海灣扇貝多肽混合物對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響

劉　媛，王　健，牟建樓，孫劍鋒，王　頡，*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定　071000；2.河北北方學院農林科技學院，河北 張家口　075000）

海灣扇貝多肽混合物對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響

劉媛1，2，王健2，牟建樓1，孫劍鋒1，王頡1，*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定071000；2.河北北方學院農林科技學院，河北 張家口075000）

采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法檢測海灣扇貝多肽混合物對體外培養的人肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用，利用倒置顯微鏡及流式細胞儀觀察、分析其對HepG2細胞的形態和細胞凋亡的影響。結果表明：不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL）能夠抑制人肝癌HepG2細胞的生長，且抑制率隨海灣扇貝多肽混合物質量濃度的增加而升高。經12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理后，HepG2細胞的形態發生了明顯改變，表現為細胞皺縮、透明度降低、細胞核固縮等，并出現了凋亡小體。海灣扇貝多肽混合物可誘導HepG2細胞凋亡。

海灣扇貝多肽；HepG2細胞；細胞凋亡

惡性腫瘤又稱為癌癥，它是目前嚴重威脅人類生命和影響人類健康的主要疾病之一。海洋生物來源的抗腫瘤活性物質具有毒副作用小、藥效高的特點，現已成為天然抗癌藥物極好的潛在資源。扇貝是海洋生物的一種，因其營養價值高，且含有多種生理活性成分，在海洋抗癌藥物研究［1-6］中具有很好的應用和開發前景。本研究團隊已通過酶解技術、反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）和串聯飛行時間質譜等方法從海灣扇貝中獲得了包含5 個組分的海灣扇貝多肽混合物［7-8］。為了探討所得海灣扇貝多肽混合物的抗腫瘤活性及其抑瘤機制，本實驗對其體外抗腫瘤活性及機制進行初步研究和探討，為將海灣扇貝多肽混合物進一步開發為天然抗腫瘤活性成分奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

人肝癌HepG2細胞由河北北方學院生命科學研究中心惠贈。

RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）美國Gibco公司；胎牛血清天津市川頁生化制品有限公司；細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）上海同仁化學公司；慶大霉素鄭州羚銳制藥有限公司；AnnexinⅤ-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒美國BD公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

FACS-AriaⅡ型流式細胞儀美國BD公司；Ti-U熒光倒置顯微鏡日本Nikon公司；SpectraMax M2e多功能微孔板檢測系統美國Molecular Devices公司；HEPA class 100 CO2培養箱美國Thermo Electron公司；1300 SERIES A2生物安全柜美國Thermo Fisher公司；TDL-50B低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠；D-1型自動蒸汽滅菌鍋北京發恩科貿有限公司。

1.3方法

1.3.1人肝癌HepG2細胞培養

在RPMI-1640培養基中加入10%胎牛血清和終效價為100 IU/mL的慶大霉素，調整pH值至7.4，將人肝癌HepG2細胞復蘇后，加入上述RPMI-1640培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中擴增培養，每24 h換液1 次，直至細胞生長至對數生長期。取對數生長期細胞用不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物處理。

1.3.2海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞生長的影響

采用CCK-8法［9-10］檢測海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞生長的影響：取對數生長期的人肝癌HepG2細胞，經0.25%的胰蛋白酶消化后，配成5×104個/mL的單細胞懸液，接種于96 孔板中，100 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，棄培養液。設對照組和實驗組，實驗組分別加入不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL，用RPMI-1640培養基稀釋），對照組加入等體積RPMI-1640培養基。繼續培養，于24 h后檢測海灣扇貝多肽混合物對細胞增殖的抑制率。檢測前4 h加入CCK-8試劑（20 μL/孔）， 繼續培養4 h后用多功能微孔板檢測系統測定吸光度（A490nm），按照下式計算細胞增殖抑制率。每組每個時間點設4 個重復孔。

1.3.3海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞形態的影響

取經傳代培養、生長狀態良好的腫瘤細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后配成5×104個/mL單細胞懸液，分別接種于6 個50 mL的培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后，實驗組分別加入不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL，用RPMI-1640培養基稀釋），對照組加入等體積RPMI-1640培養基，繼續培養24 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照［11］。

