保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體制備及融合

王慕華，潘佩平，趙玉明，2，蘇檳楠，蔡穎慧，李海濤，2

（1.山西省生物研究所，山西 太原　030006；2.山西維爾生物乳制品有限公司，山西 太原　030006）

保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體制備及融合

王慕華1，潘佩平1，趙玉明1，2，蘇檳楠1，蔡穎慧1，李海濤1，2

（1.山西省生物研究所，山西 太原030006；2.山西維爾生物乳制品有限公司，山西 太原030006）

為獲得具有抗噬菌體功能且發酵性能優良的乳酸菌融合子，采用單親滅活及正交分析方法，研究了保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌 體菌株的原生質體制備及融合條件。結果表明：保加利亞乳桿菌原生質體制備的最適條件是以磷酸鹽緩沖液和甘露醇制作的高滲溶液為原生質體穩定劑，1.0 mg/mL的溶菌酶36 ℃處理30 min，原生質體的形成率為（89.02±2.31）%，再生率為（4.62±0.22）%。嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質體制備的最適條件是以Tris-HCl和蔗糖制作的高滲溶液為原生質體穩定劑，0.1 mg/mL的溶菌酶42 ℃處理30 min，原生質體的形成率為（99.15±0.23）%，再生率為（5.79±0.17）%。單親滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質體融合的最適條件為聚乙二醇6000（質量濃度為400 g/L，添加0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2）40 ℃促融2 min，融合率可達（1.85±0.12）×10-6。所得融合子各項性能優良，適合于酸奶生產。

保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株；原生質體制備；原生質體融合

原生質體融合因其具有重組頻率高［1］、遺傳穩定、可實現遠緣雜交［2］、可集合雙親優良性狀等優點，在微生物育種領域得到廣泛應用［3-5］。保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌作為酸奶生產的主要菌株，通常認為二者具有互惠共生關系［6］，在牛奶發酵過程中協同作用，使得牛乳凝固時間縮短，產品黏度增加，產品風味增強［7-8］。近年來也有學者認為某些嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌之間也存在拮抗抑制作用［9］，混合發酵時菌體量的比例不合適或條件控制不當就會直接影響到酸奶的生產時間與品質。同時，噬菌體污染一直是困擾乳品發酵業的一大難題，為酸奶發酵選育出既具有抗噬菌體功能又具有優良生產性狀的菌株，成為乳制品企業目前亟待解決的問題［10-12］。

本實驗從生產實際出發，研究了保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體制備與再生條件，以及二者的融合條件與融合子的篩選。得到的融合子一方面保持了嗜熱鏈球菌的噬菌體抗性，另一方面又結合了保加利亞乳桿菌的優良性狀且融合子易于培養，有望實現酸奶發酵時單一菌株發酵，為酸奶發酵菌株的選育提供一條新途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株（Streptococcus thermophilus，S. t）由山西省生物研究所選育、保藏。

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，L. b）由山西維爾生物乳制品有限公司提供，山西省生物研究所保藏。

噬菌體：3 種噬菌體混合液，由山西省生物研究所分離、保藏。

1.1.2溶液與試劑

高滲溶液Ⅰ［13］：0.5 mol/L蔗糖溶液中加入0.02 mol/L順丁烯二酸，調整pH值為6.5，再加入0.02 mol/L MgCl2。

高滲溶液Ⅱ［14-15］：10 mmol/L Tris-HCl中加入0.5 mol/L蔗糖和0.02 mol/L MgCl2，用4 mol/L HCl溶液調節pH值至6.5。

高滲溶液Ⅲ［16］：0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（265 mL 0.2 mol/L Na2HPO4+735 mL 0.2 mol/L NaH2PO4，pH 6.4）中加入0.8 mol/L甘露醇。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000：高滲溶液配制為400 g/L，并向其中加入0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2。

溶菌酶液：高滲溶液配制為10 mg/mL的酶原液，現用現配，過濾除菌。

溶菌酶（22 800 U/mg）美國BBI公司；其他常規試劑均為國產分析純。

1.1.3培養基

MRS培養基［17］：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 l mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，固體培養基添加15 g的瓊脂，用于保加利亞乳桿菌的培養。

