SF/PCL-BSA皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架的制備及緩釋性能

張海濤，駱菁菁，邢同海，張 潔，熊 杰，b

（浙江理工大學(xué)，a.材料與紡織學(xué)院；b.先進(jìn)紡織材料與制備技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310018）

SF/PCL-BSA皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架的制備及緩釋性能

張海濤a，駱菁菁a，邢同海a，張 潔a，熊 杰a，b

（浙江理工大學(xué)，a.材料與紡織學(xué)院；b.先進(jìn)紡織材料與制備技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310018）

以絲素（SF）和聚己內(nèi)酯（PCL）為皮層，牛血清白蛋白（BSA）為芯層，利用濕法靜電紡絲和同軸靜電紡絲相結(jié)合的方法制備三維多孔SF/PCL-BSA皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架，對(duì)支架的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，確定其工藝參數(shù)，并研究不同皮芯流率對(duì)納米纖維支架在釋放性能上的影響。結(jié)果表明：在電壓15 k V，皮層流率0.3 mL/h，皮芯流率比3∶1和3∶2的工藝條件下可以得到表面形貌良好，皮芯結(jié)構(gòu)明顯的納米纖維，制備的皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維均可支持BSA近110 h的釋放，無(wú)“突釋”現(xiàn)象，皮芯流率比為3∶1時(shí)得到的納米纖維皮層較厚，釋放較緩慢，釋放機(jī)制為non-fickian擴(kuò)散機(jī)制；皮芯流率比為3∶2時(shí)得到的納米纖維皮層較薄，釋放較快，釋放機(jī)制為骨架溶蝕機(jī)制。

絲素蛋白；聚己內(nèi)酯；皮芯結(jié)構(gòu)；同軸靜電紡絲；緩釋性能；納米纖維支架

0　引 言

濕法靜電紡絲可以制備具有三維多孔結(jié)構(gòu)的組織工程支架來(lái)模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)［1］。而天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）不僅為細(xì)胞生長(zhǎng)提供結(jié)構(gòu)支撐，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌并儲(chǔ)存生長(zhǎng)因子［2］。這就要求組織工程支架在模擬天然組織結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，還要具有能負(fù)載生長(zhǎng)因子、小分子藥物等環(huán)境刺激因素的緩釋系統(tǒng)。目前較為理想的緩釋系統(tǒng)結(jié)構(gòu)是將生長(zhǎng)因子包裹在纖維內(nèi)部形成皮芯結(jié)構(gòu)［3］。目前常用的制備皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維的方法是乳液靜電紡絲［4］和同軸靜電紡絲［5］。Zhang等［5］和Jiang等［6］利用同軸靜電紡絲法分別制備了以聚己內(nèi)酯（PCL）為皮層，以聚乙二醇（PEG）/牛血清白蛋白（BSA）和PEG/熒光化BSA為芯層的皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維膜，證明了同軸靜電紡絲納米纖維具有良好的緩釋性能。

絲素蛋白（SF）來(lái)源于天然蠶絲，具有良好的生物相容性；PCL是一種合成材料，具有良好的力學(xué)性能，兩者均廣泛地被應(yīng)用于組織工程支架研究領(lǐng)域，而將兩者共混，可得到生物性能和力學(xué)性能均良好的支架材料［7］。BSA是一類天然蛋白質(zhì)，可作為生長(zhǎng)因子的保護(hù)劑和緩釋模型［8］。

本文將同軸靜電紡絲和濕法靜電紡絲相結(jié)合，以SF/PCL共混體系為皮層，以牛血清白蛋白（BSA）水溶液為芯層和緩釋模型藥物，研究濕法同軸靜電紡絲制備SF/PCL-BSA皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架的工藝參數(shù)，以及不同皮芯流率比對(duì)BSA緩釋性能的影響。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和材料

