生鮮家畜肉類與水產魚蝦類物流過程中微生物菌相變化的研究進展

楊　超，車　有，宋存江*

（南開大學生命科學學院，分子微生物與技術教育部重點實驗室，天津　30007　1）

生鮮家畜肉類與水產魚蝦類物流過程中微生物菌相變化的研究進展

楊超，車有，宋存江*

（南開大學生命科學學院，分子微生物與技術教育部重點實驗室，天津300071）

生鮮家畜肉類及水產魚蝦類物流過程中的腐敗變質主要由微生物引起。隨著分子生物學技術的快速發展，分子生態技術已成為研究生鮮家畜肉類及水產魚蝦類物流過程中微生物菌相變化的主要手段。引起生鮮家畜肉類及水產魚蝦類在物流過程中腐敗變質的微生 物也不斷被發現。本文綜述了生鮮家畜肉類及水產魚蝦類物流過程中常見微生物物種，包括肉食桿菌、乳酸菌、沙門氏菌屬、假單胞菌屬、明串珠菌屬、熱殺索絲菌、單增李斯特氏菌等細菌以及酵母菌、霉菌等真菌；介紹了2010年后多用于生鮮家畜肉類和水產魚蝦類菌相研究的分子生態技術，包括變性梯度凝膠電泳技術、末端限制性片段長度多態性技術、高通量測序技術和實時定量聚合酶鏈式反應技術，旨在為我國生鮮家畜肉類及水產魚蝦類的菌相研究提供參考。

生鮮家畜肉類；水產魚蝦類；腐敗變質；微生物菌相；分子生態技術

生鮮家畜肉類和水產魚蝦類作為生鮮肉類和水產品重要的組成部分，是我國居民日常消費的主要食品之一。我國是世界生鮮肉類和水產類第一生產大國［1］，但由于國內物流保鮮技術尚不完善，目前我國生鮮產品在物流過程中的腐敗率超過35%，其中肉類和魚類產品腐敗率約占15%［2］，難以滿足國民對食品質量的要求。為此，提高生鮮家畜肉類及水產魚蝦類在物流過程中的保鮮技術已迫在眉睫。在物流過程中，微生物的繁殖是引起生鮮家畜肉類及水產魚蝦類腐敗變質的根源。因此，開展生鮮家畜肉類及水產魚蝦類中微生物的菌相研究對于生鮮家畜肉類及水產魚蝦類物流過程中保鮮技術的研究具有重要意義。

1983年Blickstad［3］和Dainty［4］等采用傳統微生物培養的手段，對冷藏肉類中的微生物進行富集培養、篩選，在冷藏保鮮豬肉中篩得大量乳酸菌類。隨后，Gill［5］、Church［6］和Borch［7-8］等在冷藏保鮮的豬肉中分離得到了肉食桿菌（Carnobacterium）、乳桿菌（Lactobacillus）和熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）， 初步探究了生鮮家畜肉類及水產魚蝦類中微生物的物種。然而，采用傳統微生物培養技術會受到培養條件的限制，并不能展示食物中真正的菌相分布。不同微生物對不同營養物質的偏好性不同、微生物間的競爭抑制、培養溫度以及溶氧條件等諸多因素導致培養基中適宜生長的微生物數量增加，而不適宜培養的微生物最終減少直至消亡；同時，采用傳統微生物培養策略，只能對食物中數量占優勢的微生物進行鑒定，這些問題已成為菌相分析的技術難題。

近年，隨著分子生態技術的發展，微生物的分析手段日益完善。特別是在食品微生物領域，以DNA指紋技術［9］為基礎所演生的分子生態技術被使用之后，生鮮家畜肉類和水產魚蝦類中微生物菌相分布研究取得了長足進步。Zhao Fan等［10］利用高通量測序技術監測豬肉腐敗過程中的菌相變化，發現了微球菌科（Micrococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）等微生物參與腐敗過程，并在腐敗末期檢測到77%的微生物來自厚壁菌門（Firmicutes）。這表明利用靈敏度更高的分子生態技術不僅可以檢測到傳統培養法難以發現的微生物物種，同時亦可監測微生物的豐度水平，推動了該領域的研究發展。

