藻養殖基地均位于內陸鹽湖上。這些湖泊的pH值均偏堿性。在本研究中觀察到的現象提示：在這些鹽湖中大量生長的杜氏藻可能對湖水的pH值有一定的調節作用。這一作用需要引起應有的關注，并做進一步的研究來證實。

2.3培養基初始pH值對藻養殖密度的影響

圖4　培養基初始pH值對藻養殖密度的影響Fig.4　Effect of initial medium pH on Dunaliella salina culture density

圖4為不同初始pH值的培養基對藻養殖密度的影響。從三者的比較可以看出：杜氏藻在初始中性（pH 4～9）條件下培養時，其養殖密度的增加是最大的。相對比較起來，其養殖密度在初始酸性（pH 1～3）條件下的增長幅度較其在初始堿性（pH 10～13）條件下的增長幅度要大。當初始pH值為2和10時，杜氏藻的養殖密度增幅極小，基本上處于生長停滯的狀態。本實驗的結果表明：初始pH值為2和10的環境可抑制杜氏藻的生長。其代謝方面的特點有待于進一步探索。當初始pH值為4時，杜氏藻培養液中的養殖密度達到1 851 個/mL，增幅最大，超過了其在初始pH值為7時的增幅。這也是一個值得深入研究的現象。本研究中觀察到：當培養基初始pH值為14時，在顯微鏡下觀察，杜氏藻細胞全部死亡，這一現象表明：杜氏藻存活的pH值上限為13。

如前所述，在我國，無論是在沿海的鹽田，還是在內陸的鹽湖環境中，高鹽堿性的條件比較常見，高鹽酸性條件少見。本實驗結果表明，如果在杜氏藻的養殖生產中調整接種時的初始pH值為4，可以獲得較大的藻養殖密度。這一結論有待于大規模養殖實驗來證實。

圖5　培養105 d后的藻養殖密度Fig.5　Dunaliella salina culture density after 105-day culture

由圖5可知，當培養基初始pH值為4～9時，經過105 d的培養，培養液中藻的養殖密度較高，其中初始pH 4時，培養液中藻的養殖密度最高；當初始pH值為1和3時，培養液中藻的養殖密度其次；初始pH值為2和10時，藻生長極緩慢，養殖密度基本沒有增加；當初始pH值為11～13時，培養液中藻的養殖密度較低。

2.4不同初始pH值培養105 d后培養液中的類胡蘿卜素含量

圖6　不同初始pH值培養105 d后培養液中的類胡蘿卜素含量Fig.6　Carotenoid content in culture liquid after 105 days of culture

由圖6可知，當培養基初始pH值為7～9時，經過105 d的培養，培養液中β-胡蘿卜素和葉黃素的含量較高，β-胡蘿卜素含量達到0.489～0.561 μg/mL，葉黃素含量達到0.610～0.700 μg/mL。其中，當培養基初始pH值為7時，培養液中的葉黃素和β-胡蘿卜素的含量最高，這很可能是由于在此條件下藻養殖密度較高造成的。與之相比，當培養基初始pH值為4時，培養液中藻養殖密度最大，但葉黃素和β-胡蘿卜素含量并不高。這一現象表明，培養基初始pH值為4時，杜氏藻細胞中類胡蘿卜素的合成水平較低。

2.5不同初始pH值培養105 d后藻細胞中的類胡蘿卜素含量

由圖7可知，當培養基初始pH值為11～13時，經過105 d的培養，單個細胞內，β-胡蘿卜素含量達到0.603～0.730 ng，葉黃素含量達到0.897～0.979 ng。這說明初始培養條件為強堿性時，杜氏藻體內的類胡蘿卜素合成可達到較高水平。

這一觀察結果可為生產實踐提供有價值的改進思路。例如：培養基初始pH值為4時，培養液中的藻養殖密度可達到最高。培養基初始pH值為11～13時，杜氏藻養殖體內類胡蘿卜素合成水平可達到最大水平。

圖7　不同初始pH值培養105 d后單個細胞中的類胡蘿卜素含量Fig.7　Carotenoid amount in single cells after 105-day culture

2.6不同照射光波長對藻養殖密度的影響

圖8　不同照射光波長對藻養殖密度的影響Fig.8　Effect of illumination wavelength on Dunaliella salina culture density

由圖8可知，杜氏藻養殖密度在430 nm（藍光）、630 nm（紅光）和全波長光（白光）的照射下均增加，且增加幅度接近，白光照射的效果略好。培養40 d后，白光、紅光、藍光照射的藻養殖密度分別為1 205、1 008、1 043 個/mL。