M17培養基［17］：植質蛋白胨5.0 g、聚蛋白胨5.0 g、酵母提取物5.0 g、牛肉浸膏2.5 g、抗壞血酸0.5 g、β-甘油磷酸二鈉19.0 g、1.0 mol/L MgSO4·7H2O 1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8，固體培養基添加15 g的瓊脂，用于嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的培養。

原生質體再生培養基［13］：MRS、M17再生培養基為在其原有配方的基礎上添加0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L MgCl2。

脫脂乳培養基：牛乳脫脂后115 ℃滅菌15 min，冷卻后置于冰箱冷藏備用，用于菌種的活化和菌株發酵性能的研究。

1.2儀器與設備

PHS-3C雷磁pH計上海精密科學儀器有限公司；NDJ-1型旋轉黏度計上海天平儀器廠；SLJ-Ⅰ型離心機沈陽理化儀器廠；722PC可見分光光度計上海佑科儀器儀表有限公司；WS2-134-75電熱恒溫培養箱連云港醫療器械設備廠；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫療儀器廠；JT-型超凈工作臺常州第二航海儀器廠。

1.3方法

1.3.1指標測定方法

噬菌體效價：采用雙層瓊脂平板法［18］測定；酸奶中酸度：按GB 5409—85《牛乳檢驗方法》中滴定法測定；pH值：采用雷磁PHS-3C精密酸度計于室溫測定；黏度：采用NDJ-1型旋轉黏度計，取牛乳發酵后冷藏過夜的樣品進行測定。

1.3.2保加利亞乳桿菌L. b及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t的培養

1.3.2.1菌體活化培養

將菌株從保存管中取出，以3%的接種量接種于脫脂乳培養基中，菌株S. t 42 ℃培養4～6 h，菌株L. b 40 ℃培養10～12 h，連續活化2 代。

1.3.2.2菌體生長曲線的測定

菌種活化后，將菌株S. t接入M17液體培養基中，42 ℃培養24 h；將菌株L. b接入MRS液體培養基中，40 ℃培養24 h。每隔2 h取樣，稀釋后涂平板、計數，以培養時間為橫坐標，相應的活菌體數為縱坐標，繪制生長量變化曲線。

1.3.3原生質體的制備及再生［19］

影響原生質體制備及再生的因素除菌體菌齡及合適的酶系外［20］，還與維持原生質體穩定的高滲溶液、酶質量濃度、酶解溫度、酶解時間等有關［16］，在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體制備中采用溶菌酶作為去璧酶系，設計正交試驗確定其他酶解條件。

取菌株L. b和菌株S. t對數生長期的培養菌液15 mL，4 000 r/min離心10 min，去上清液。用5 mL高滲溶液反復洗滌兩次，去上清液。最后用15 mL高滲溶液懸浮即得菌體懸浮液，調整菌體濃度為109CFU/mL，分別取1 mL稀釋后涂MRS、M17平板，計數。另取1 mL調整好的菌體懸浮液，加入終質量濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg/mL的溶菌酶，于30、36、42 ℃恒溫酶解30、40、50 min。酶解后的菌液用高滲溶液洗滌兩次，用1 mL高滲溶液懸浮得到原生質體液。將菌株L. b的原生質體液用高滲溶液適當稀釋后分別涂布于MRS及MRS再生培養基，40 ℃恒溫培養3～5 d。將菌株S. t的原生質體液用高滲溶液適當稀釋后分別涂布于M17及M17再生培養基，42 ℃恒溫培養3～5 d，測定菌株L. b和菌株S. t原生質體的形成率和再生率。

式中：A為酶解前的總菌落數/（CFU/mL），通過菌體懸浮液涂皿計數所得；B為未形成原生質體的菌落數/（CFU/mL），通過原生質體液涂皿計數所得；C為酶解后的再生菌菌落數/（CFU/mL），通過原生質體液涂再生培養基平皿計數所得。