再生絲素蛋白（實(shí)驗(yàn)室自制）；聚己內(nèi)酯（分析純，相對(duì)分子質(zhì)量8萬(wàn)，深圳光華偉業(yè)實(shí)業(yè)有限公司）；碳酸鈉（分析純，成都東金化學(xué)試劑有限公司）；98%甲酸（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；透析袋（截留分子量8000～14400 Da，美國(guó)聯(lián)合碳化物公司）；無(wú)水乙醇（分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，MW 66 k Da，Biosharp公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

高壓電源（FC60P2，0～50 k V，美國(guó)Glassman公司）；微量注射泵（KDS 220，美國(guó)KDS Scientific Inc）；磁力攪拌器（IKA?CM-MAG HS 7，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；冷凍干燥機(jī)（FreeZone?2.5 LiterFreeze Dry Systems，LABCONCO公司）；超級(jí)恒溫水槽（DKB-S24，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3濕法同軸靜電紡絲裝置

濕法同軸靜電紡絲裝置是在濕法靜電紡絲裝置的基礎(chǔ)上，將平頭不銹鋼針頭換成特殊的同軸靜電紡絲針頭，如圖1所示。

圖1　濕法同軸靜電紡絲裝置

1.4皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架的制備

將適量SF和PCL按照質(zhì)量比70∶30溶解于甲酸溶液中，配制成18%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的皮層紡絲液。將適量BSA溶解于去離子水中，配制成0.3 g/mL的芯層紡絲液。利用圖1的濕法同軸靜電紡絲裝置進(jìn)行紡絲。設(shè)置皮層流率為0.3 mL/h不變，調(diào)整外加電壓為18、15、12 k V，調(diào)整芯層流率分別為0.1、0.2、0.3 mL/h。將收集的納米纖維分散液移入透析袋，在去離子水中透析2 d，置于模具中定型后冷凍干燥得到皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架。

1.5皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架的形貌、結(jié)構(gòu)測(cè)試

使用vltra55場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡和BX51光學(xué)顯微鏡，觀察納米纖維支架表面形貌和納米纖維形貌。使用JSM-2100透射電子顯微鏡（TEM，JEOL，Japan，加速電壓為200 k V），觀察納米纖維的皮芯結(jié)構(gòu)。

1.6皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架的釋放性能測(cè)試

本文使用的模型藥物是牛血清白蛋白，其含量可由蛋白質(zhì)的紫外吸光度［9］來(lái)進(jìn)行測(cè)定。首先精確稱量適量的BSA溶于PBS溶液中，分別配制已知濃度的BSA溶液并在278 nm處測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合標(biāo)準(zhǔn)方程。然后，將皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架放置在6孔板中，加入10 mL的PBS緩沖液，保持水平溫和晃動(dòng)，37℃培育。在培育達(dá)到2、12、24、39、51、63、80、110 h時(shí)，取出2 mL的浸出液測(cè)定吸光度，同時(shí)加入2 mL新鮮的PBS緩沖液。

累積釋放量Q由下式計(jì)算：

式（1）中：Mt是t時(shí)間的BSA釋放量，Mi是i時(shí)間的BSA釋放量，Mx是理論上纖維內(nèi)含有的BSA的量；假設(shè)靜電紡絲中全部纖維都被接收，可由式（2）計(jì)算纖維理論上含有的蛋白量。式（2）中：Mc是芯層紡絲液中蛋白的質(zhì)量，M0是皮層和芯層紡絲液中溶質(zhì)的總質(zhì)量，M1是測(cè)試中的皮芯結(jié)構(gòu)納米支架的質(zhì)量。

2　結(jié)果與討論

2.1皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維的形貌分析

電壓和皮芯層紡絲液流率比是影響同軸靜電紡絲納米纖維的主要工藝參數(shù)，本文將主要通過(guò)調(diào)節(jié)這兩項(xiàng)參數(shù)來(lái)得到皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維。

