抗瓜類細菌性果斑病菌單克隆抗體的制備及特性鑒定

曾海娟，王廣彬，郭慧琴，邱　實，李建武，翟緒昭，丁承超，宋春美，劉　箐，*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上?！?00093；2.徐州綠健乳品飲料有限公司，江蘇 徐州　221006；3.上?；墼派锟萍加邢薰?，上?！?00433）

抗瓜類細菌性果斑病菌單克隆抗體的制備及特性鑒定

曾海娟1，王廣彬2，郭慧琴3，邱實1，李建武1，翟緒昭1，丁承超1，宋春美1，劉箐1，*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093；2.徐州綠健乳品飲料有限公司，江蘇 徐州221006；3.上?；墼派锟萍加邢薰?，上海200433）

以瓜類細菌性果斑病菌燕麥嗜酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac）野生型菌株SD01免疫BALB/c小鼠，間接酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法篩選獲得4 株穩定分泌抗SD01菌株的單克隆雜交瘤細胞株6F、6D、7E、4F，腹水抗體效價分別為1∶102 400、1∶102 400、1∶25 600、1∶51 200。采用飽和硫酸銨沉淀及Protein-G親和層析法純化腹水，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）顯示純化后的單克隆抗體（mAb）純度較高，純化后單克隆抗體（2 mg/mL）效價分別為1∶12 800、1∶6 400、1∶3 200、1∶6 400，亞型鑒定結果表明4 種單克隆抗體均為IgG2 a。間接ELISA結果表明，4 種單克隆抗體對8 種果斑病菌結合能力不同：6F可以結合6 種，6D、4F可以結合8 種，7E可以結合5 種。與3 種非Aac近源種植物病原菌交叉反應情況為：6F、4F與2 種非Aac近源種植物病原菌存在交叉反應，6D、7E與3 種非Aac近源種植物病原菌均無交叉反應。

細菌性果斑病菌；單克隆抗體；制備；特性鑒定

瓜類細菌性果斑?。╞acterial fruit blotch，BFB）是一種嚴重的細菌性病害，可引起西瓜、甜瓜等多種葫蘆科植物患病。其病原體為燕麥嗜酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac），又稱果斑病菌、西瓜斑菌，是一種具有極高破壞性的革蘭氏陰性種傳病菌。它可侵染果實、植株及種子，該病菌抗干旱能力非常強［1］，可在種子表面存活4～5 個月［2］。帶菌果實表面初期會出現水漬狀斑點，最終導致整個果實腐爛，所引起的病害具有發病快、傳播性強等特點，感染此病害會導致瓜類大量減產［3］。

果斑病菌快速檢測方法主要有基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的檢測方法和免疫學方法?；赑CR的檢測方法主要有巢式PCR（nested-PCR）［4］、免疫PCR［5-7］、實時熒光定量PCR［8-9］、等溫DNA擴增技術［10-11］等，該類方法具有靈敏度高等優點，但需要精密的熱循環儀器，對技術人員和設備也有一定的要求。免疫學方法是以抗體特異性識別并結合相應的抗原為基礎的快速檢測技術，與傳統檢測方法及上述檢測方法相比，具有特異性強、快速、操作簡便等優點，目前已廣泛用于植物病原菌的檢測，已報道的可用于果斑病菌檢測的免疫學方法主要有酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）［12］、免疫磁珠技術［13］、免疫試紙條技術［14-15］、蛋白宏陣列［16］等。但免疫學技術的建立依賴于特異性的單克隆抗體，單克隆抗體專一性是免疫學檢測方法的重要因素，但基于細菌血清型復雜、近源種較多等原因，特異性抗體的獲取極為困難，因此特異性單克隆抗體是病原細菌免疫學檢測的重要瓶頸，本實驗擬制備抗果斑病菌的單克隆抗體，并對抗體的特性（效價、純度、特異性）進行鑒定，旨在為建立特異、快速、簡便的果斑病菌免疫學檢測新技術奠定基礎，關于該細菌單克隆抗體目前尚未見國內外報道。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1菌株與培養基