1.3.4保加利亞乳桿菌L. b的原生質體滅活［21］

取菌株L. b對數生長期MRS培養菌液30 mL，4 000 r/min離心10 min，去上清液。用10 mL高滲溶液反復洗滌兩次，去上清液。最后用30 mL高滲溶液懸浮，在合適條件下溶菌酶酶解，進行原生質體制備。酶解結束后將原生質體液適當稀釋，涂MRS再生培養基平皿，40 ℃培養3～5 d后計數。同時將原生質體液分為3 份，每份8 mL，分別于60、70、80 ℃進行原生質體滅活。每隔10 min取樣，顯微鏡觀察原生質體形態并適當稀釋后涂MRS再生培養基平皿，40 ℃培養3～5 d后計數。

式中：A1為滅活前長出的菌落數/（CFU/mL）；A2為滅活后長出的菌落數/（CFU/mL）。

1.3.5保加利亞乳桿菌L. b和嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t的原生質體融合

1.3.5.1原生質體的融合

取等量的菌株L. b原生質體滅活液和菌株S. t原生質體液混合，取樣分別涂M17、M17再生平皿，混合后放置5 min，2 500 r/min離心10 min，收集原生質體，于沉淀中加入0.2 mL高滲溶液充分懸浮，再加入1.8 mL PEG 6000溶液，混勻后分別于30、35、40、45 ℃處理2、5、10 min，2 500 r/min離心10 min后，除去上清，沉淀懸浮于2 mL高滲溶液中，將懸浮液適當稀釋后涂MRS再生平皿。M17平皿42 ℃，培養48 h后計數；M17、MRS再生平皿42 ℃，培養3～5 d后計數。

1.3.5.2融合子的篩選

菌株L. b可以在MRS、M17培養基上生長且對本實驗用到的噬菌體敏感，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t在MRS培養基上非厭氧培養時不生長。融合前將菌株L. b的原生質體進行滅活，對融合后得到的在MRS培養基生長的菌株進行噬菌體抗性檢測，能在MRS培養基上生長且具有噬菌體抗性的菌株即為融合子。

式中：D為融合子數；E為融合前在M17再生培養基上長出的菌落數/（CFU/mL）；F為融合前在M17培養基上長出的菌落數/（CFU/mL）。

1.3.5.3融合子的穩定性實驗

將獲得的融合子以3%接種量與1%噬菌體（109PFU/mL）在牛乳培養基中共同傳代15 代，取第5、10、15代適當稀釋后涂MRS培養基平皿普通培養，計算活菌數并在傳代后觀察融合子的菌體形態，測定融合子的穩定性。

1.3.5.4融合子的發酵特性

將所獲得的融合子以3%的接種量接入150 mL滅菌牛乳中，42 ℃培養，每隔2 h測定其活菌數及pH值。以菌株L. b、S. t及L. b與S. t混合發酵為對照，發酵結束后，統計融合子的凝乳時間、黏度及滴定酸度。

2　結果與分析

2.1菌體生長情況

圖1　菌株生長曲線Fig.1　Growth curves of L. bulgaricus and S. thermophilus

對菌株S. t和L. b的菌體生長情況進行測定，其生長曲線如圖1所示，菌株S. t和L. b均為培養5 h后進入對數生長期。菌株S. t培養12 h后進入對數生長后期，14～16 h達到穩定期；菌株L. b培養14 h后進入對數生長后期，16～18 h達到穩定期。一般原生質體制備時選用對數生長早、中期的細胞，此時細胞壁對酶解敏感，原生質體形成率高［22］，因而選用培養10 h的菌株S. t、培養12 h的菌株L. b用于原生質體的制備。

2.2保加利亞乳桿菌L. b的原生質體制備及再生

2.2.1最佳原生質體制備條件的確定

通過正交試驗確定菌株L. b的最佳酶解條件，每個試驗號重復3 次，其正交試驗方案及結果見表1。影響菌株L. b原生質體形成的主要因素為溶菌酶的質量濃度，其次為酶解溫度，原生質體穩定液和酶解時間影響不是很大。從正交表得出的最佳酶解條件為：A2B3C2D2，即原生質體穩定液選擇高滲溶液Ⅱ、酶質量濃度為1.0 mg/mL、酶解溫度為36 ℃、酶解時間為40 min，在此條件下進行菌株L. b的原生質體制備，原生質體形成率為（91.50±2.62）%。

