LYC-B基因沉默對紫色番茄果實主要色素及揮發性物質的影響

呂　潔，梁　燕*，趙菁菁，張　顏，常培培，秦　蕾，李云洲

（西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌　712100）

LYC-B基因沉默對紫色番茄果實主要色素及揮發性物質的影響

呂潔，梁燕*，趙菁菁，張顏，常培培，秦蕾，李云洲

（西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌712100）

利用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術，抑制紫色番茄果實成熟過程中番茄紅素β-環化酶（LYC-B）基因的表達，并分析番茄果實中主要色素及揮發性物質的種類與含量變化。結果表明：LYC-B基因沉默可提高紫色番茄果實中番茄紅素的含量；頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術檢測到6-甲基-5-庚烯-2-酮等類胡蘿卜素相關的揮發性物質的含量增加，反-2-辛烯醛、己醇、反-2-庚烯醛、水楊酸甲 酯和順-3-己烯醇等主要揮發性物質的釋放量增加。因此，LYC-B基因沉默可以增加番茄紅素及部分主要揮發性物質的含量，影響番茄果實的營養品質和風味品質。

番茄；LYC-B基因沉默；番茄紅素；揮發性物質

番茄（Solanum lycopersicum L.）具有豐富的營養物質，如類胡蘿卜素、維生素、氨基酸等，并因其風味多樣而深受消費者青睞。類胡蘿卜素是植物天然色素的總稱，在預防人類疾病和維持健康方面有重要作用［1］。類胡蘿卜素也是一些重要揮發性物質的前體，這些物質為番茄果實提供特殊的香氣，決定著番茄果實的風味品質［2］。類胡蘿卜素降解途徑是形成番茄果實風味品質的最重要途徑［3］，其含量直接影響著類胡蘿卜素衍生揮發性物質的釋放［4］，例如6-甲基-5-庚烯-2-酮、牻牛兒基丙酮、β-紫羅蘭酮及相關成分均來自類胡蘿卜素的氧化分解［2］。番茄紅素作為主要的類胡蘿卜素，對番茄果實風味物質形成具有重要的貢獻［5］。Fay等［6］發現番茄紅素特效裂解過氧化酶BoLCD可以裂解番茄紅素形成6-甲基-5-庚烯-2-酮，可提高番茄果實的風味品質。

番茄紅素β-環化酶（LYC-B）基因是類胡蘿卜素代謝中番茄紅素向下游轉化的關鍵酶基因［7］，可以催化番茄紅素分子的兩個末端形成β-環，即形成β-胡蘿卜素。徐加新等［8］研究表明，反義LYC-B基因可以提高番茄果實中番茄紅素的含量。目前對LYC-B基因與其他色素及揮發性物質的關系研究較少。

紫色番茄作為新興的番茄品種，具有極強的抗氧化性等營養保健功能，風味獨特［9］。本實驗室常培培等［10］對其果實揮發性物質進行了系統全面的分析鑒定，本實驗將在此基礎上，利用病毒誘導的基因沉默技術［11-12］，探究類胡蘿卜素代謝途徑中關鍵酶基因LYC-B與紫色番茄果實中主要色素及揮發性物質間的關系，為番茄品質性狀研究與改良提供理論依據和實踐基礎。

1　材料與方法

1.1材料、菌種與試劑

供試紫色番茄品種為黑櫻桃（保存單位編號：CI5004），果皮無色，果肉紫紅色，由西北農林科技大學園藝學院番茄育種課題組提供。2014年3月底定植于園藝學院實驗農場塑料大棚內，當植株第三花序第一、二朵花開放時掛牌標記開花期。在果實綠熟期［13］（開花后30 d，此時果實充分長大，果色綠色，肉質堅硬）采收果實，離體條件下進行實驗。

農桿菌GV3101、pTRV1、pTRV2和pTRV2：PDS等由園藝學院番茄育種課題組保存提供。

內切酶、連接酶Fermentas公司；反轉錄試劑盒大連寶生物工程公司；2-壬酮（色譜純）上海邁瑞爾公司；氯化鈉（分析純）、番茄紅素標品（色譜純）北京中科儀友化工技術研究院。

1.2儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀、IQ5實時熒光定量PCR擴增儀美國Bio-Rad公司；LC-20A高效液相色譜日本島津公司；ISQ氣相色譜-質聯用儀（Xcalibur1.2數據處理系統）美國Thermo Fisher Scientific公司；HP-INNOWAX彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 .m）、恒溫磁力攪拌器美國Troemner公司；100 μm PDMS固相微萃取頭、SPME手動進樣手柄美國Supelco公司；勻漿機美的集團。