1.3.4海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞凋亡的影響

采用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染細胞凋亡試劑盒檢測人肝癌HepG2細胞的凋亡。取對數生長期的人肝癌HepG2細胞，經0.25%的胰蛋白酶消化后，配成1×106個/mL單細胞懸液，分別接種于6 個 50 mL的培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后，實驗組分別加入不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL，用RPMI-1640培養基稀釋），對照組加入等體積RPMI-1640培養基，繼續培養 24 h 后，1 500 r/min離心7 min，收集細胞，經0.25%的胰蛋白酶消化后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）洗滌2 次，用標記緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，吹打混勻后取100 μL細胞懸液加入5 mL培養管，分別加入5 μL AnnexinⅤ-PE及5 μL 7-AAD-PerCP-Cy5.5，混勻后避光染色20 min，加入400 μL標記緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡狀況［12］。

1.3.5海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞p53、Bcl-2蛋白表達的影響

取對數生長期的人肝癌HepG2和SMMC-7721細胞，經0.25%的胰蛋白酶消化后，配成1×106個/mL單細胞懸液，分別接種于6 個50 mL的培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后，實驗組分別加入不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL，用RPMI-1640培養基稀釋），對照組加入等體積RPMI-1640培養基，繼續培養 24 h 后，1 500 r/min離心7 min，收集細胞，用PBS（pH 7.4）洗滌3 次，最后1 次移入1 mL離心管中，分別加入等量預熱的細胞固定液，振蕩器低速振蕩混勻，37 ℃孵育15 min，經0.25%的胰蛋白酶消化后，配成1×106個/mL單細胞懸液，1 500 r/min離心7 min，收集細胞，加入1 mL破膜劑進行細胞破膜。振蕩器低速振蕩混勻細胞，冰上孵育30 min，清洗細胞。用緩沖液重懸細胞，使細胞終濃度為1×106個/mL，每個處理取100 μL細胞懸液，分別加入20 μL PE-p53或PE-Bcl-2孵育20 min，振蕩器低速振蕩混勻細胞，冰上孵育30 min，清洗細胞，加入約500 μL緩沖液重懸細胞，混勻后上流式細胞儀檢測［13］。

1.4統計學處理

采用SAS 9.1軟件進行數據統計學處理和分析。采用t檢驗分析兩組間差異，方差不齊者采用秩和檢驗分析，P＜0.05和P＜0.01表示有統計學意義。

2　結果與分析

2.1海灣扇貝多肽混合物對人肝癌HepG2細胞增殖的影響

海灣扇貝多肽混合物作用于體外培養的人肝癌HepG2細胞24 h后，采用CCK-8法檢測，結果顯示各質量濃度海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞增殖均出現不同程度的抑制作用，結果如圖1所示。

圖1　海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞增殖的抑制作用Fig.1　Inhibitory effect of bay scallop polypeptide mixture on the proliferation of HepG2 cells

由圖1可知，5 個不同質量濃度（4、6、8、10、12 mg/mL）海灣扇貝多肽混合物作用HepG2細胞24 h，對HepG2細胞的生長均具有明顯的抑制效果，并且隨著多肽質量濃度增加，抑制率也隨之增加，且與對照組相比均有極顯著差異（P＜0.01）。

2.2海灣扇貝多肽混合物對人肝癌HepG2細胞形態的影響

用倒置顯微鏡觀察海灣扇貝多肽混合物作用24 h后HepG2細胞的形態，結果如圖2所示。

圖2　海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞形態結構的影響Fig.2　Effect of bay scallop polypeptide mixture on morphology of HepG2 cells cultured in vitro

由圖2可知，對照組（圖2a）HepG2細胞透亮，形態飽滿，呈梭形或多突起形，突起部分較長，細胞生長狀態良好，緊密連接成片，細胞核較大，位于細胞中心。而不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物處理24 h后，實驗組HepG2細胞總數不斷變少，個體瘦小，出現不同程度的突起短縮、逐漸變圓，胞漿減少，且可見大小不等的空泡，細胞膜局部均向外出現一定程度的膨出-出芽現象。隨海灣扇貝多肽混合物質量濃度的提高，上述改變更加明顯，尤其以12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理組變化最為明顯，HepG2細胞的細胞核固縮、碎裂，呈圓形、卵圓形或腎形，被擠向細胞一側，且出芽細胞更加多見，有的呈現典型的玫瑰花環狀。以上結果說明，經不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物處理24 h后，HepG2細胞的生長受到了不同程度的抑制。

2.3海灣扇貝多肽混合物對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響

以海灣扇貝多肽混合物作用HepG2細胞24 h后，用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染細胞凋亡試劑盒經流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果如圖3所示。

圖3　海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞凋亡的影響Fig.3　Effect of bay scallop polypeptide mixture on apoptosis of HepG2 cells