表1　菌株L. b原生質體制備條件的正交試驗設計方案及結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results on protoplast formation of L. bulgaricus

2.2.2原生質體形成率與再生率的關系

由表1可知，原生質體的形成率與再生率并不成正比，3號原生質體的形成率比較高，而再生率低，究其原因可能是因為3號原生質體制備時酶解溫度比較高、酶解時間比較長，這些雖然有利于原生質體的形成，但有可能在這種條件下菌體去壁后，菌體內的其他成分或結構也遭到破壞，抑制了原生質體的再生。相比而言9號原生質體的形成率與再生率都比較高，其酶解條件為：原生質體穩定液選擇高滲溶液Ⅲ、酶質量濃度為1.0 mg/mL、酶解溫度為36 ℃、酶解時間為30 min。與正交試驗得到的最佳酶解條件相比，原生質體穩定液不同，酶解時間縮短。通過正交極差分析，原生質體穩定液和酶解時間不是影響原生質體形成的主要顯著因素，因此，綜合考慮得出菌株L. b的最優原生質體制備條件為：原生質體穩定液選擇高滲溶液Ⅲ、酶質量濃度為1.0 mg/mL、酶解溫度為36 ℃、酶解時間為30 min。這時原生質體的形成率為（89.02±2.31）%，再生率為（4.62±0.22）%。

2.2.3保加利亞乳桿菌L. b原生質體形態

圖2 菌株L. b（A）與其原生質體（B）形態圖（×1 000）Fig.2 Micrograph of L. bulgaricus （A） and its protoplast （B） （ 1 000）

菌株L. b原生質體制備后的菌體形態如圖2，菌株L. b為桿狀，原生質體呈圓形或橢圓形且染色較淺。

2.3保加利亞乳桿菌L. b的原生質體滅活

在細胞融合之前對菌株L. b的原生質體進行滅活，原生質體滅活的方式通常有紫外線照射和高溫處理［23］。高溫處理對遺傳物質的傷害比較小，破壞作用主要在細胞質中的蛋白和核糖體，原生質體中的染色體仍具有復制、重組功能，可以起到遺傳物質的載體作用［24］。在不同溫度條件下菌株L. b原生質體的滅活率隨時間變化的關系見圖3。

圖3 菌株L. b原生質體滅活溫度和時間對滅活率的影響Fig.3 Effect of inactivation time and temperature on inactivation rate of L. bulgaricus protoplasts

由圖3可知，滅活40 min后菌株L. b的原生質體滅活率都可達到98%以上，一般認為DNA的變性溫度為80 ℃，考慮到溫度越高，對遺傳物質的破壞越大，所以采用60 ℃、50 min作為保加利亞乳桿菌原生質體的滅活條件。此條件下，原生質體的滅活率為（98.64±0.52）%。

2.4嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t的原生質體制備及再生

2.4.1最佳原生質體制備條件的確定

通過正交試驗確定菌株S. t的最佳酶解條件，每個試驗號重復3 次，其正交試驗方案及結果見表2。

表2　菌株S. t原生質體制備條件的正交試驗設計方案及結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results on protoplast formation of S. thermophilus

由表2可知，影響菌株S. t原生質體形成的主要因素為酶解溫度和原生質體穩定液，溶菌酶的質量濃度影響不是很大，酶解時間幾乎沒有影響。從正交表得出的最佳酶解條件為：A2B1C3D1，即原生質體穩定液選擇高滲溶液Ⅱ、酶質量濃度為0.1 mg/mL、酶解溫度為42 ℃、酶解時間為30 min，在此條件下進行菌株S. t的原生質體制備，原生質體形成率為（99.15±0.23）%。菌株S. t在溫度比較高的情況下，較低的酶質量濃度、較短的酶解時間即可完成原生質體的形成。其中在高滲溶液Ⅱ中原生質體的形成率比較高的原因還不是很清楚。