1.3方法

1.3.1VIGS病毒載體pTRV2：LYC-B的構建

VIGS誘導基因沉默是指攜帶目的基因片段的pTRV2與pTRV1混合后浸染植物后，可誘導植物內源目的基因沉默。根據美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上登錄的番茄紅素β-環化酶（登錄號為X86452.1）序列，選取3'端375 bp特異性較強的片段，添加BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點，共392 bp，設計引物為LYC-B F：5'-CGC GGA TCC CAT CAC TCG TAG CTC GTC-3'；LYC-B R：5'-GCT CTA GAT ATC CAT ACC GAA GCA GA-3'。載體構建過程參照李翠［14］的方法。

1.3.2VIGS誘導番茄果實LYC-B基因沉默

處理設置：以注射pTRV2：LYC-B菌液的果實為沉默LYC-B基因的處理，pTRV2：00為陰性對照，pTRV2：PDS為陽性對照，未注射菌液為空白對照。

番茄果實注射浸染：參照Orzaez等［15］的方法對果實進行注射處理。將含有pTRV2：LYC-B、pTRV2：00和pTRV2：PDS質粒的菌液分別在LB篩選培養基中振蕩過夜，取培養產物以1∶25的比例稀釋于誘導培養基中，培養至OD600nm為0.5～0.8。培養產物離心后，使用懸浮培養基MgCl2+MES（10 mmol/L，pH 5.5）等體積懸浮菌體，再次離心后，重懸菌體并調節OD600nm為1.0。同樣方法準備pTRV1菌液，室溫下放置3 h后，將pTRV1分別與pTRV2：LYC-B、pTRV2：00和pTRV2：PDS菌液混合注射離體果實。使用1 mL注射器從果頂注射果實，當有菌液從萼片處溢出時，停止注射，用吸水紙擦干溢出的菌液。每個處理重復3 次，每次20 個果實。注射后的果實放置在人工氣候箱中，溫度（20±2）℃，相對濕度70%，光周期為16 h晝長及8 h夜長。

取樣分析：八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoene desaturase，PDS）是VIGS誘導中的報告基因，抑制PDS基因表達會使果實不能正常轉色，果實表面出現綠色區域或黃色區域［12］。在注射果實2 周后，PDS基因陽性對照組果實的沉默面積不再發生變化時，PDS基因沉默效率達到最高［11］，此時其他處理中相應基因的沉默效率也達到最高。參照PDS基因沉默的部位，提取其他處理果實相同部位的RNA，反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，EF1α為內參，進行實時熒光定量PCR分析，檢測沉默部位LYC-B基因的表達量。分別將各處理中LYC-B基因表達量低的部位用勻漿機打成勻漿，液氮冷凍后保存在-80 ℃，用于后續實驗的測定。

1.3.3指標測定

參照劉沐霖等［16］采用高效液相色譜法，測定VIGS誘導果實番茄紅素及β-胡蘿卜素的含量。

參照Viljanen［17］、常培培［10］等采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術，測定VIGS誘導果實揮發性物質。

樣品制備：稱取VIGS處理后果肉勻漿約14 g，加入3 g氯化鈉，于40 mL頂空瓶中。將頂空瓶置于50 ℃恒溫磁力攪拌器上，平衡10 min，頂空吸附40 min，進樣口處解吸3 min，進行GC-MS分析。每個處理重復3 次取平均值。

色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX 彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 .m），進樣口250 ℃；升溫程序為40 ℃保持2.5 min，10 ℃/min升至110 ℃，然后以3.0 ℃/min升溫至180 ℃，15.0 ℃/min 升溫至230 ℃維持3 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊（electron ionization，EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；SM離子掃描，質量掃描范圍為m/z 35～500。

1.4數據分析

用Excel 2013軟件進行數據處理；用Origin 8.0軟件進行作圖；用SPSS 20.0統計分析軟件進行Tukey's顯著性檢驗。

2　結果與分析

2.1VIGS病毒載體pTRV2：LYC-B的構建

采取黑櫻桃番茄幼苗新葉，使用TRIZOL試劑提取總RNA，反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用引物LYC-B F和LYC-B R進行PCR擴增，得到預期的392 bp的特異序列（圖1A）。該片段與pMD-18T載體連接，測序驗證后，與TRV2病毒載體連接，轉化農桿菌，進行菌液PCR和雙酶切驗證。

