Tim-3對(duì)B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

呂雅琳周曉偉，2胡 彬曾學(xué)思劉 毅，2*孫建方，2*

Tim-3對(duì)B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

呂雅琳1周曉偉1，2胡 彬1曾學(xué)思1劉 毅1，2*孫建方1，2*

目的： 明確T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3（Tim-3）對(duì)B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。方法： 構(gòu)建Tim-3真核表達(dá)載體后，CCK-8法檢測(cè)Tim-3融合蛋白對(duì)B16F10共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。結(jié)果： Tim-3融合蛋白轉(zhuǎn)染組淋巴細(xì)胞增殖活力低于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論： Tim-3融合蛋白抑制B16F10共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白； 真核表達(dá)； 小鼠

Tim-3屬于T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白（T cell immunoglobulin and mucin domain，Tim）家族，該基因家族由McIntire等于2001年發(fā)現(xiàn)，1位于鼠11號(hào)染色體上，編碼一類具有共同基序的跨膜糖蛋白，基本結(jié)構(gòu)包括一個(gè)信號(hào)肽、免疫球蛋白區(qū)、黏蛋白區(qū)、跨膜區(qū)和有磷酸化位點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)區(qū)2。小鼠Tim-3基因編碼含有281個(gè)氨基酸的I型膜蛋白，其蛋白分子的細(xì)胞外區(qū)含有1個(gè)免疫球蛋白V區(qū)，1個(gè)富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的黏蛋白區(qū)。小鼠Tim-3有膜結(jié)合型Tim-3（full-length membrane-anchored form of Tim-3，flTim -3）和可溶型Tim-3（soluble form of Tim-3，sTim-3）兩種形式。flTim-3含有信號(hào)肽、免疫球蛋白V區(qū)、黏蛋白區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。sTim-3僅含有信號(hào)肽、免疫球蛋白V區(qū)和胞漿區(qū)。Tim-3被認(rèn)為特異性表達(dá)于CD4+Th1和CD8+Tc1細(xì)胞，3凝集素家族中β-半乳糖苷結(jié)合凝集素-9（galectin-9）是Tim-3的主要配體，在組織內(nèi)分布廣泛，二者結(jié)合后，給T細(xì)胞提供了一種負(fù)性共刺激信號(hào)，下調(diào)免疫反應(yīng)，抑制Th1介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)和同種免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受。4，5越來越多的研究證明，Tim-3表達(dá)于多種腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞，在多細(xì)胞水平上參與腫瘤免疫。本研究構(gòu)建小鼠Tim-3基因真核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)，探討Tim-3融合蛋白對(duì)與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。為今后探索Tim-3在黑素瘤免疫治療中的作用提供研究基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料 pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體購(gòu)自南京海普樂生物科技有限公司；PMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自大連TAKARA公司；轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，并在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保藏。DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自Life公司；Trizol Rea-gent購(gòu)自Invitrogen公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore新增試劑公司；PCR試劑盒、ECL曝光底物、CCK-8 Cell Counting Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物有限公司；DNA Marker、蛋白質(zhì)預(yù)染Marker購(gòu)自TAKARA公司；PM Western Midview Marker購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物有限公司；EndoFree Plasmid Maxi Kit購(gòu)自Qiagen公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；PHA購(gòu)自Sigma公司；絲裂霉素購(gòu)自江蘇泰諾源生物技術(shù)有限公司。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 美國(guó)Thermo Scientific公司的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)、醫(yī)用超低溫冷凍箱；蘇州凈化儀器廠的SW-CT-TF型超凈工作臺(tái)；美國(guó)Bio-Rad公司的PCR儀、凝膠成像及分析裝置、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)微型轉(zhuǎn)膜儀；OLYMPUS公司的FV1000激光共聚焦顯微鏡；美國(guó)Millipore公司的超純水儀；中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司的電熱恒溫水槽；中國(guó)寧波格蘭特制冷設(shè)備制造有限公司制冰機(jī)；美國(guó)Beckman公司DU640核酸蛋白定量分析儀。