2.7不同光照培養40 d后培養液中類胡蘿卜素的含量

圖9　不同光照下培養40 d后培養液中的類胡蘿卜素含量Fig.9　Carotenoid contents in culture liquid after 40-day culture under illumination at different wavelengths

由圖9可知，藍光和紅光照射均可增加培養液中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量。其中藍光效果更顯著。

2.8不同光照培養40 d后杜氏藻單個細胞中類胡蘿卜素的含量

由圖10可知，與白光照射相比，藍光和紅光照射均可明顯增加杜氏藻單個細胞中的葉黃素和β-胡蘿卜素的含量。其中藍光效果更顯著，單個細胞中葉黃素含量達到0.524 ng，β-胡蘿卜素含量達到0.589 ng。培養40 d后培養液中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量增加可能是由于藻細胞中二者積累量增加所致。

圖10　不同光照下培養40 d后單個細胞中類胡蘿卜素的含量Fig.10　Carotenoid amount from single cells after 40-day culture at different wavelength lights

3　結 論

本實驗結果表明：不同波長的照射光對杜氏藻的養殖密度影響并不大。但無論是長波長光還是短波長光（如紅光或藍光）均可增加藻細胞內類胡蘿卜素的積累水平，其中短波長光的效果更為明顯。在藻的養殖過程中調節環境pH值、進行雙波長光照等設想可以用以增加類胡蘿卜素類物質在藻細胞中的積累。這些設想在經過大規模生產實踐的檢驗后，對生產技術的改進具有一定的實用意義。

人們對杜氏藻感興趣主要是由于其可以自身合成并積累豐富的β-胡蘿卜素。這使得杜氏藻具有被應用于商業生產的價值。第一個使用杜氏藻生產β-胡蘿卜素的試點工廠成立于1966年，由前蘇聯建設。從此圍繞這種嗜鹽微生物，一項成功的高科技產業逐步發展成型。目前，這一技術已發展成在精細條件控制下的高密度集約化養殖技術。同時，國內對杜氏藻中類胡蘿卜素類物質相關合成酶的表達研究也已展開［21］，這有助于從分子層面解釋培養條件對杜氏藻中類胡蘿卜素類物質代謝的影響。

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Effects of Culture Medium pH and Illumination Wavelength on Carotenoid Content of Dunaliella salina

WANG Zi， HUI Bodi*， GONG Ping
（College of Applied Arts and Science， Beijing Union University， Beijing100191， China）

This study aims to explore the effects of initial pH of culture medium and different illumination wavelengths on the contents of carotenoids including β-carotene and lutein from Dunaliella salina during culture. In experiments， media with different pH values were prepared and used to culture Dunaliella salina for 105 days. Under the illumination of white（full wavelengths）， red （630 nm） and blue light （430 nm）， medium with pH 7 was applied to culture Dunaliella salina for 40 days. Dunaliella salina culture density was then determined while β-carotene and lutein contents were assessed from culture liquid. Data obtained from the experiments suggested that： 1） Dunaliella salina was able to adjust the environmental pH to neutral. After 105-day culture， an increased Dunaliella salina culture density was observed from culture liquids with original pH 10-13， pH 1-3 and pH 4-9 while the maximum Dunaliella salina culture density was counted at pH 4 （1 851 cell counts/mL）. Higher β-carotene （0.489-0.561 μg/mL） and lutein （0.610-0.700 μg/mL） contents were observed from culture liquids with original medium pH 7-9， while higher β-carotene （0.603-0.730 ng） and lutein （0.897-0.979 ng） contents were seen from single cells with original medium pH 11-13； 2） Dunaliella salina culture density could increase under illumination at the full-range wavelength， red （630 nm） and blue light （430 nm） after 40- day culture. Both red and blue lights were able to induce increased contents of β-carotene （0.589 ng） and lutein （0.524 ng） from single cells while blue light was the most effective.

Dunaliella salina； carotenoid； lutein； β-carotene

TS202.3

A

1002-6630（2015）23-0183-06

10.7506/spkx1002-6630-201523034

2015-01-14

北京聯合大學2015年“啟明星”大學生科技創新項目（201511417SJ061）

王梓（1993—），女，本科，研究方向為食品科學與工程。E-mail：530767155@qq.com

惠伯棣（1959—），男，教授，博士，研究方向為類胡蘿卜素化學及生物化學。E-mail：bodi_hui@buu.edu.cn