由圖3可知，與對照組（0 mg/mL）相比，各質量濃度海灣扇貝多肽混合物組HepG2細胞的死亡或晚期凋亡率和自發早期凋亡率均顯著升高（P＜0.05），且隨海灣扇貝多肽混合物質量濃度的增加，細胞凋亡率也相應升高，兩者成正相關。當海灣扇貝多肽混合物質量濃度為12 mg/mL時，HepG2細胞死亡或晚期凋亡率達到（17.69±0.04）%。以上結果說明，海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞具有明顯的誘導凋亡作用。

以AnnexinⅤ-PE（標記凋亡細胞）熒光強度為橫坐標、7-AAD-PerCP-Cy5.5（標記死亡細胞）熒光強度為縱坐標，采用流式細胞儀測得的散點圖如圖4所示。

圖4　HepG2細胞的流式散點圖Fig.4　Flow cytometric graphs showing the effect of bay scallop polypeptide mixture on apoptosis of HepG2 cells

由圖4可知，與對照組（圖4a）相比，各質量濃度海灣扇貝多肽混合物組在Q2象限均出現了標記的死亡或晚期凋亡細胞，在Q4象限均出現了標記的早期凋亡細胞。隨著海灣扇貝多肽混合物質量濃度的增加，Q2象限和Q4象限標記的細胞逐漸增多，當海灣扇貝多肽混合物質量濃度為12 mg/mL時，Q2象限和Q4象限標記的細胞最多。以上結果證明，海灣扇貝多肽混合物作用于體外培養的人肝癌HepG2細胞24 h后，對HepG2細胞的早期凋亡和晚期凋亡均有一定的誘導作用，且隨著海灣扇貝多肽混合物質量濃度的增大，其誘導HepG2細胞早期和晚期凋亡的作用也逐漸增強，12 mg/mL時效果最明顯。

2.4海灣扇貝多肽混合物對人肝癌HepG2細胞p53、Bcl-2蛋白表達的影響

海灣扇貝多肽混合物作用于HepG2細胞24 h后，經流式細胞儀檢測p53、Bcl-2蛋白表達情況如圖5所示。

圖5　海灣扇貝多肽混合物對HepG2細胞p53和Bcl-2蛋白表達的影響Fig.5　Effect of bay scallop polypeptide mixture on p53 and Bcl-2 expression of HepG2 cells

由圖5可知，經5 個不同質量濃度（4、6、8、10、12 mg/mL）的海灣扇貝多肽混合物作用于體外培養的人肝癌HepG2細胞24 h后，p53蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達則明顯降低，與對照組（0 mg/mL）相比有顯著差異（P＜0.05），且海灣扇貝多肽混合物的質量濃度越高，蛋白表達的差異越大。12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理組p53和Bcl-2蛋白的陽性表達率分別為（6.40±0.27）%和（3.60±0.12）%，而對照組則分別為（1.80±0.29）% 和（12.60±0.55）%。

3　討 論

以往對活性物質進行體外抑瘤活性檢測的報道中，多采用四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法，與MTT法相比，WST-8（CCK-8試劑中的有效成分）具有操作簡化、結果更加穩定、線性范圍更寬、靈敏度更高的優點。為此，本實驗選用CCK-8法檢測海灣扇貝多肽混合物對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用，結果表明，不同質量濃度（4、6、8、10、12 mg/mL）的海灣扇貝多肽混合物在作用24 h后能極顯著抑制HepG2細胞的增殖，隨著海灣扇貝多肽混合物質量濃度的提高，抑制效果逐漸增強，12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理組的效果最明顯。這提示海灣扇貝多肽混合物能夠抑制HepG2細胞增殖，具有抗腫瘤活性。

在正常生理或病理狀態下，細胞凋亡是機體細胞發生的一種自發性、程序性死亡過程。它與癌癥等許多疾病的發生有關。目前，許多抗腫瘤藥物作用的主要機制之一是誘導腫瘤細胞凋亡［14-17］。細胞凋亡首先表現為形態學改變，凋亡細胞最典型的特征是細胞核形態變化，為此，細胞形態學觀察成為判斷細胞凋亡最基本、最可靠的方法［18］。本實驗以不同質量濃度的海灣扇貝多肽混合物作用于人肝癌HepG2細胞24 h后，用倒置顯微鏡觀察細胞形態，結果顯示，海灣扇貝多肽混合物處理24 h后，人肝癌HepG2細胞均出現了細胞凋亡的形態學改變，其中，12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理組細胞出現了典型的細胞凋亡形態學改變，表明海灣扇貝多肽混合物能夠誘導人肝癌HepG2細胞發生凋亡，且呈劑量-效應依賴關系。