為了促進分子生態技術在該領域的進一步發展，本文綜述了近年利用分子生態技術在生鮮家畜肉類和水產魚蝦類物流過程中發現的常見微生物物種，并介紹了該領域常用的變性梯度凝膠電泳技術、末端限制性片段長度多態性分析技術和實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術。此外，隨著測序技術的快速發展，一種能夠對微生物基因組測序并自動鑒定菌種的MicroSeq［11］微生物鑒定平臺應運而生，使得食品微生物菌相分布的研究更加全面，自動化程度也大幅提高。

1　生鮮家畜肉類和水產魚蝦類物流過程中腐敗微生物菌相分布的研究進展

1.1生鮮家畜肉類物流過程中微生物的菌相分布

生鮮家畜肉類通常在0～4 ℃條件下運輸或采用冰點以下的微凍技術長期冷藏［12］。在該領域研究初期［6-7，13］，真空冷藏保鮮的肉類中以肉食桿菌、乳桿菌、明串珠菌（Leuconostoc spp.）、熱殺索絲菌為肉類腐敗的主要菌群。隨著研究技術水平的提高，更多的微生物在生鮮家畜肉類中被發現，微球菌科、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、乳桿菌科和肉桿菌科（Carnobacteriaceae）等被鑒定為冷藏保鮮肉類中常見微生物［14］。此外，由于屠宰加工環境及保藏條件的限制，一些常見微生物也經常在生鮮家畜肉類研究中被報道。如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［15］、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［15］、沙門氏菌屬（Salmonella spp.）［15-16］、單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）［15-18］和假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）［14，19］等均為生鮮家畜肉類中的常見微生物，是肉制品衛生安全的檢測指標。除了細菌，多種真菌［20-21］和酵母菌類［21］微生物也在生鮮家畜肉類腐敗過程中被檢測到（表1）。

表1　生鮮家畜肉類及水產魚蝦類中常見致腐菌屬及菌種Table 1 Common genus and species of microorganism in fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp during logistics

物流過程中肉類一旦發生腐敗，肉類中的微生物組成也將發生動態變化。Fontana等［13］發現在真空冷藏保鮮的牛肉中，保藏初期以米酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）為主要菌群，隨著保藏時間的推移，牛肉逐漸腐敗變質，米酒乳酸桿菌逐漸消失，取而代之的是彎曲乳酸桿菌（Lactobacillus curvatus）、明串珠菌和熱殺索絲菌。這表明肉類腐敗的不同階段，其微生物種類和豐度也在發生著動態變化。隨著肉類腐敗過程中營養物質、pH值等不斷變化，保藏初期占優勢的微生物其生長遭到抑制，而另一些微生物逐漸成為優勢菌群，導致了生鮮家畜肉類中微生物的演替。因此，針對物流過程中肉類腐敗的不同階段采取不同的保鮮手段和使用防腐保鮮劑，將有效延長生鮮家畜肉類的貨架期，為肉類保鮮技術和保鮮劑的開發提供參考。

此外，地域和保藏方式的差異也會影響肉類中的菌相分布（表1）。Mihaiu等［16］在來自羅馬尼亞的豬肉中發現沙門氏菌屬為豬肉腐敗末期菌相中主要致腐菌之一，這與前人報道的假單胞菌或乳酸菌類作為主要腐敗菌略有不同。而Coton等［23］發現在有氧條件下保藏的肉類其腐敗末期以熱殺索絲菌、假單胞菌屬和希瓦氏菌（Shewanella spp.）為主，并發現在厭氧條件下假交替單胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）也是參與肉類腐敗變質的主要菌群之一。生鮮家畜肉類在物流過程中其微生物的菌相分布比較復雜，不同來源、不同保鮮方式的肉類，其菌相分布也各有差異。探究不同保鮮方式的微生物菌相分布，有利于保鮮技術的應用，從而延長生鮮家畜肉類的貨架期。