Aac標準菌株ATCC 29625，Aac野生菌株SD01、99-5、xj112、PLSB1、00-1、plsb91、tw31由中國檢驗檢疫科學研究院從國內外瓜類產品中截獲后分離所得，已進行了分離鑒定、柯赫氏法則等的驗證；燕麥嗜酸菌卡特萊蘭亞種NCPPB 961、嗜酸菌魔芋亞種ATCC 33996、玉米細菌性條斑菌ATCC 19307，由中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫所提供。

金氏B培養基、腦心浸液培養基購自北京陸橋技術有限公司。

1.1.2細胞與動物

骨髓瘤細胞SP2/0為上海理工大學有害微生物危害與控制研究所保存。

6～8 周齡SPF級BALB/c雌性小鼠（體質量約20 g），購自第二軍醫大學動物中心。

1.1.3試劑

液體石蠟、8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，8-AG）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、50×HAT（次黃嘌呤（hypoxanthine）、氨喋呤（aminopterin）、胸腺嘧啶核苷（thymidine））、50×HT（次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷）、辣根過氧化物酶（horse reddish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠IgG抗體美國Sigma公司；Taq DNA聚合酶及其他PCR試劑生工生物工程（上海）股份有限公司；本實驗所用引物根據Walcott等［17］報道，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其核苷酸序列為：WFB1：GACCAGCCACACTGGGAC，WFB2：CTGCCGTACTCCAGCGAT；Biosun胎牛血清上海博升生物科技有限公司；DMEM高糖培養基美國Invitrogen公司；單克隆抗體亞型鑒定二抗洛陽佰奧通實驗材料中心；Protein G親和層析柱美國GE Healthcare公司；25 mL細胞培養瓶、96 孔細胞培養板、24 孔細胞培養板無錫耐思生物科技有限公司；其余常規試劑均為分析純國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4儀器與設備

PCR熱循環儀美國Applied Biosystems公司；凝膠成像儀英國Syngene公司；Mini-power電泳儀、蛋白提純儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀美國伯樂公司；SpectraMax M2多功能酶標儀美國分子儀器公司；CO2恒溫培養箱美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定及細菌培養基選擇

8 種果斑病菌菌株先在腦心浸液液體培養基中進行增菌培養，后在其固體培養基劃線，挑單菌落于腦心浸液培養基中培養后進行PCR鑒定，并測定其在600 nm波長處的光密度（OD）值，選取生長較快的一株菌株作為免疫菌株。挑取該菌株的單菌落分別于腦心浸液液體培養基及金氏B液體培養基中37 ℃培養18 h后，采用梯度稀釋涂平板計數，比較該菌株在2 種培養基中生長快慢程度。

1.2.2Aac免疫小鼠方法

選擇效果好的培養基進行SD01單菌落接菌，滅菌生理鹽水離心重懸3 次，并調整菌濃度為108CFU/mL，免疫方案如表1所示。第4次免疫后第7天斷尾采血，分離血清，采用間接ELISA法測定抗體效價。間接ELISA條件如下：甲醛滅活的全菌抗原的包被濃度為108CFU/mL，37 ℃包被2 h，質量分數3%的脫脂奶粉封閉1.5 h，血清100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST（phosphate buffered saline（磷酸鹽緩沖液）+ Tween-20）洗滌3 次，HRP標記的羊抗鼠IgG 100 μL/孔，37 ℃反應1 h后PBST洗滌3 次，四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色液顯色15 min，2 mol/L濃H2SO4終止反應，450 nm波長處測定OD值。以實驗組OD450nm/陰性對照組OD450nm（P/N）≥2.1判定為陽性，以血清最大稀釋倍數的陽性孔作為該小鼠血清效價。取血清效價最高小鼠的脾細胞用于細胞融合，融合前72 h進行小鼠腹腔沖擊免疫，抗原劑量為0.6 mL/只。