2.4.2原生質體形成率與再生率的關系

同時由表2可知，正交試驗中的3號原生質體的形成率比較高，而再生率低。在酶解時3號的酶解條件為：原生質體穩定液選擇高滲溶液Ⅰ、酶質量濃度1.0 mg/mL、酶解溫度42 ℃、酶解時間50 min，不利于原生質體的再生。比較而言，4、5、6號原生質體形成率、再生率都比較高，其共同點為以高滲溶液Ⅱ作為原生質體穩定液，因而可以認為高滲溶液Ⅱ有益于嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質體的形成與再生。綜合考慮確定菌株S. t原生質體制備的最優條件為：原生質體穩定液選擇高滲溶液Ⅱ、酶質量濃度為0.1 mg/mL、酶解溫度為42 ℃、酶解時間為30 min。這時原生質體的形成率為（99.15±0.23）%，再生率為（5.79±0.17）%。

2.4.3嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t原生質體形態

圖4 菌株S. t（A）與其原生質體（B）形態圖（×1 000）Fig.4 Micrograph of bacteriophage-resistant S. thermophiles and its protoplast （B） （ 1 000）

菌株S. t原生質體制備后的菌體形態如圖4所示，菌株S. t為鏈狀球菌，原生質體呈圓形且染色較淺。

2.5保加利亞乳桿菌L. b與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t原生質體融合條件的確定

在原生質體制備時，菌株L. b選用高滲溶液Ⅲ，菌株S. t選用高滲溶液Ⅱ作為原生質體穩定液。因為原生質體穩定液對菌株L. b原生質體的制備與再生影響不大，所以融合時采用高滲溶液Ⅱ作為共同的原生質體穩定液。溫度及融合時間對融合率的影響見圖5。

圖5　融合溫度和時間對原生質體融合率的影響Fig.5　Effects of temperature and time on protoplast fusion rate

由圖5可知，溫度高或低都不利于原生質體的融合。溫度高的情況下，雖有利于菌體的流動性及通透性，但在高溫時，溫度及外界環境中PEG等對原生質體的損傷也加劇，不利于融合子的再生；溫度低的情況下，菌體的活性及融合環境的流動性較弱，不利于菌體的接觸與融合。從圖中可知融合時間也不宜太長，隨著融合時間的增加，融合率逐漸降低，這可能是PEG處理時間過長，會對原生質體造成一定的毒性，從而導致其失活［24］。最佳融合條件為：40 ℃，融合2 min，此時融合率為（1.85±0.12）×10-6。

2.6融合子的檢出及穩定性檢測

融合后MRS再生培養基上長出20 株再生菌落，經噬菌體檢測后挑出12 株融合子，對12 株融合子進行傳代穩定性實驗，其中3 株傳15 代后仍具有噬菌體抗性且在MRS培養基上生長良好，3 株融合子傳代后在MRS培養基上的生長情況如表3所示，以Rh6在MRS培養基上生長最好，其菌體形態如圖6所示。與出發菌株相比，融合子Rh6呈橢圓形近似短桿，而菌株L. b為長桿狀，菌株S. t為圓形。

表3　融合子在MRS培養基上的生長情況Table 3 Growth status of fusants in MRS culture medium 109 CFU

圖6　融合前后菌體形態（×1 0000）Fig.6　Micrograph of L. bulgaricus and S. thermophilus as well as their fusants　（×11　000000）

由表3、圖6可知，融合子Rh6與噬菌體共同傳代15 代后仍具有噬菌體抗性，在牛乳培養基中可正常生長、凝乳，將傳15 代后的融合子涂布于MRS培養基上仍生長良好，菌體形態與剛篩選到時一致且異于出發菌株，因此可認為篩選到的融合子Rh6具有遺傳穩定性。