1.2水產魚蝦類物流過程中的微生物菌相分布

新鮮的水產魚類、蝦類等因捕撈后通常不會進行清洗，其表面、鰓內及消化系統內存在大量微生物，不同環境生長的魚類其初始微生物菌相分布也大不相同。但經過低溫保藏的水產魚類腐敗后，其微生物菌群主要以假單胞菌屬、嗜冷菌屬（Psychrobacter spp.）、沙雷氏菌屬（Serratia spp.）、微桿菌屬（Exiguobacterium spp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcus spp.）為主要菌群（表1）。此外，Noseda等［24］在真空冷藏的鯰魚中證實了乳酸菌類（lactic acid bacteria）和熱殺索絲菌也是魚肉腐敗末期的主要菌群之一。而Bjornsdottir-Butler等［32］從保藏的黃鰭金槍魚、藍魚和假長鰭魚中檢測到了美人魚發光桿菌（Photobacterium damselae）、志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）、希瓦氏菌和摩氏摩根菌（Morganella morganii）等非常見微生物。

相比生鮮家畜肉類，水產魚蝦類物流過程中其微生物物種多樣性更為復雜，對保鮮工藝要求更加嚴格，但其菌相變化規律卻有相似之處。Boziaris等［21］在研究水產變質過程中發現，隨著食物pH值的降低，食物中革蘭氏陰性菌逐漸減少，而乳酸菌類和酵母菌類微生物逐漸成為優勢菌群。這與生鮮家畜肉類中的變化趨勢基本一致。因此，針對水產魚蝦類中復雜菌相的潛在優勢菌群進行防腐抑制，對延長水產魚蝦類的貨架期有著重要指導意義。

2　生鮮家畜肉類和水產魚類微生物引起腐敗變質過程

2.1生鮮家畜肉類微生物致腐過程

在肉類腐敗初期，葡萄糖作為肉中微生物生長繁殖的主要碳源，隨著肉中葡萄糖的消耗已不能滿足微生物的生長繁殖，微生物開始利用肉中游離的氨基酸等小分子物質作為碳源，此過程會因降解氨基酸而產生酮酸和氨類，而因此產生惡臭味［33］。腸桿菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬和乳酸菌屬等都是腐敗過程中氨類物質的主要微生物源［34］。

在肉類腐敗中期和末期，此時微生物菌群數量達到一定規模，其分泌的蛋白酶足以降解肉中的蛋白質以進一步增殖，加速肉的腐敗變質，肉本身也出現不同程度的腐爛、惡臭、顏色變暗或變綠，其表面也產生黏性物質，甚至滋生霉菌［33，35］。

2.2水產魚蝦類微生物致腐過程

水產魚類腐爛前會因為機體死亡后停止呼吸，導致厭氧條件下糖酵解作用引發乳酸堆積，導致體內pH值下降，此時魚體僵硬，但鮮度基本沒有被破壞［36］。隨后魚類開始進入腐敗階段，伴隨微生物的生長繁殖，魚體內蛋白質經微生物脫羧酶作用，催化氨基酸脫羧而產生生物胺（鹽酸丁二胺、五甲烯二胺、組胺、酪胺等［36］）及小分子碳源開始積累。隨著微生物的生長，魚肉鮮度降低至最終完全腐敗。

捕獲后的新鮮水產魚類一般不會進行細致清洗，其表面、鰓內和其他器官內存在著大量微生物，隨著各種氨基酸及小分子碳源的增加，這些微生物開始快速繁殖，在降解氨基酸和其他小分子物質的同時產生一種名為“三甲胺”的物質，進而產生腥臭味［36］。伴隨微生物的大量繁殖，微生物侵入各個器官，引發魚體內蛋白質和氨基酸的降解，從而最終造成水產魚類的完全腐敗，此時魚已經失去食用營養價值。