1.3真核表達(dá)載體克隆策略的設(shè)計(jì) EcoR I--Kozak sequence--ATG--Signal Peptide-Tim-3-TEV protease cleavage site-GFP-6xHis--stop codon--BamH I

1.3.1小鼠Tim-3胞外域預(yù)測(cè)及引物的設(shè)計(jì)與合成

在線檢索Tim-3蛋白質(zhì)氨基酸序列及開放讀碼框ORF，并通過BLAST比對(duì)由ORF得到的氨基酸序列和核酸序列。通過TMPRED預(yù)測(cè)Tim-3可能的跨膜區(qū)域，同時(shí)參照Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果確定Tim -3胞外域。根據(jù)其胞外域結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的 ORF用Primer premier5設(shè)計(jì)引物，并在NCBI上驗(yàn)證，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3.2小鼠Tim3基因合成及真核表達(dá)載體的構(gòu)建、驗(yàn)證 在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)從小鼠組織中RT-PCR直接獲得的原始序列構(gòu)建到載體上的表達(dá)量很低，后分析發(fā)現(xiàn)從組織中獲得的原始序列有7個(gè)稀有密碼子，影響小鼠Tim-3的體外表達(dá)，所以優(yōu)化基因表達(dá)序列，并送至上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成的序列先連接到PMD18-T載體上，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞保藏在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮研所江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。將目的序列從PMD18-T-Tim3-EGFP重組質(zhì)粒上切下之后，連接到pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體上，酶切驗(yàn)證并測(cè)序比對(duì)。pcDNA3.1（+）-Tim3-EGFP導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞保藏，并用Qiagen公司的EndoFree Plasmid Maxi Kit大量抽提，驗(yàn)證低內(nèi)毒素后定量至1μg/μL備用。

293T細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，將狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用完全培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按1×106細(xì)胞/孔的濃度接種2 mL培養(yǎng)皿，混勻后于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。將5μL濃度為1μg/μL的pcDNA3.1（+）-Tim3-EGFP質(zhì)粒和等量的pcDNA3.1（+）空載體質(zhì)粒分別與LipofectamineTM2000混勻后各自轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（每組各3個(gè)重復(fù)），轉(zhuǎn)染程序按LipofectamineTM2000操作說明進(jìn)行；于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后，分離上清及細(xì)胞，上清進(jìn)行Western blot檢測(cè)，細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦觀察。

1.4Western blot及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)小鼠Tim -3融合蛋白的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后的上清進(jìn)行蛋白印跡檢測(cè)［轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）組只收集72 h時(shí)的上清］。將25μL樣品上樣SDSPAGE蛋白膠，300 mA 1 h轉(zhuǎn)印后5%牛奶封閉2 h，1∶1000鼠抗His單抗室溫孵育2 h，1∶1000山羊抗鼠二抗室溫孵育2 h，ECL曝光。

將轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后的細(xì)胞分別在激光共聚焦顯微鏡下觀察Tim-3融合蛋白表達(dá)情況。分6組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-Tim3-EGFP重組質(zhì)粒24 h、48 h、72 h的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒24 h、48 h、72 h的細(xì)胞。

1.5小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞與C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng) 斷頸處死C57BL/6小鼠，取脾臟，參照小鼠淋巴細(xì)胞分離液操作說明提取脾淋巴細(xì)胞，將提取的脾淋巴細(xì)胞按照2×106/mL濃度接種于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入10μg/m L的PHA，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)過程中進(jìn)行B1610細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)，用終濃度25μg/mL的絲裂霉素處理B16F10細(xì)胞，完全洗凈絲裂霉素后與前述體外培養(yǎng)5 d后的脾淋巴細(xì)胞于96孔板共培養(yǎng)：B16F10細(xì)胞每孔終濃度2×105/mL，脾淋巴細(xì)胞每孔終濃度2×106/mL。

