皮膚鱗狀細胞癌組織中Axin1和Cyclin D1 mRNA的表達

梁俊琴伊力努爾·哈力甫鄒云敏柴 莉普雄明?

皮膚鱗狀細胞癌組織中Axin1和Cyclin D1 mRNA的表達

梁俊琴1，2伊力努爾·哈力甫2鄒云敏2柴 莉2普雄明2?

目的： 檢測皮膚鱗癌組織中Axin1和Cyclin D1mRNA的表達，探討其與皮膚鱗癌發生發展的關系。方法： 采用實時定量PCR方法檢測40例皮膚鱗癌和癌旁組織及40例正常人皮膚中Axin1和Cyclin D1mRNA的表達水平。結果： 皮膚鱗癌組織中Axin1 mRNA表達＜癌旁組織＜正常皮膚組織，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA表達＞癌旁組織＞正常組織，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。皮損病理分化越差，Cyclin D1 mRNA表達量越高，Axin1 mRNA水平在皮膚鱗癌的病理分級中表達差異無統計學意義（均P＞0.05）。結論： Cyclin D1和Axin1可能在皮膚鱗癌的發生發展中起一定的作用，尤其是Cyclin D1與腫瘤分化程度相關。

皮膚鱗癌； Cyclin D1； Axin1； mRNA； 實時定量PCR

皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma CSCC）是常見的非黑素瘤性皮膚惡性腫瘤之一，具有侵襲性且易于轉移，嚴重威脅患者的身體健康與生活質量，由此產生的大量社會和醫療負擔不容忽視。其發病機制尚不清楚，近年來研究發現Wnt信號傳導通路相關因子在CSCC的發生發展中起著重要的作用。1我們采用實時熒光定量RT-PCR（Taqman probe）法檢測Wnt信號通路中負性調節因子Axin 1和下游效應分子Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌，癌旁組織和正常皮膚組織中的表達，探討其臨床意義，為皮膚鱗癌的發病機制及早期診斷提供理論依據。

1　研究對象與方法

1.1研究對象 收集本院皮膚科2012年1月至2014年6月臨床資料完整的皮膚鱗癌患者40例，經過臨床及病理活檢確診。按照組織病理分型標準，均為普通型。普通型按照Broders提出的公認四級法分為I～IV級；其中I級21例（52.50%）；II級12例（30.00%）；III級7例（17.50%）；未見IV級。其中男21例，女19例，年齡39.4～93.0歲，平均68.91±6.27歲，病程5～187個月，平均19.05±2.10個月。所有患者在近1個月未系統使用糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物，近1周未局部外用藥物治療，且無嚴重系統性疾病或伴有其他腫瘤疾病。上述患者取鱗癌腫物及癌旁組織1～2 cm。40例正常人對照組取自整形科手術切除正常皮膚，兩組年齡和性別的差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。上述手術標本切除后放置甲醛溶液固定制作石蠟切片，患者知情且簽署皮膚腫瘤擴大切除術同意書。

1.2引物、試劑及儀器 反轉錄反應試劑 Prime ScriptTMRT reagent Kit、Perfect Real Time探針法RTPCR全新預混系統Real MasterMix（Probe）、Onestep PrimeScript RT-PCR Kit（日本TaKaRa公司）、紫外線分光度儀（美國通用電氣公司）、實時定量PCR擴增儀（美國ABI公司）、熒光定量檢測試劑盒。目的基因及內參照GAPDH，RPLPO，ACTB引物由軟件Primer 5.0設計。

1.3實時定量PCR方法

1.3.1提取總RNA、合成cDNA QIAGEN試劑盒提取細胞總RNA，RNA純度及濃度均采用紫外線分光光度測定A值，純度為A260/A280=1.8～2.0，濃度為250～1367 mg/L。按cDNA合成，總RNA定量2μL，加入逆轉錄酶和隨機引物逆轉錄為cDNA，按照逆轉錄反應試劑盒說明操作。

1.3.2RT-PCR反應 實時定量PCR擴增反應，取2 μL cDNA，按照試劑盒制備反應體系，離心數秒，在PCR儀中擴增。引物特征見表1，表2。

表1　Axin 1引物特征

表2　CCND1引物特征

1.4統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，檢驗結果以ˉx±s表示，3組比較用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1Axin1 mRNA在皮膚鱗癌組織、癌旁組織及正常組織的表達皮膚鱗癌組織中Axin1 mRNA表達低于癌旁組織和正常皮膚組織，差異均有統計學意義（P值分別為0.000；0.003）。癌旁組織中Axin1 mRNA表達低于正常組織（P值為0.000），差異具有統計學意義，見表3。

表3　Axin1mRNA在皮膚鱗癌組織、癌旁組織及正常組織的表達水平

2.2Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織、癌旁組織及正常組織的表達 皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA表達高于癌旁組織和正常組織，差異均具有統計學意義（P值分別為0.000；0.000）。癌旁組織中 Axin1 mRNA表達高于正常組織，差異具有統計學意義，見表4。