3　生鮮家畜肉類及水產魚蝦類腐敗研究中常用的微生物菌相分析方法

分子生物學技術通過對生命體進行分子水平的操作，以實現對生命體的改造［37］。隨著分子生物學技術的快速發展，微生物分子生態技術應運而生。微生物分子生態技術是利用分子生物學的技術方法對環境中的微生物進行分子水平的研究，從而了解環境中微生物的功能、多樣性及群落結構［37］。其中DNA指紋識別技術作為分子生態技術中的基礎研究方法，被廣泛應用于食品微生物菌相的研究中。DNA指紋技術是一種利用不同個體間DNA片段差異性而對不同個體進行鑒定的分子生物學手段［14］。細菌16S rDNA、真菌18S rDNA和真核ITS序列在不同微生物中具有特異性，常被用作微生物分類的依據，并可用于檢測微生物的相對數量。為了對細菌16S rDNA、真菌18S rDNA和ITS序列進行鑒定，常常用到以下分子生態技術。

3.1變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術

DGGE技術是1979年由Fischer等［38］最先提出的鑒定DNA突變的一種電泳分離技術，而Muyze等［39］首次將DGGE技術應用于微生物生態學研究，成為鑒定自然界微生物種群多樣性常用的技術手段。

DGGE技術可以將長度相同而堿基不同的雙鏈DNA片段（即突變序列）進行分離。利用雙鏈DNA序列堿基排列方式影響解鏈溫度的原理，將雙鏈DNA片段在含梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，當雙鏈DNA片段遷移到梯度凝膠一定距離且達到解鏈溫度后，開始部分解鏈［40］。DNA分子解鏈程度越小其遷移程度越大，從而使解鏈程度不同的雙鏈DNA分子分離，獲得純合的DNA片段［40］。為了在電泳過程中保證DNA雙鏈不完全分離，DNA片段進行PCR擴增時，其5'端會被引入一段30～50 bp的富含G/C堿基的“GC夾板”（GC-clamp），以保證DNA片段在梯度凝膠電泳時能夠充分分離［40］。

圖1　利用DGGE技術鑒別真空冷藏牛肉中的菌相分布［1133］Fig.1　Bacterial community of vacuum-packaged beef evaluated by DGGE fingerprint［13］

在生鮮家畜肉類和水產魚蝦類中，DGGE技術已被廣泛應用于微生物菌相的多樣性分析以及微生物菌相動態變化的監測。Fontana等［13］首次采用DGGE技術，確定了保藏末期真空冷藏牛肉中主要微生物為乳酸菌類。Broekaert等［28］則在冷凍保藏的水產魚類中檢測到培養基未能培養出的霉實假單胞菌（Pseudomonas fragi）和不動桿菌屬（Acinetobacter spp.）。DGGE技術作為分子生態學最基本的手段，已成為食品微生物菌相變化研究的常用手段。然而，盡管DGGE技術克服了傳統培養基培養法不能反映食物中真實菌相分布的缺點，但該方法還存在一定局限性。一些稀有微生物的基因組含量較低，采用DGGE技術鑒定的結果（圖1）只能反映優勢微生物（清晰較深的條帶）的分布狀態，也不能將生鮮家畜肉類和水產魚蝦類中活菌和死菌的分布狀態進行區分。因此，該方法只能用來定性分析生鮮家畜肉類和水產魚蝦類總體菌相變化，不能鑒定出全部微生物物種。