2.1.1電壓對(duì)皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維形貌的影響

芯層紡絲液選用BSA水溶液，溶液本身的黏度很低，不能單獨(dú)靜電紡絲，所以施加的電壓參照皮層紡絲液。在此，固定皮芯層紡絲液的流率比為3∶1（皮層流率0.3 mL/h，芯層流率0.1 mL/h），調(diào)節(jié)不同電壓來(lái)研究其對(duì)同軸靜電紡絲的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外加電壓為18 k V時(shí)，芯層紡絲液在強(qiáng)電場(chǎng)作用下的流體擾動(dòng)非常劇烈，常常突破皮層紡絲液?jiǎn)为?dú)噴出，在收集板上形成液滴，而被突破的皮層紡絲液會(huì)單獨(dú)成絲，如圖2（a）所示。當(dāng)電壓降低到15 k V時(shí)，芯層紡絲液的擾動(dòng)有所緩解，噴嘴處形成了較為穩(wěn)定的泰勒錐，在接收板上得到了形貌較好的納米纖維，如圖2（b）所示。當(dāng)電壓降低到12 k V時(shí)，噴嘴處的帶電液滴不能有效地被拉伸，觀察不到明顯的泰勒錐，且紡絲液在噴嘴處堆積造成噴嘴很快被堵塞，不能在接收板上得到明顯的納米纖維。綜上所述，宜選用15 k V為外加電壓。

2.1.2皮芯層紡絲液流率比對(duì)納米纖維形貌的影響

參考上文結(jié)果固定外加電壓為15 k V。當(dāng)皮芯層紡絲液流率比3∶1時(shí)可以在接收板上得到形貌較好的納米纖維（見(jiàn)圖2（b））；當(dāng)皮芯層紡絲液流率比為3∶2（皮層流率0.3 mL/h，芯層流率0.2 mL/ h），噴嘴處的泰勒錐有一定程度的拉長(zhǎng)，但收集板上還是能得到形貌良好的納米纖維，未觀察到液滴和明顯的串珠，如圖3（a）所示；當(dāng)皮芯層紡絲液流率比為3∶3（皮芯層流率均為0.3 mL/h），噴嘴處的泰勒錐變成了圓潤(rùn)的帶電液滴，收集板上得到了部分未見(jiàn)明顯串珠的納米纖維，如圖3（b）所示，但噴嘴處的帶電液滴會(huì)大量積聚，而后從噴嘴處滴下。

圖2　不同電壓制備的納米纖維的光學(xué)顯微照片

圖3　不同紡絲流率比制備的納米纖維的光學(xué)顯微照片

為進(jìn)一步觀察所得納米纖維的形貌，將部分不同工藝條件下收集的納米纖維進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖4所示。

圖4　不同紡絲參數(shù)下的SF/PCL-BSA皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維的SEM圖

從圖4（a）可以看出，當(dāng)流率比為3∶1時(shí)，所得到的納米纖維的形貌良好，沒(méi)有明顯的串珠，纖維直徑較小，均一性良好。從圖4（b）可以看出，當(dāng)流率比為3∶2時(shí)，所得到的納米纖維未出現(xiàn)明顯的串珠結(jié)構(gòu)，但纖維直徑變粗，較為不均一。從圖4（c）可以看出，當(dāng)流率比為3∶3時(shí)，部分纖維出現(xiàn)了串珠結(jié)構(gòu)，纖維直徑不夠均一。圖4（d）是上述納米纖維的平均直徑和標(biāo)準(zhǔn)差的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，從圖中可以看出，流速比為3∶1時(shí)得到的納米纖維的平均直徑為（182±78）nm，小于SF/PCL單獨(dú)靜電紡絲時(shí)的平均直徑（295±86）nm。分析認(rèn)為這因?yàn)樾緦蛹徑z液為黏度較小的水溶液，降低了整個(gè)體系的黏度，使得纖維更加易于拉伸［4］。流速比為3∶2時(shí)得到的納米纖維的平均直徑為（325±265）nm，直徑分布比SF/PCL單獨(dú)靜電紡絲時(shí)變得寬。分析認(rèn)為較細(xì)的纖維應(yīng)是皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維，而較粗的纖維應(yīng)是共混納米纖維，芯層紡絲液中的水使PCL凝固析出，限制了纖維的進(jìn)一步拉伸，得到的為較粗的纖維。當(dāng)流速比為3∶3時(shí)得到的納米纖維的出現(xiàn)了串珠結(jié)構(gòu)，分析認(rèn)為芯層流率過(guò)大，使皮層紡絲液不能完全包裹芯層紡絲液，形成了共混結(jié)構(gòu)，而且共混位置的芯層紡絲液較多，使得PCL沒(méi)有充分拉伸就固化析出，形成了串珠。