表1　小鼠免疫程序Table 1 Immunization schedule

1.2.3細胞融合及篩選

摘眼球取血后，脊椎脫臼處死小鼠取脾臟，用注射器研磨獲得脾細胞懸液，與SP2/0細胞分別用無血清培養基離心重懸3 次，并經血球計數板計數，按數量比5∶1混合后離心去上清液，以體積分數50%的PEG進行融合，含體積分數10%胎牛血清的DMEM高糖培養基終止融合，按105個/孔鋪于已鋪飼養層細胞的96 孔板中。雜交瘤細胞采用HAT培養基篩選，待細胞鋪滿孔底70%～80%時，取上清液，采用間接ELISA法測定抗體效價，以未處理的小鼠血清作為陰性對照。陽性孔細胞以有限稀釋法進行克隆化，亞克隆過程改用HT培養基培養，間接ELISA法篩選，每次克隆篩選到的陽性孔擴大培養后凍存于液氮中。

1.2.4腹水制備及抗體效價測定

采用體內誘生法制備腹水［18］。將液體石蠟按0.5 mL/只腹腔注射致敏小鼠，7 d后雜交瘤細胞按106個/只腹腔注射已致敏小鼠，待小鼠腹腔膨大、精神不佳后無菌收集腹水，離心取上清液，倍比稀釋，間接ELISA法測定腹水抗體效價，以腹水抗體最大稀釋倍數的陽性孔作為該抗體效價。

1.2.5抗體純化及純度測定

單克隆抗體腹水經飽和硫酸銨沉淀初步純化后，再經Protein-G柱親和層析純化。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）測定純化后抗體的純度，參照文獻［19］原理進行，樣品于100 ℃條件下干浴5 min，加樣量為20 μg，考馬斯亮藍R250染色，以脫色液進行脫色。

1.2.6純化后抗體效價及亞型鑒定

亞型鑒定采用間接ELISA法，按照小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒（IgG1、IgG2 a、IgG2 b、IgG3、IgA、IgM）說明書方法進行，2 mg/mL單克隆抗體均稀釋1 000 倍，亞型鑒定羊抗鼠IgG抗體稀釋1 000 倍。效價測定采用間接ELISA法，P/N≥2.1的抗體最大稀釋倍數為該單克隆抗體的效價。

1.2.7抗體特異性分析

間接ELISA法測定抗體對8 種果斑病菌及3 種非Aac植物病原菌結合情況，以108CFU/mL的上述11 種菌包被酶標板，2 mg/mL單克隆抗體均稀釋1 000 倍，測定在450 nm波長處的OD值。

2　結果與分析

2.1PCR鑒定結果

圖1　8 種果斑病菌的PCR鑒定結果Fig.1　PCR identification of Aac

由圖1可知，8 種果斑病菌在360 bp處均出現亮條帶，表明這8 種細菌均為Aac。另外，條帶的亮度可能與基因表達量有關［20］。

2.28 種菌生長快慢程度及培養基選擇結果

圖2　8 種果斑病菌生長快慢比較Fig.2　Comparison of the growth speeds of bacterial fruit blotch

圖3　菌株SD01在兩種培養基中的生長效果Fig.3　Comparison of the growth of strain SD01 in two media

分別挑取8 種果斑病菌的單菌落于腦心浸液液體培養基中，培養相同時間后測定其在600 nm波長處的OD值。由圖2可知，8 種Aac菌株在腦心浸液液體培養基中37 ℃培養18 h后，菌株SD01的OD600nm值最高，表明其生長速率最快，因此選擇此菌株作為免疫菌株。挑取菌株SD01的單菌落于腦心浸液液體培養基和金氏B液體培養基中培養相同時間，分別將菌液依次10 倍稀釋至稀釋度為10-6，涂平板計數，由圖3可知，菌株SD01在兩種培養基中生長速率差異較大，在腦心浸液培養基中生長較快，計數后得出其在兩種培養基中的菌體濃度分別為1.3×109、4.1×108CFU/mL。

2.3小鼠血清效價

將3 只小鼠血清分別稀釋1 000、5 000、10 000、50 000 倍，血清效價測定結果如表2所示。1、2、3號小鼠血清效價分別可達到1∶10 000，1∶50 000，1∶5 000。2號小鼠血清稀釋50 000 倍時，P/N為3.7，效價最高，因此選擇2號小鼠加強免疫后進行細胞融合。