3.2末端限制性片段長度多態性（terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP）技術

TRFLP技術結合熒光標記技術、DNA限制酶切技術和DNA自動測序儀技術，能夠對特定核酸片段長度多態性進行測定，來鑒別環境中微生物的群落結構和功能［41］。

TRFLP技術在目標基因保守區擴增時，在5'端引入熒光標記序列（HEX、TET、6-FAM等）［42］。根據不同物種DNA保守區序列酶切位點不同的原理，對擴增后的保守區進行酶切，用熒光測序儀對帶有熒光標記的不同長度的酶切產物進行檢測［43］。通過熒光測序儀所收集的熒光信息及生成的TRFLP圖譜分析，便可分析得到微生物群落結構的物種種類、數量，確定微生物群落的結構變化［37］。

TRFLP技術方便快捷，相比DGGE技術更加靈敏方便。Kiermeier等［44］采用TRFLP和454測序技術，確定豬肉在真空和100% CO2保藏條件下微生物菌相隨保藏時間推移并不相同。Smith等［45］則利用TRFLP在牙鱈表面檢測到了發光細菌的存在。與DGGE技術相比，TRFLP技術可以定量檢測微生物的相對含量（圖2），可定量監測微生物的變化規律。

圖2　利用TRFLP峰值數據對不同時期真空條件和110000%　CCOO2條件保藏的羊肉菌相進行典型相關分析［4444］Fig.2　Canonical analysis of principal coordinates of TRFLP peak data from lamb samples packaged in vacuum and 100% CO2modified atmosphere［44］

3.3基于高通量測序技術的微生物鑒定系統（highthroughput sequencing）

隨著高通量測序技術的快速發展，測序時間和成本大幅降低，為微生物種群物種鑒定奠定基礎。以高通量測序技術為基礎的主要測序平臺包括Illumina的Hiseq和Miseq平臺、Roche454平臺以及Ion Torrent平臺。Illumina高通量測序技術因其測序通量高、數據量大而被廣泛使用，其中測序耗時更短的Miseq技術和測通量更高的Hiseq技術被廣泛應用于微生物物種鑒定及豐度測定中。

該技術已廣泛應用于污水處理等環境樣本的菌相研究中［46］。盡管還未見生鮮家畜肉類和水產魚蝦類中有過該技術報道，但在熟肉［47］等微生物鑒定中已有報道。Po?ka等［47］在最新的研究中利用高通量測序技術，在香腸發酵過程中成功鑒定到了多種葡萄球菌及乳酸菌類（圖3）。通常采用高通量測序技術在生鮮家畜肉類和水產魚蝦類中可以鑒定到上百種微生物，這是傳統平板培養法和DGGE技術所無法比擬的，此外，高通量測序技術可同時對多個樣本進行平行測序，進而對環境樣本物種分類、豐度、種群結構及群落變化等進行對比分析，從而系統地反映樣品中微生物的菌相變化。值得一提的是，該系統需要與構建好的基因文庫進行比對才能確定微生物物種。目前常用的基因文庫有16S rDNA、18S rDNA以及某些抗性基因的基因文庫，而其他具有特定功能的基因文庫種類并不豐富，有待進一步完善。

圖3　根據高通量測序結果對香腸中微生物進行聚類分析［4477］Fig.3　Hierarchical clustering of microbial classified sequences by highthroughput sequencing in Italian salami［47］

3.4實時定量熒光聚合酶鏈式反應技術（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）

實時定量熒光聚合酶鏈式反應（real-time PCR）技術是利用熒光信號作為探針以監測模板定量的PCR檢測技術。通常采用SYBR Green作為熒光嵌合或TaqMan作為探針，在PCR擴增反應的每一個循環中，通過檢測隨機擴增產物同步積累的熒光信號，實現特異性擴增模板的進行定量分析［48］。