由圖1B、1C可知，菌液PCR擴增和雙酶切均得到392 bp的片段，與克隆的LYC-B片段大小相符，表明成功構建了VIGS病毒pTRV2：LYC-B載體，并獲得了含有pTRV2：LYC-B質粒的陽性單克隆農桿菌。

圖1　重組質粒pTRVV22：LLYYCC--BB的克隆及鑒定Fig.1　Cloneing and identification of pTRV2：LYC-B recombinant cloning vector

2.2VIGS誘導番茄果實LYC-B基因沉默

綠熟期離體番茄果實注射菌液2 周后，陽性對照組的果實出現PDS基因沉默癥狀，果實表面出現黃綠色區域（圖2D），說明此時的VIGS誘導效果最大［12］。通過觀察果實顏色變化情況發現，LYC-B基因沉默處理，陰性對照以及空白對照的果實外觀沒有明顯區別，都轉色均勻（圖2B、2C、2E）。

圖2　VIGS誘導番茄果實顏色變化Fig.2　Color change of tomato fruits induced by VIGS

圖3　VIGS果實中LYC-BLYC-B基因表達分析Fig.3　Transcript levels of LYC-B gene in gene-silenced tomato fruits

實時熒光定量PCR檢測LYC-B基因的表達量。如圖3所示，LYC-B基因沉默處理果實中，LYC-B的轉錄水平比陰性對照組降低了約75%。結果表明，雖然用肉眼觀察不到果實顏色明顯的變化，但是VIGS誘導極顯著降低了果實內源LYC-B基因的表達量，陰性對照組與空白對照組的表達量無顯著差異。

2.3LYC-B基因沉默對番茄果實番茄紅素和β-胡蘿卜素含量的影響

利用高效液相色譜法檢測沉默果實和對照處理中番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量。由圖4可知，各處理組之間番茄紅素含量差異顯著，LYC-B基因沉默的果實中番茄紅素含量最高，為12.27 mg/100 g，顯著高于兩個對照組（陰性對照組和空白對照組），與陰性對照組相比增加了14.03%，與空白對照組相比增加了29.15%。LYC-B基因沉默的果實中β-胡蘿卜素含量顯著高于陰性對照組和空白對照組，陰性對照組和空白對照組二者之間差異不顯著。說明LYC-B基因沉默提高了果實中番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量。

圖 44 　LLYYCC--BB基因沉默對番茄果實番茄紅素（AA）　和β--胡蘿卜素含量（BB）的影響Fig.4　Contents of lycopene （A） and β-carotene （B） in LYC-B gene silenced tomato fruits

2.4LYC-B基因沉默對番茄果實揮發性物質的影響

利用HS-SPME-GC-MS方法檢測沉默果實中揮發性物質的變化情況。檢測結果經Xcalibur軟件處理，與圖譜庫（NIST2011）的標準質譜圖對照，并結合有關文獻的標準圖譜進行匹配［18-20］，共檢測到了52 種正反匹配度大于800的化合物。運用峰面積歸一法，求得各物質的相對含量，并按照化合物官能團對物質進行分類［21］，結果見表1。

表1　LYC-B基因沉默番茄果實揮發性物質的相對含量Table 1 Relative contents of volatile compounds in LYC-B genesilenced tomato fruits

續表1

2.4.1LYC-B基因沉默對番茄果實揮發性物質種類的影響

由表1可知，所有處理中共檢測到52 種揮發性物質，包括醇類10 種、醛類18 種、酮類6 種、烴類5 種、酯類3 種和其他類10 種。

在LYC-B基因沉默的處理組中，檢測到37 種物質，與陰性對照組相比，醇類、酮類、烴類和其他類的個數均增加了1 種，醛類增加了2 種，酯類減少了1 種。檢測到了苯乙醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、萘和反-檸檬醛等陰性對照組中沒有檢測到的物質，沒有檢出2-己烯醛和庚醛等陰性對照組中存在的物質。結果表明，LYC-B基因沉默增加了揮發性物質的種類，改變了揮發性物質的組成。