表2　小鼠血清效價比較（P//NN）Table 2　Comparison of serum titers of mice （P/N）

2.4單克隆抗體篩選

在兩種細胞融合實驗中，共鋪8 塊96 孔細胞培養板，其中701 個孔有雜交瘤細胞生長，雜交瘤融合率為91.3%，經間接ELISA法篩選，得到4 孔具有特異性抗菌株SD01的雜交瘤細胞。在克隆化過程中有3 株雜交瘤細胞經3 次亞克隆后陽性克隆率為100%，命名為6F、6D、7E；有1 株雜交瘤細胞經4 次亞克隆后陽性克隆率達100%，命名為4F。4 株雜交瘤細胞經多次傳代、反復凍存及復蘇后，抗體分泌能力穩定。

2.5腹水制備及純化后抗體效價及亞型測定結果

間接ELISA測定4 株雜交瘤細胞株6F、6D、7E、4F的腹水抗體效價，陰性對照為未免疫的小鼠血清，對照值（N）為0.11。如圖4a所示，雜交瘤細胞株6F、6D、7E、4F的腹水抗體效價分別為1∶102 400、1∶102 400、1∶25 600、1∶51 200。純化后的抗體（2 mg/mL）效價如圖4b所示，陰性對照為小鼠血清，對照值（N）為0.15，純化后抗體效價分別為1∶12 800、1∶6 400、1∶3 200、1∶6 400，抗體亞型均為IgG2 a。

圖4　腹水抗體及純化后抗體的效價Fig.4　Titers of ascites and purified antibodies

2.6純化單克隆抗體的SDS-PAGE分析

圖5　純化單克隆抗體的SDS-PAGGEE圖Fig.5　SDS-PAGE of purified monoclonal antibodies

由圖5可知，經硫酸銨沉淀及Protein-G柱親和層析純化后的4 株單克隆抗體分別都有一條約50 kD的重鏈、一條約25 kD的輕鏈，無多余的雜條帶，表明腹水抗體中雜蛋白已經被除去，純化后的抗體純度較高。

2.7抗體的特異性

間接ELISA檢測4 種單克隆抗體對8 種果斑病菌結合情況：6F可以結合6 種果斑病菌，與00-1、tw31不結合，6D可以與8 種果斑病菌結合，7E可以結合5 種果斑病菌，與00-1、tw31、ATCC 29625不結合，4F可以結合8 種果斑病菌。與3 種非Aac近源植物病原菌交叉反應情況：6F與NCPPB 961、ATCC 33996有交叉反應，6D、7E與這3 種非Aac近源植物病原菌均無交叉反應，4F與ATCC 33996、ATCC 19307存在交叉反應，具體結果見表3。

表3　4 種單克隆抗體的特異性分析Table 3　Specificity of monoclonal antibodies

3　討 論

本實驗在選擇免疫菌株時，采用檢測OD600nm值進行菌株生長快慢的比較，而在選擇培養基時，采用涂布平板計數法進行菌株生長快慢的比較，這是由于金氏B液體培養基本身就是混濁的，不能通過比較混濁度（OD600nm）來判定細菌濃度的大小。選取了兩種液體培養基：腦心浸液培養基、金氏B培養基，前者營養成分較好，適用于營養苛求菌的培養；而金氏B培養基是果斑病菌國標上選用的培養基，因此本實驗比較了菌株SD01在這兩種培養基上生長的快慢。比較菌株生長快慢的目的是細菌只有在最適培養條件下，才會完全、充分地表達抗原，同時可縮短間接ELISA實驗時間，較快地得到檢測結果，進而可以較早處理陽性克隆孔。免疫小鼠時采用甲醛滅活的野生菌株SD01，免疫過程中未使用佐劑，由于全菌抗原比較完整，使免疫后獲得了較高的血清效價。