由于Real-time PCR能夠靈敏、快速地檢測出模板量相對較少的DNA，被廣泛應用于微生物的定量分析檢測和功能基因的檢查［17］。Gattuso等［17］采用Real-time PCR方法，在豬肉保藏期間，檢測李斯特氏菌的增殖變化，確認李斯特氏菌是豬肉腐敗末期的主要微生物之一。Kumar等［49］則利用Real-time PCR技術，確定腐敗末期的海鮮魚類微生物以假單胞菌、嗜冷菌以及沙雷氏菌為主（圖4）。Real-time PCR技術通過定量分析微生物物種DNA數量，更加直觀地表現了不同微生物在微生物菌群中數量水平的變化，從而確定優勢菌群。Real-time PCR技術不僅可以定量確定優勢菌群，還可以檢測稀有菌的存在。Bjornsdottir-Butler等［32］利用Real-time PCR技術在保藏的金槍魚中檢測到少量存在的摩氏摩根菌，而使用DGGE技術未檢測到該菌，證實了Real-time PCR的靈敏性。

Real-time PCR技術與其他技術不同，是對活菌中RNA進行分析的技術，是鑒定活菌菌相的有效技術手段。相信該技術今后在研究生鮮家畜肉類和水產魚蝦類物流 過程中菌相變化的過程中發揮重要作用。

圖4　利用Real-time PCR技術檢測海鮮食品中沙門氏菌的數量變化［4499］Fig.4　Detection of Salmonella in seafood by real-time PCR assay［49］

3.5分子生態技術展望

以上4 種分子生態技術均為近年在生鮮家畜肉類和水產魚蝦類菌相研究中的常用手段。它們均能進行微生物的物種鑒定和豐度分析，反映生鮮家畜肉類和水產魚蝦類中細菌和真菌的分布狀態。在生鮮家畜肉類和水產魚蝦類微生物總DNA的提取過程中，食物DNA混雜于其中，對微生物的豐度檢測產生了干擾。為此，通過建立細菌16S rDNA文庫和真菌18S rDNA及ITS文庫，將樣品總DNA與文庫進行比對篩選，排除測序獲得的肉類及水產魚蝦類DNA序列，提高微生物豐度分析的精度。

在食物腐敗過程中，一些死亡微生物的DNA不能完全降解，采用基于微生物總DNA的研究方法不能區分食物中活菌與死菌。因此，采用基于DNA的分子生態技術并不能反映食物中活菌的分布狀態。由于死亡微生物的RNA會快速降解，通過對微生物總RNA的分析可以更加可靠地反映出活菌菌相的分布狀態，這對研究生鮮家畜肉類及水產魚蝦類微生物菌相變化有著重要意義。然而，目前該領域還只局限在對微生物總DNA水平的研究分析，而基于微生物總RNA的分析技術鮮見于生鮮家畜肉類及水產魚蝦類的菌相研究，這也限制了分子生態技術在生鮮家畜肉類和水產魚蝦類中微生物菌相研究的發展。

此外，DNA微陣列（DNA microarray）、自動核糖體間隔基因分析（automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA）、單鏈構型多態性分析（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、核糖體DNA擴增片段限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）等技術均為常用的分子生態技術。但根據近年報道［17-49］，這些技術尚未在生鮮家畜肉類及水產魚蝦類微生物菌相研究中被廣泛應用。一些技術與本文介紹的4 種技術方法相似（如SSCP與DGGE技術，ARDRA與TRFLP技術等），同時某些技術隨著分子生態技術的發展而被逐漸取代（如以DNA微陣列為基礎發展而來的高通量測序技術因具有更高的測通量，將成為分子生態研究中的主流技術之一）。相信隨著該領域研究的不斷深入，更多的分子生態技術將被廣泛應用。