陰性對照組中酮類和酯類的個數均比空白對照組多2 種，醛類數量比空白對照減少4 種，二者間醇類、烴類和其他類數量差別不大，揮發性物質總數一致。

2.4.2LYC-B基因沉默對番茄果實揮發性物質相對含量的影響

圖5　5　LYC-BLYC-B基因沉默番茄果實各類揮發性物質的相對含量Fig.5　Relative contents of volatile compounds in LYC-B gene-silenced tomato fruits

由圖5可知，LYC-B基因沉默處理組與陰性對照組相比，酮類相對含量（15.34%）增加了37.7%（陰性對照組為11.14%），其他類相對含量（4.76%）增加了27.6%（陰性對照組為3.73%），而醇類、醛類、烴類和酯類相對含量均沒有顯著變化。結果表明，LYC-B基因沉默顯著增加了酮類物質和其他類物質的相對含量，對剩余物質含量影響不大。

陰性對照組中醇類、酯類和其他類物質的相對含量高于空白對照組，醛類相對含量低于空白對照組，酮類和烴類的相對含量與空白對照組間差異不顯著（圖5）。由此可見，注射空載體的菌液對揮發性物質的含量造成了影響，推測可能是由于注射過程對果實造成了傷害或病毒空載體本身的作用，從而導致了揮發性物質的變化。

此外，根據番茄風味特征性物質以及對番茄風味品質貢獻較大的物質［3，17，20］，對LYC-B基因沉默后番茄主要揮發性物質變化情況進行了分析（表1，圖6）。在LYC-B基因沉默后，某些主要揮發性物質含量發生了明顯變化，如反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水楊酸甲酯、反-2-辛烯醛、己醇和順-3-己烯醇等的含量顯著增加，其中，與陰性對照相比，反-2-庚烯醛的含量增加了2.48 倍，增幅最大；水楊酸甲酯增加了43.51%；6-甲基-5-庚烯-2-酮含量提高了41.40%；反-2-辛烯醛增加了14.16%；己醇和順-3-己烯醇分別增加了約7%。結果表明LYC-B基因沉默顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）增加了部分主要揮發性物質的含量，促進了揮發性物質的釋放。

圖6　6　LYC-BLYC-B基因沉默番茄果實主要揮發性物質的相對含量Fig.6　Relative contents of the major volatile compounds in LYC-B gene-silenced tomato fruits

3　討 論

LYC-B基因表達的下調可阻礙番茄紅素向具環類胡蘿卜素的轉化，使番茄紅素的分解受阻，從而提高番茄果實中番茄紅素的含量，改善番茄果實的品質［22］。在本研究中，利用VIGS技術誘導紫色番茄果實中LYC-B基因沉默后，LYC-B基因的表達量降低了75%（圖3），且LYC-B基因沉默后，果實中番茄紅素的含量為12.27 mg/100 g，顯著高于陰性對照組和空白對照組（圖4），這與前人研究結果類似［8，23］。另外，沉默LYC-B基因后β-胡蘿卜素的含量也高于兩個對照組（圖4），這與前人［24］采用農桿菌進行遺傳轉化LYC-B反義基因使得轉基因番茄果實中β-胡蘿卜素含量降低的結果有所不同。推測可能是由于本實驗是在果實綠熟期沉默LYC-B基因，果實早期發育過程中形成的殘余的LYC-B基因可以低水平的編碼番茄紅素β-環化酶，使部分番茄紅素轉化為β-胡蘿卜素，可能導致β-胡蘿卜素的含量高于對照。陰性對照組與空白對照組相比番茄紅素含量增加，β-胡蘿卜素含量差異不顯著。這可能是因為類胡蘿卜素代謝是植物體內一個主要而復雜的次生代謝系統，不僅僅與植物的營養和風味相關，可能與植物的應激反應也有關系，病毒載體的進入以及注射很可能啟動了應激反應系統，引起色素含量發生變化，具體原因還需要進一步研究。

在番茄中，已經鑒定出超過400 種揮發性物質，其中僅有16 種揮發性物質對番茄風味具有重要意義［2］。本研究在紫色番茄中檢測出了順-3-己烯醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水楊酸甲酯、1-戊烯-3-酮、反-2-庚烯醛、反-2-己烯醛、己醛、2-苯基乙醇、苯乙醛、2-異丁基噻唑等10 種物質，其他如順-3-己烯醛、β-紫羅蘭酮、β-大馬酮等物質沒有檢測到（表1），常培培等［10］在紫色品種中檢測到的香葉基丙酮、棕櫚酸乙酯在本研究中也沒有檢測出，這可能是由于栽培條件以及離體研究對揮發性物質的種類產生了影響［25-26］。