表4　Cyclin D1mRNA在皮膚鱗癌組織、癌旁組織及正常組織的表達水平

2.3Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌不同病理分級的表達 Axin1 mRNA在皮膚鱗癌不同病理分級的表達差異無統計意義（P＞0.05）。Cyclin D1 mRNA在3種組織病理分級的表達差異均有統計學意義（P＜0.05），CSCC III級＞CSCC II級＞CSCC I級。病理級別越高，分化越差的皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA的表達量越高，見表5。

表5　Axin1和Cyclin D1mRNA在不同病理分級皮膚鱗癌的表達

2.4Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織及癌旁組織中表達的相關性 Axin1 mRNA在皮膚鱗癌組織中低表達，Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織中高表達。但兩者表達在皮膚鱗癌組織和癌旁組織中無相關性（rs=0.100，P=0.538；r=0.574，P=0.098），見表6。

表6　Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織及癌旁組織中表達的相關性

2.5Axin1和Cyclin D1mRNA在皮膚鱗癌組織的表達與患者年齡、病程相關性 經過Spearman秩相關分析Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌與患者年齡無關（P=0.081，P=0.710），與病程長短無關（rs= 0.053，P=0.692）

3　討論

皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma CSCC）是起源于表皮或附屬器角質形成細胞的一種惡性腫瘤，隨著器官移植患者增加，患非黑素瘤皮膚癌和鱗狀細胞癌的概率明顯增加，是正常人的40～50倍，國外曾經報道一系列的心臟移植患者27%死于皮膚癌。2近來研究表明，除了紫外線照射、人乳頭瘤病毒（HPV）感染、免疫抑制、慢性炎癥、癌基因突變等因素。3另外還與一些遺傳及表觀遺傳的因素有關，越來越多的分子信號轉導通路在皮膚惡性腫瘤中的作用受到關注。Wnt/β-catenin信號通路作為經典Wnt信號通路可將信號分子通過級聯方式，由細胞膜經過細胞質轉導至細胞核，其不僅在胚胎發育、細胞再生中起著重要作用，而且其異?；顒优c多種惡性腫瘤的發生、發展有關，特別是在鱗癌的發病機制中發揮著重要作用。4

Axin1是Wnt信號轉導通路中重要的負性調節因子，其與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-3β、結腸癌抑制因子（APC）構成的β-catenin降解復合物參與調節Wnt信號通路。5由于Axin是一種核質穿梭蛋白，調節β-catenin的核質分布，而胞質內游離的β-catenin能夠轉移至細胞核內與Wnt的靶基因結合調節細胞的增殖。國內報道Axin1在結腸癌、肝癌、神經上皮瘤和髓母細胞瘤等惡性腫瘤的錯義突變中均可降低其表達水平。6本實驗中皮膚鱗癌組織中Axin1mRNA表達量低于癌旁組織和正常皮膚組織，癌旁組織中Axin1 mRNA表達量低于正常組織。提示Axin1 mRNA表達在正常皮膚中，癌旁組織，皮膚鱗癌逐級減少，Axin1的減少或缺失可能受到腫瘤發生中其他信號通路的調控，也可能是Axin1本身發生突變細胞激活或抑制通路中下游靶基因的轉錄，改變了信號通路導致皮膚鱗癌的發生發展。De Robertis等7發現在檢測出β-catenin異常增高的肝癌或直腸癌細胞中表達野生型的Axin會引發腫瘤細胞凋亡，從而暗示Axin作為癌癥治療靶點的潛在可能性。

Cyclin D作為細胞周期素中重要成員之一，與多種惡性腫瘤的遺傳易感性有關，同時Cyclin D作為Wnt信號通路下游效應分子，可以通過與細胞周期素依賴性激酶結合而促進視網膜母細胞瘤基因（retinoblastoma gene Rb gene）的磷酸化，減少了細胞對外源性有絲分裂的依賴性，加速細胞增殖，也可以直接作用惡性腫瘤的轉錄過程中。8D型周期蛋白分為3個亞型：Cyclin Dl、Cyclin D2、Cyclin D3。Cyclin D1蛋白在腫瘤細胞周期起正向調控作用，該蛋白編碼的基因是CCNDl基因，該基因位于1 lq13染色體。Cyclin D1作為G1期細胞周期素，是細胞周期中最重要的調控點，也是決定細胞周期的時間即G1向S期轉換中起重要作用。Cyclin Dl主要調節細胞從細胞周期G1期向S期的轉變以促進細胞增殖，當Cyclin Dl基因的擴增、染色體易位及Cyclin Dl基因多態性的發生時，其蛋白過度表達與惡性腫瘤的發生、侵襲、轉移與復發等密切相關。9在本實驗研究中發現Cyclin D1 mRNA在正常皮膚組織中、癌旁組織及皮膚鱗癌組織相對表達量逐漸增加。皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA表達量明顯高于癌旁組織和正常皮膚組織，癌旁組織中Cyclin D1 mRNA表達量也高于正常組織。Axin1mRNA在皮膚鱗癌組織中呈低表達，在正常組織中高表達；Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織中呈高表達，在正常組織中呈低表達。兩者表達在皮膚鱗癌組織和癌旁組織中無相關性，但此結果尚不能完全排除Axin1和Cyclin D1在Wnt信號轉導通路中相互作用參與皮膚鱗癌的發生。Cyclin D1與Axin1在皮膚鱗癌的發展及腫瘤細胞的惡化中是否具有協同作用需要進一步研究證實。