2.2納米纖維的皮芯結(jié)構(gòu)分析

將上述形貌較好的納米纖維進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察，結(jié)果如圖5。從圖5可以看出，皮芯層流率比為3∶1和3∶2均可以得到明顯的皮芯結(jié)構(gòu)的納米纖維。因芯層紡絲液以水為溶劑，而水對(duì)于PCL是不良溶劑，因此芯層不會(huì)大量擴(kuò)散到皮層中，使二者存在明顯的界面。如圖5（a）所示，當(dāng)流率比為3∶1時(shí)，芯層明顯處于纖維的中軸線上，所得皮芯結(jié)構(gòu)中皮層厚度較厚，約為22 nm左右，芯層直徑占纖維直徑的29.03%。從圖5（b）可以看出，當(dāng)流率比為3∶2時(shí)，皮層較薄，皮層厚度僅為12.5 nm左右，芯層直徑占纖維直徑的79.83%。TEM測(cè)試過(guò)程中發(fā)現(xiàn)呈皮芯結(jié)構(gòu)的納米纖維占大多數(shù)，而未形成皮芯結(jié)構(gòu)的納米纖維中的BSA會(huì)在透析過(guò)程中被洗脫，對(duì)釋放性能不產(chǎn)生影響。

圖5　皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維的TEM圖

2.3皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架的藥物釋放性能

將一定質(zhì)量的BSA溶于PBS溶液并測(cè)試其吸光度，繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，其結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6顯示，曲線擬合情況良好，方程式為y=0.5459x+ 0.02138，R2=0.9992。

圖6　BSA標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線

圖7是不同皮芯流率比的納米纖維支架的體外累計(jì)釋放曲線。從圖7可以看出，當(dāng)皮芯流率比為3∶1時(shí)，前期釋放得較快；釋放12 h的釋放量達(dá)到14.59%，27 h后達(dá)到32.26%；27 h后釋放速度稍放緩，53 h后釋放量達(dá)到38.67%；此后釋放速度再次加快，108 h后釋放量達(dá)到81.52%。同樣的規(guī)律也可以在流率比為3∶2的曲線上看到，27 h釋放量達(dá)到38.85%，53 h達(dá)到54.39%，108 h后釋放量達(dá)到95.04%。總體來(lái)說(shuō)皮芯流率比為3∶2時(shí)的釋放量大于3∶1時(shí)的釋放量。

圖7　不同皮芯流率比的納米纖維支架累計(jì)釋放曲線

由《中國(guó)藥典》［10］可知，藥物從載體中的釋放通常由一種甚至幾種機(jī)制同時(shí)作用。因BSA屬于水溶性藥物，在去離子水中透析后，皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維幾乎不存在殘留在纖維表面的BSA，所以可能的調(diào)控機(jī)制是藥物從溶脹的基體材料中擴(kuò)散以及載藥骨架溶蝕后藥物釋放。分析認(rèn)為當(dāng)皮芯流率比為3∶1時(shí)，皮層較厚，釋放介質(zhì)首先使納米纖維溶脹，在纖維上出現(xiàn)孔洞，BSA通過(guò)這些孔洞釋放到介質(zhì)中；隨著釋放時(shí)間延長(zhǎng)，纖維開(kāi)始降解，BSA進(jìn)一步通過(guò)這些破裂的部位釋放。當(dāng)皮芯流率比為3∶2時(shí)，皮層較薄，釋放介質(zhì)使纖維溶脹，而部分較薄的皮層很快出現(xiàn)了溶蝕，BSA快速地通過(guò)溶蝕部位釋放到介質(zhì)中去。

2.4皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架的釋放機(jī)制探討

由上文的分析可知，本文中的BSA的釋放主要是擴(kuò)散機(jī)制和骨架溶蝕機(jī)制的作用，具體歸屬可由Ritger-peppas模型［11］來(lái)判斷：