番茄果實揮發性物質中包含一些特殊氣味物質，能增加果實的清香氣味，提高果實的風味品質［27］，如本研究中檢測到LYC-B基因沉默后含量增加的物質：6-甲基-5-庚烯-2-酮、反-2-辛烯醛、己醇、反-2-庚烯醛、水楊酸甲酯、順-3-己烯醇等，LYC-B基因沉默后出現的特有物質6-甲基-5-庚烯-2-醇和反-檸檬醛。6-甲基-5-庚烯-2-酮和6-甲基-5-庚烯-2-醇的前體物質是番茄紅素，當番茄紅素的含量升高時，二者的釋放量也相應的增加［5］；反-檸檬醛是類胡蘿卜素裂解的產物，是合成紫羅蘭酮及大馬酮等物質的原料，呈檸檬香味［28］；反-2-辛烯醛能提高果實的青葉香氣，己醇能釋放果香味。關于番茄果實揮發性物質與品質性狀相關性分析的研究表明［29］，反-2-辛烯醛與番茄紅素的相關性達到了0.931，反-2-辛烯醛與己醇成顯著正相關；反-2-庚烯醛與番茄甜味物質有關，呈現脂肪氣味、青草香；水楊酸甲酯，又稱冬青油，有獨特的氣味；順-3-己烯醇具有類似異戊醇的香味，呈現新鮮的青葉香氣［30］。本研究利用VIGS技術將LYC-B基因沉默后，番茄果實中的這些特殊氣味物質的含量普遍增加（表1，圖6），影響了番茄果實的風味品質。

4　結 論

利用病毒誘導的基因沉默技術成功抑制了LYC-B基因的表達量，LYC-B基因沉默一方面可通過抑制番茄紅素的環化來增加紫色番茄果實中番茄紅素的含量，提高番茄果實的營養品質；另一方面可通過增加以類胡蘿卜素為前體的揮發性物質6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇和反-檸檬醛的釋放為番茄果實提供獨特的香氣成分，通過增加反-2-辛烯醛、己醇等番茄紅素相關物質以及反-2-庚烯醛、水楊酸甲酯、順-3-己烯醇等番茄主要揮發性物質的含量影響番茄果實的風味品質。但LYC-B基因如何對這些揮發性物質進行調控，以及這些揮發性物質如何相互作用于風味品質目前尚不得而知，需要進一步地探討和驗證。總之，LYC-B基因既影響番茄果實的類胡蘿卜素代謝，又影響揮發性物質的形成，類胡蘿卜素代謝與揮發性物質形成密切相關。

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Effect of LYC-B Gene Silencing on Major Pigments and Volatile Compounds in Purple Tomato Fruits

L. Jie， LIANG Yan*， ZHAO Jingjing， ZHANG Yan， CHANG Peipei， QIN Lei， LI Yunzhou
（College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling712100， China）

In the current study， the expression of lycopene beta-cyclase （LYC-B） gene was inhibited during ripening through virus-induced silencing （VIGS） technique and the corresponding impact on major pigments and volatile compounds in purple tomato fruits was analyzed. The results showed that LYC-B gene silencing could increase the content of lycopene in purple tomato fruits. Tomato volatile compounds detected by headspace solid phase micro-extraction （HS-SPME） coupled with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） revealed that LYC-B gene silencing could increase the content of 6-methyl-5-hepten-2-one， which is derived from carotenoids. The release of （E）-2-octenal， hexanol， （E）-2-heptenal， methyl salicylate and （Z）-3-hexen-1-ol was also increased. In addition， LYC-B gene silencing could increase the contents of lycopene and some major volatile compounds， thus improving the nutritional and flavor quality of tomato fruits.

tomato； LYC-B gene silencing； lycopene； volatile compounds

S641.2

A

1002-6630（2015）23-0221-07

10.7506/spkx1002-6630-201523041

2015-01-31

陜西省科技統籌創新計劃項目（2011KTCL02-03）；西北農林科技大學農業科技推廣基金項目（TGZX2012-02）

呂潔（1990—），女，碩士研究生，研究方向為番茄果實品質性狀。E-mail：lvjielj@163.com

梁燕（1963—），女，教授，博士，研究方向為番茄遺傳育種與蔬菜種質資源。E-mail：liangyan@nwsuaf.edu.cn