1.6CCK-8法檢測(cè) Tim3-EGFP融合蛋白對(duì)與B16F10共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 在上述B16F10與脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中分別加入轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清，并進(jìn)行分組。空白組：絲裂霉素處理的B16F10細(xì)胞、293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清空，空白對(duì)照組：絲裂霉素處理的B16F10細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞、293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清。陰性對(duì)照組：絲裂霉素處理的B16F10細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清。Tim-3融合蛋白組：絲裂霉素處理的B16F10細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清。

每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基或者上清調(diào)整每孔最終總體積為100μL，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24 h和48 h參照CCK-8 Cell Counting Kit操作說明檢測(cè)450 nm的OD值并進(jìn)行結(jié)果分析：

細(xì)胞活力%=（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值-空白組OD值）/（空白對(duì)照組細(xì)胞OD值-空白組OD值）×100%

48 h淋巴細(xì)胞相對(duì)24 h增殖倍數(shù)=（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞48 h OD值-空白組OD值）/（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24 h OD值-空白組OD值）

圖1　pcDNA3.1（+）-Tim3-EGFP重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖 圖2 酶切驗(yàn)證pcDNA 3.1（+）-Tim3-EGFP重組質(zhì)粒 1：pcDNA3.1（+）-Tim3-EGFP；2：marker

2　結(jié)果

2.1Tim-3胞外域序列及引物 小鼠Tim-3蛋白包含281個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其中1-19位為信號(hào)肽，20-193為胞外域，194-214位為跨膜區(qū)。根據(jù)克隆策略設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增優(yōu)化后的Tim3-EGFP融合蛋白的核酸序列，上游引物（包含BamHI酶切位點(diǎn)）5'-GAATTCGCCGCCACCATG-3'，下游引物（包含EcoRI酶切位點(diǎn)）5'-GGATCCTCAATGATGATG-3'。

2.2Tim-3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證 將含1359 bp的目的片段連接至 pcDNA3.1（+）載體上，得到pcDNA3.1（+）-Tim3-EGFP重組質(zhì)粒（圖1），對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖2），得到1500 bp左右的片段，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與目標(biāo)序列一致。

按照Qiagen公司的EndoFree Plasmid Maxi Kit說明書，大量抽提E.coli DH5中的pcDNA3.1（+）-Tim3 -EGFP重組質(zhì)粒和pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒，并在熒光分度儀測(cè)得質(zhì)粒濃度，最終定量1μg/μL。

2.3蛋白印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染Tim3-EGFP細(xì)胞的表達(dá)

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24 h、48 h、72 h的3組細(xì)胞，分別收集上清，上清處理后Western-blot分析（圖3），在小于60 kDa處有目的蛋白，與預(yù)計(jì)50 kDa大小相符。

圖3　Western-blot分析Tim3-EGFP重組蛋白

2.4激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)Tim3-EGFP蛋白表達(dá)激光共聚焦觀察細(xì)胞顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-Tim3-EGFP 24 h、48 h、72 h的細(xì)胞均表達(dá)融合蛋白，并且轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞EGFP的表達(dá)量最多，熒光最強(qiáng)（圖4）。

2.5小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞與C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng) 光鏡觀察體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸出現(xiàn)集落性增殖，部分細(xì)胞體積增大、胞漿豐富（圖5）。

光鏡觀察與絲裂霉素處理B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，部分脾淋巴細(xì)胞體積增大、胞漿豐富，并出現(xiàn)向B16F10細(xì)胞聚集的現(xiàn)象（圖6）。

Tim-3融合蛋白對(duì)與B16F10共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響24 h、48 h時(shí)Tim-3融合蛋白組淋巴細(xì)胞活力低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

表1　CCK-8法檢測(cè)24 h和48 h各組淋巴細(xì)胞活力%（ˉx±s）

Tim-3融合蛋白組48 h相對(duì)24 h淋巴細(xì)胞增殖倍數(shù)與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比無顯著性差異（P＜0.05）。見表2。