2.7融合子的發酵特性

2.7.1融合子Rh6牛乳發酵過程中的活菌數及pH值

圖7　發酵過程中的活菌數及ppHH值Fig.7　Number of viable bacteria and pH during fermentation

由圖7可知，融合子Rh6在牛乳發酵過程中的活菌數和pH值與通常酸奶發酵過程中使用兩種菌的差異不大，融合子的發酵條件比較好控制且不存在如何在發酵中控制兩種菌比例的問題。

2.7.2融合子Rh6的發酵結果及感官風味評價

對融合子Rh6進行牛乳發酵實驗。3%接種量，42 ℃酸奶發酵，發酵結果如表4所示，發酵后的酸奶細膩黏稠，乳香濃郁，酸甜適中，稍有乳清析出。從理化指標及感官風味評價，融合子適合于酸奶生產。

表4　融合子Rh6牛乳發酵結果Table 4　Fermentation performance of fusion Rh6

3　結 論

保加利亞乳桿菌L. b在原生質體制備時酶質量濃度的影響比較大，這與菌株L. b細胞壁比較致密且對溶菌酶不是很敏感［19］有關，在酶解過程中需要較高的酶質量濃度。在較高酶質量濃度的情況下，隨著酶解時間的延長，原生質體的形成率雖可提高，但再生率會有所下降。對嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t而言，比較高的溫度有益于原生質體的形成，在以高滲溶液Ⅱ為原生質體穩定液時，菌株S. t原生質體的形成率和再生率最高，這可能與菌株S. t自身的細胞及細胞壁結構有關，具體原因尚不明確。

關于保加利亞乳桿菌L. b與嗜熱鏈球菌S. t原生質體的融合曾獻春等［16，25］曾有報道，本實驗通過單親滅活及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t在MRS培養基上不生長的特性篩選融合子，避免了篩選的盲目性。同時融合子未引入外源基因且集合了雙親的優良性狀，篩選到的融合子沒有安全隱患、具有抗噬菌體功能、在進行酸奶發酵時發酵特性優良，可以用于酸奶生產。

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Protoplast Formation and Fusion between Lactobacillus bulgaricus and Bacteriophage-Resistant Mutant of Streptococcus thermophilus

WANG Muhua1， PAN Peiping1， ZHAO Yuming1，2， SU Binnan1， CAI Yinghui1， LI Haitao1，2
（1. Biology Institute of Shanxi， Taiyuan030006， China； 2. Shanxi Veal Biological Dairy Products Co. Ltd.， Taiyuan030006， China）

Primary factors affecting protoplast formation and regeneration of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were investigated using orthogonal array design to obtain fusants with bacteriophage resistance and superior fermentation performance. The results showed that the optimal preparation conditions for L. bulgaricus protoplasts were achieved by treatment with 1.0 mg/mL lysozyme for 30 min at 36 ℃ in the presence of hypertonic solution with phosphate buffer and mannitol. Under these conditions， the protoplast formation and regeneration rates reached（89.02 ± 2.31）% and （4.62 ± 0.22）%， respectively. The protoplast formation and regeneration rates of bacteriophage-resistant S. thermophilus were up to （99.15 ± 0.23）% and （5.79 ± 0.17）% after treatment with 0.1 mg/mL lysozyme for 30 min in the presence of hypertonic solution with Tris-HCl buffer and sucrose. The fusion rate of protoplasts between L. bulgaricus and S. thermophilus reached （1.85 ± 0.12） × 10-6after infusion for 2 min at 40 ℃ in the presence of 400 g/L PEG6000，0.01 mol/L CaCl2and 0.02 mol/L MgCl2. The performance of the fusant is stable and it is applicable to yoghurt production.

Lactobacillus bulgaricus； bacteriophage-resistant mutant of Streptococcus thermophilus； protoplast formation；protoplast fusion

Q813.2；Q939.117

A

1002-6630（2015）23-0189-06

10.7506/spkx1002-6630-201523035

2015-01-04

山西省農業科技攻關計劃項目（20120311030）

王慕華（1975—），女，副研究員，碩士，研究方向為工業微生物，乳品發酵。E-mail：wang_muhua@126.com