SP2/0細胞融合前先經小鼠腹腔復壯，再采用8-AG培養基培養3 代以上?？寺』^程中，第1次亞克隆按2～3 個細胞/孔鋪板，第2次、第3次亞克隆均按1 個細胞/孔鋪板，鋪板3～4 d后觀察并記錄每孔實際細胞生長的克隆數，發現96 孔板最外圍孔內的細胞狀態較差，可能是由于從培養箱取出96 孔板進行計數的過程中，外圍孔溫度波動較大，也表明了在雜交瘤細胞生長過程中保持穩定的培養溫度及CO2濃度等的重要性。在獲得單克隆雜交瘤細胞株后，可以采用體外培養法和體內誘生法生產單克隆抗體，本實驗采用體內誘生法生產腹水，因為運用此法獲得的腹水中抗體濃度較高，生產成本低。

據報道，采用硫酸銨沉淀純化腹水時［21］純度為25%，回收率為63%，純度較低，只能作為初步純化手段，本實驗純化腹水采用飽和硫酸銨沉淀后又經Protein-G柱親和層析純化，SDS-PAGE顯示純化后單克隆抗體純度較高。實驗中的8 種果斑病菌菌株均來源于中國檢驗檢疫科學研究院，是從國內外瓜類產品中截獲分離后得到的，也是目前國內僅有的果斑菌菌株，基本可以代表已報道的菌株類型和血清型，更多的果斑菌菌株目前還難以獲取。目前，非Aac近源菌感染西瓜等瓜類種子或植株的情況尚未見報道，因此本實驗在抗體特異性鑒定時考察了8 種果斑病菌和3 種非Aac近源菌的結合情況。

本研究所獲得的4 株單克隆抗體，為開發檢測果斑病菌試劑盒提供了前提條件，也可進一步用于建立果斑病菌的免疫學快速檢測技術，如ELISA檢測方法、免疫層析試紙技術、等離子體共振技術等，并可與其他植物病原菌抗體配合，建立植物病菌的多通道檢測方法，如蛋白芯片等。對多種檢測方法進行評估，并根據檢測需要選擇適合的檢測方法，以達到高靈敏度、操作簡便、高通量的檢測目的。

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Preparation and Characterization of Monoclonal Antibody against Acidovorax avenae subsp. citrulli in Melons

ZENG Haijuan1， WANG Guangbin2， GUO Huiqin3， QIU Shi1， LI Jianwu1， ZHAI Xuzhao1， DING Chengchao1， SONG Chunmei1， LIU Qing1，*
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai200093， China；2. Xuzhou Lüjian-Dairy Beverage Co. Ltd.， Xuzhou221006， China；3. Shanghai Prajna Biology Technique Ltd.， Shanghai200433， China）

Four hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies （mAbs） against SD01， namely 6F， 6D， 7E and 4F，were generated by immunizing BALB/c mice using wild-type strain SD01 of Acidovorax avenae subsp. citrulli （Aac） as the immunogen. Ascites antibody titers were 1：102 400， 1：102 400， 1：25 600， and 1：51 200，respectively. Ascites were purifi ed using saturated ammonium sulfate precipitation and Protein-G affi nity chromatography. Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis （SDS-PAGE） analysis showed high antibody purity. The titers of purified mAbs（2 mg/mL） were 1：12 800， 1：6 400， 1：3 200， and 1：6 400， respectively. The subclass of mAbs was IgG2 a. Indirect enzymelinked immunosorbent assay （ELISA） showed that four hybridoma cell lines had different binding capacity to eight strains of Aac and three species of non-Aac plant pathogens. 6F could bind six strains of Aac， 6D and 4F could bind eight strains of Aac， 7E could bind five strains of Aac. 6F and 4F had cross-reaction with two of the three species of non-Aac plant pathogens， and 6D and 7E had no cross-reaction with all the three species of non-Aac plant pathogens.

bacterial fruit blotch； monoclonal antibody； preparation； characterization

TS207.4

A

1002-6630（2015）23-0228-05

10.7506/spkx1002-6630-201523042

2015-01-29

上海市科委高校能力建設項目（13430502400）；“科技創新行動計劃”長三角科技聯合攻關領域項目（15395810900）；上海市研究生教育創新計劃項目

曾海娟（1990—），女，博士研究生，研究方向為食品安全快速檢測技術。E-mail：zenghaijuan12@126.com

劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機理及快速檢測技術。E-mail：liuq@usst.edu.cn