表2　CCK-8法檢測(cè)各組48 h相對(duì)24 h淋巴細(xì)胞增殖倍數(shù) （ˉx±s）

圖4　激光共聚焦觀察小鼠Tim3-EGFP的蛋白表達(dá)（×100）

圖5　脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)5 d（×100）

圖6　B16F10細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)24 h（×100）

3　討論

Tim-3最先被發(fā)現(xiàn)其表達(dá)于終末分化的Thl細(xì)胞上，是區(qū)分Thl和Th2細(xì)胞的表面標(biāo)志。近年來研究表明Tim-3還表達(dá)于Th17細(xì)胞、Treg、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞。6，7以往Tim-3病理生理學(xué)意義研究主要集中在以HIV為代表的病毒感染性疾病和以多發(fā)性硬化為代表的自身免疫性疾病，8與腫瘤的相關(guān)性研究不多。現(xiàn)在越來越多的研究證明，Tim-3表達(dá)于多種腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞因子分泌起著重要的調(diào)節(jié)作用，從而在多細(xì)胞水平上參與腫瘤免疫：與T細(xì)胞功能耗竭有關(guān)，參與腫瘤免疫中T細(xì)胞應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控；促進(jìn)髓系來源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的擴(kuò)增，使腫瘤發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤發(fā)展；也可能促進(jìn)DC的成熟和激活NK細(xì)胞增強(qiáng)腫瘤免疫應(yīng)答。新近發(fā)現(xiàn)：在晚期惡性黑素瘤患者體內(nèi)，部分PD-1+NY-ESO-1-特異性CD8+T細(xì)胞上Tim-3顯著上調(diào)，并且Tim-3+PD-1+NY-ESO-1-特異性CD8+T細(xì)胞的功能顯著低于Tim-3-PD-1+和Tim-3-PD-1-者，提示Tim-3與黑素瘤患者的CTL功能耗竭密切相關(guān)。9并且，應(yīng)用抗Tim-3封閉性單抗阻斷該通路后其細(xì)胞分泌和增殖功能顯著增強(qiáng)。此外，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的膜型Tim-3還參與黑素瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。10深入研究Tim-3在黑素瘤腫瘤免疫中的作用，為黑素瘤的免疫治療提供新的靶點(diǎn)具有重要意義。

本研究成功構(gòu)建小鼠Tim-3真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，經(jīng)Western blot和激光共聚焦檢測(cè)到Tim-3融合蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清蛋白含量高于24 h和72 h，所以選用轉(zhuǎn)染48 h后上清進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。CCK-8法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況顯示：Tim-3融合蛋白對(duì)與B16F10共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖起抑制作用。

我們課題組一直致力于黑素瘤免疫治療方面的研究，并取得一定成果，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了小鼠Tim-3基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-Tim-3-EGFP并表達(dá)，初步探討Tim-3融合蛋白對(duì)與B16F10共培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步研究Tim -3在黑素瘤免疫治療中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿：2015-03-04 修回：2015-06-03）

Effect of Tim-3 on the proliferation ofm ouse sp lenic lym phocytes co-cultured w ith B16F10

LV Ya-lin，ZHOU Xiao-wei，HU Bin，et al.Institute of Dermatology，CAMS and PUMC，Nanjing，210042

Objective：To determine the effect of T cell immunoglobulinmucin 3（Tim-3）on the proliferation ofmouse splenic lymphocytes co-cultured with B16F10 cells.M ethods：After eukaryotic expression vector was constructed successfully，the proliferation of splenic lymphocytes co-cultured with B16F10 cells was detected by Cell Counting Kit-8（CCK-8）method.Results：The proliferation activity of splenic lymphocytes co-cultured with B16F10 cells was lower in the trans-infection group than in the non-trans-infection and mock-vehicle groups（P＜0.05）.Conclusion：Tim-3 can inhibite the proliferation of splenic lymphocytes co -cultured with B16F10 cells.

T cell immunoglobulin and mucin domain 3；eukaryotic expression；mouse

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81171513）

江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：BK20131063）

江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：BK2012507）

2012高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號(hào)：20121106110040）

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院，南京，210042

2江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京，210042