其中：Q為累計(jì)釋放率，t為釋放時(shí)間，n為釋放特征參數(shù)，與載藥系統(tǒng)的形狀有關(guān)，可以用來(lái)描述藥物的釋放機(jī)制機(jī)理［11］：對(duì)于纖維這種圓柱形系統(tǒng)，當(dāng)n＜0.45時(shí)，屬于fickian擴(kuò)散；當(dāng)0.45＜n＜0.89時(shí)，屬于non-fickian擴(kuò)散，即擴(kuò)散和骨架溶蝕同時(shí)作用；當(dāng)n＞0.89時(shí)，屬于骨架溶蝕機(jī)制。本文兩種不同皮芯流率比的納米纖維支架的Ritger-peppas模型擬合結(jié)果如表2所示。

表2　不同皮芯流率比的納米纖維支架的Ritger-peppas模型擬合結(jié)果

從表2可以看出，皮芯流率比為3∶1時(shí)n=0.781，屬于non-fickian擴(kuò)散機(jī)制，是擴(kuò)散和骨架溶蝕同時(shí)作用的結(jié)果；而皮芯流率比為3∶2時(shí)n=0.912，屬于骨架溶蝕機(jī)制。

3　結(jié) 論

為提高制備的納米纖維支架的功能性，建立生長(zhǎng)因子緩釋系統(tǒng)，本文通過(guò)濕法同軸靜電紡絲制備了SF/PCL-BSA皮芯結(jié)構(gòu)納米纖維支架。當(dāng)固定皮層流率為0.3 mL/h時(shí)，電壓15 k V，芯層流率0.1 mL/h和0.2 mL/h可得到形貌良好的納米纖維。TEM結(jié)果顯示，皮芯流率比分別為3∶1和3∶2制備的納米纖維其皮芯結(jié)構(gòu)明顯。不同皮芯流率比的納米纖維的釋放曲線類似，皮芯流率比為3∶2時(shí)的累積釋放量大于皮芯流率比為3∶1時(shí)的累積釋放量，皮芯流率比為3∶1時(shí)，釋放特征參數(shù)n=0.781，屬于non-fickian擴(kuò)散機(jī)制；而皮芯流率比為3∶2時(shí)n=0.912，屬于骨架溶蝕機(jī)制。

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ZHANG Hai-taoa，LUO Jing-jinga，XING Tong-haia，ZHANG Jiea，XIONG Jiea，b
（a.School of Materials and Textiles；b.Key Laboratory of Advanced Textile Materials and Manufacturing Technology，Ministry of Education，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

3D porous SF/PCL-BSA nanofibrous scaffolds were prepared by combining wet electrospinning and coaxial electrospinning，taking SF and PCL as the sheath layer and taking BASas the core layer.The morphology and structure of the scaffolds were characterized.The technological parameters were determined.Besides，the influence of different sheath-core flow rate on release property of nanofibrous scaffolds were studied.The results show that nanofibers with good surface topography and obvious sheath-core structure can be gained under the following process conditions：voltage 15k V，sheath layer flow rate 0.3 mL/h，sheath-core flow rate 3∶1 and 3∶2；nanofibers with skin-core structure can support nearly 110h BSA release；with no“sudden release”phenomenon；when sheath-core flow rate is 3∶1，nanofiber sheath layer is thick and the release is slow；release mechanism is non-fickian diffusion mechanism；when sheath-core flow rate is 3∶2，nanofiber sheath layer is thin and the release is fast and the release mechanism is skeleton corrosion mechanism.

silk fibroin；polycaprolactone；sheath-core structure；coaxial electrospinning；slow release property；nanofibrous scaffolds

TQ341.5

A

1673-3851（2015）06-0766-05

（責(zé)任編輯：張祖堯）

2015-01-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11272289）

張海濤（1989-），男，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事新纖維材料及功能性纖維材料方面的研究。

熊 杰，E-mail：jxiong@zstu.edu.cn