本實驗研究結果顯示Axin1的表達與患者年齡，性別無關，本實驗中顯示Axin1 mRNA在皮膚鱗癌的低表達與鱗癌組織病理分級無關。而Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌的高表達與鱗癌組織的病理分級有關，分化越高皮膚鱗癌的Cyclin D1 mRNA的表達量相對越高，提示Cyclin D1可能參與了皮膚鱗癌發生發展的過程。本實驗研究結論與Cyclin D1在其他組織的鱗癌表達情況一致。有證據顯示Cyclin D1的過度表達常引起惡性腫瘤侵襲轉移的能力增強，其表達不僅與復發有關，還與病變演進有關。

綜上所述，皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA的高表達或過表達與Axin1低表達或表達缺失提示Axin 1和Cyclin D1在皮膚鱗癌的發生發展中可能起一定的作用。兩者可能為皮膚鱗癌的早期診療和預后判斷提供參考具有重要的臨床指導意義，然而Axin 1和Cyclin D1在皮膚鱗癌中的確切作用機制需要進一步探索研究。本研究為今后有關Wnt信號通路是否通過調節Axin 1和Cyclin D1而作用于皮膚鱗癌提供部分理論依據。

1趙辨.中國臨床皮膚病學.南京：江蘇科學技術出版社，2009. 1527-1529.

2劉柯，錢麗庭，陳珂.HPV、p16及p53與頭頸部腫瘤患者的預后分析.中華放射腫瘤學雜志，2014，23（02）：112-113.

3張衛民，高巖.Wnt信號轉導通路組成蛋白與口腔鱗狀細胞癌的分化和增殖.中華口腔醫學雜志，2005，40：491-494.

4王凱，李建遠.Wnt/β-catenin信號通路與發育和疾病研究進展.中國創新醫學，2012，9（11）：17-19.

5Nikuseva Marti?T，Pe?ina-Slaus N，Kusec V，et al.Changes of AXIN-1 and beta-catenin in neuroepithelial brain tumors. Pathol Oncol Res，2010，16（1）：75-79.

6 FangWQ，ChenWW，Fu AK，etal.Axin directs the amplification and differentiation of intermediate progenitors in the developing cerebral cortex.Neuron，2013，79（4）：665-679.

7 De Robertis A，Mennillo F，RossiM.Human sarcoma growth is sensitive to small-molecule mediated Axin stabilization.PLoS One，2014，9（5）：e97847.

8李峰，陳臨溪.細胞周期蛋白D與細胞周期調控研究進展.國外醫學·生理、病理科學與臨床分冊，2005，25（3）：270-273.

9Shen Y，Xu J，Jin J，et al.Cyclin D1 expression in Bowen's disease and cutaneous squamous cell carcinoma.Clin Oncol，2014，2（4）：545-548.

（收稿：2015-04-20 修回：2015-06-14）

·病例報告·

Expressions of Axin1 and Cyclin D1 m RNA in cutaneous squamous cell carcinom a

LIANG Jun-qin，YI Li-nuer，ZHOU Yun-min，et al.Xinjiang medical university 830011；Xinjiang Uygur AutonomousRegion People's Hospital the Dermatology Department，830011

Objective：To detect the expressions of Axin1 and Cyclin D1 mRNA in cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）in order to determine the relationship with the development of CSCC.M ethods：The levels of Axin1 and Cyclin D1mRNA in 40 samples of CSCC，adjacent skin of the CSCC lesions and 40 normal control skin sampleswere detected by real-time quantitative polymerase chain reaction（PCR）.Results：The level of Axin1mRNA in lesions，adjacentskin and normal skin was reduced in a declined order，with significant differences（P＜0.05）and the level of Cyclin D1 mRNA was increased in turn（P＜0.05）.The less differentiated the CSCC was，the higher level of Cyclin D1 mRNA among different pathological grades（P＜0.05），but there was no significant difference in the level of Axin1mRNA among different pathological grades（P＞0.05）.Conclusion：Axin1 and Cyclin D1 in CSCC may play an important role in the development of CSCC，especially Cyclin D1.

cutaneous squamous cell carcinoma；Cyclin D1；Axin1；mRNA；RT-PCR

新疆維吾爾自治區自然科學基金（編號：2015211C191）

1新疆醫科大學，830011

2新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚性病科，830011