在細胞凋亡研究中，流式細胞術是一種可靠的技術手段，能夠較準確地測定出凋亡細胞占所測定總細胞的百分含量。本實驗用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染細胞凋亡試劑盒經流式細胞儀檢測HepG2細胞的凋亡情況，結果顯示，與對照組相比，不同質量濃度海灣扇貝多肽混合物處理組的HepG2細胞均出現一定程度的凋亡，且隨著海灣扇貝多肽混合物質量濃度的增加，死亡或晚期凋亡率、早期凋亡率均明顯升高。這說明海灣扇貝多肽混合物對人肝癌HepG2細胞的早期凋亡和晚期凋亡均有一定的誘導作用，且成劑量-效應正相關。

細胞凋亡是維持機體穩定的重要保護機制，一旦細胞凋亡機能紊亂或降低時，腫瘤發生率就會增加［19］。目前認為細胞凋亡的發生受多個基因的調控，其中，Bcl-2家族調節的線粒體通路是目前研究較為透徹的一個。該家族可分為2 個亞群：其中一個亞群由Bax、Bik、Bak等促凋亡分子組成；另一個亞群由Bcl-2、Bcl-X、Bcl-W等抗凋亡蛋白組成。下調Bcl-2蛋白表達或上調Bax蛋白表達可促進多種腫瘤細胞凋亡，反之則抑制腫瘤細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白對細胞凋亡的調控取決于自身表達水平的高低。因此，Bcl-2蛋白的表達水平具有重要的生理意義［20-21］。

朱開梅等［22-23］研究發現，構樹葉總黃酮可通過下調Bcl-2蛋白和上調Bax蛋白表達，即下調 Bcl-2/Bax，從而抑制HepG-2細胞的生長，誘導細胞凋亡。孟顯峰等［24］研究發現，肌醇六磷酸可能通過調控Bcl-2及Bax蛋白的表達而誘導HepG2細胞的凋亡。呂必華等［25］研究發現，選擇性環氧合酶-2抑制劑NS-398可能通過下調Bcl-2蛋白表達，活化Caspase-3通路，從而誘導肝癌細胞HepG2凋亡。另外，1979年被首次報道的p53也是重要的腫瘤抑制基因，是目前發現的與人類腫瘤相關性最高的基因［26］。p53蛋白在腫瘤細胞由G1期到S期的轉變中起重要調控作用，p53蛋白過度表達能阻滯細胞周期，影響細胞生長，并通過Caspases途徑最終誘導細胞凋亡［27］。本研究發現，與對照組相比，海灣扇貝多肽混合物作用于人肝癌HepG2細胞24 h后，p53蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低。

綜上所述，海灣扇貝多肽混合物對體外培養的人肝癌HepG2細胞生長有一定的抑制作用，可通過上調p53蛋白表達、下調Bcl-2蛋白表達誘導人肝癌HepG2細胞發生凋亡，從而發揮其抑瘤作用。

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Effect of Polypeptide Mixture from Bay Scallop on Proliferation and Apoptosis of HepG2 Cells

LIU Yuan1，2， WANG Jian2， MU Jianlou1， SUN Jianfeng1， WANG Jie1，*
（1. College of Food Science and Technology， Agricultural University of Hebei， Baoding071000， China；2. College of Agriculture and Forestry Science and Technology， Hebei North University， Zhangjiakou075000， China）

The antitumor effi cacy and mechanism of the polypeptide mixture from bay scallop were studied by CCK-8 assays using inverted microscope and fl uorescence-activated cell sorter （FACS）. The results showed that different concentrations of the polypeptide mixture from bay scallop （4， 6， 8， 10 and 12mg/mL） could suppress the growth of human hepatocellular carcinoma cells HepG2， and the growth inhibitory rate increased with increasing concentration of the polypeptide mixture. After treated with the polypeptide mixture at a dose of 12 mg/mL， the morphology of HepG2 cells was changed， showing cell shrinkage， decreased transparency and nuclear chromatin pyknosis as well as the appearance of apoptotic bodies. To conclude， the polypeptide mixture from bay scallop can induce apoptosis of HepG2 cells.

polypeptide from bay scallop； HepG2 cell； apoptosis

S986.1

A

1002-6630（2015）23-0257-05

10.7506/spkx1002-6630-201523047

2015-01-30

國家海洋公益性行業科研專項（201205031）；河北省科技計劃項目（14273205D-3）

劉媛（1981—），女，講師，博士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏工程。E-mail：liuyuanwenwen1981@126.com

王頡（1959—），男，教授，博士，研究方向為食品加工與利用。E-mail：wj591020@163.com