4　結 語

本文綜述了生鮮家畜肉類及水產魚蝦類物流過程中常見的微生物物種。其中乳酸菌類、肉食桿菌、沙門氏菌屬、假單胞菌屬、熱殺索絲菌和單增李斯特氏菌等是腐敗過程中常被報道的微生物，而一些發光細菌和酵母菌、霉菌等真菌也偶爾被發現。在腐敗初期，乳酸菌類、肉食桿菌、假單胞菌屬、熱殺索絲菌等微生物被檢測到的水平較低，而隨著時間推移，在腐敗末期這些微生物成為食物腐敗的主要微生物，這表明隨著生鮮家畜肉類和水產魚蝦類腐敗的進行，微生物種類和豐度也在發生著動態變化。此外，微生物種類與物流過程中保藏方式密切相關。在真空保藏的條件下常檢測到明串珠菌屬、棒狀桿菌屬等微生物，而在托盤包裝中大腸桿菌、不動桿菌及梭桿菌等微生物又常被發現于腐敗的生鮮家畜肉類和水產魚蝦中。生鮮家畜肉類和水產魚蝦類在腐敗過程中的菌相研究經歷了由傳統培養方法到分子生態學研究的重要轉型時期。本文綜述了近5 a常用于生鮮家畜肉類和水產魚蝦類相關分子生態技術，介紹了該領域作為基礎研究手段而被廣泛使用的DGGE技術、與熒光技術相結合的TRFLP技術、可以檢測功能基因的Realtime PCR技術和新一代的高通量測序技術。

盡管人們對生鮮家畜肉類及水產魚蝦類中微生物的菌相變化進行了很多研究，但對食品變質過程中與腐敗相關的功能基因及耐受基因的研究還有待深入。此外，采用基于微生物總DNA的研究策略并不能區分出活菌與死菌的分布水平。能夠監測活菌的總RNA分析技術在生鮮家畜肉類及水產魚蝦類的菌相研究中有待推廣使用。

生鮮家畜肉類和水產魚蝦類的菌相分析研究為預防食品變質、延長貨架期等提供重要的理論依據。作為新一代的研究策略，高通量測序技術可以更加全面、準確地監測食品中微生物的菌相變化，特別是微生物高通量測序平臺的建立，使得食品微生物菌種鑒定和菌相變化規律的研究更加自動化、精準化，將成為食品微生物菌相研究的重要研究手段。筆者正在對生鮮家畜肉類和水產魚蝦類中微生物總RNA的分析技術進行探索，結合高通量測序、Real-time PCR等分子生態技術對物流過程中微生物活菌的菌相變化進行研究。隨著基于RNA分析技術的不斷完善以及高通量測序技術在該領域的普及，相信生鮮家畜肉類和水產魚蝦類的菌相研究會更加深入，將為食品保鮮技術的發展提供理論上的保障。

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Progress in Research on Microbial Flora in Fresh Livestock Meat and Aquatic Fish and Shrimp during Logistics

YANG Chao， CHE You， SONG Cunjiang*
（Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology， Ministry of Education， College of Life Sciences，Nankai University， Tianjin300071， China）

Spoilage of fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp is mainly caused by microbial growth during logistics. In recent years， with the rapid development of molecular ecological techniques， many kinds of microbes have been detected in fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp， including Carnobacterium spp.， Lactobacillus spp.， Salmonella spp.， Pseudomonas spp.， Leuconostoc spp.， Brochothrix thermosphacta， Listeria monocytogenes， yeasts， molds and so on. This review summarizes common molecular biology techniques that were applied during 2010 to 2015 to microbial flora in fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp during logistics. Molecular ecological techniques including denaturing gradient gel electrophoresis， terminal restriction fragment length p olymorphism， high-throughput sequencing and realtime PCR are also described to provide a reference for studying microbial flora in fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp during logistics.

fresh livestock meat； aquatic fish and shrimp； spoilage； microbial flora； molecular ecological techniques

TS201.3

A

1002-6630（2015）23-0307-07

10.7506/spkx1002-6630-201523056

2015-02-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD16B04）；國家自然科學基金面上項目（31470213；31170030）；天津市重點支撐計劃項目（13JCZDJC27800；13JCYBJC24900；13TXSYJC40100；14ZCZDSF00009）

楊超（1991—），男，博士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：ychych3412@163.com

宋存江（1961—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：songcj@nankai.edu.cn