一例豬瘟、高致病性豬藍耳病、豬偽狂犬病混合感染的實驗室診斷

蔡雨函，周遠成，艾 能，李 碧，潘 夢

（四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都 610299）

一例豬瘟、高致病性豬藍耳病、豬偽狂犬病混合感染的實驗室診斷

蔡雨函，周遠成*，艾 能，李 碧，潘 夢

（四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都 610299）

對南充市某豬場的一起疫情進行確診，采集病死仔豬的病料進行實驗室檢查。PCR結果顯示豬瘟病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬偽狂犬病毒均為陽性。試驗結果表明，該豬場疫情是由CSFV、PRRSV和PRV混合感染所致。

豬瘟；高致病性豬藍耳病；豬偽狂犬病；混合感染

2015年3月中旬，南充市某小規模豬場仔豬發生了以高熱、食欲廢絕、皮膚發紅、腹瀉、后軀麻痹、有個別呼吸困難為主要特征的傳染病。解剖后觀察可見腦膜明顯充血、水腫，腦脊髓液增多；全身淋巴結腫大、出血，呈大理石狀；腎臟呈土黃色、有點狀出血；喉頭、氣管和支氣管有黏液性泡沫并充血；肝臟、脾臟有壞死灶；回盲口見一個個輪層狀潰瘍。查看該群仔豬的免疫記錄： 30日齡、60日齡時各免疫注射1次豬瘟疫苗， 45～60日齡接種豬丹毒與豬肺疫二聯疫苗、鏈球菌疫苗。母豬空懷期注射過豬瘟疫苗、鏈球菌疫苗， 但沒有注射豬偽狂犬病和豬藍耳病疫苗。該場發病后使用抗生素治療，均無效果。實驗室診斷確診為豬瘟（CSFV）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬偽狂犬病毒（PRV）混合感染，現報告如下，以期為今后豬病的診斷和防控提供參考。

1　材料與方法

1.1病料采集

無菌采集死亡仔豬的頜下淋巴結、脾臟、肺臟、扁桃體、腦等組織。

1.2試驗試劑

2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000購自北京天根生化科技有限公司；TaKaRa RNAiso Plus、PrimeScript RT Kit、2×GC buffer、 dNTP、Mg2+、rap 酶購自大連寶生物工程有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.3引物設計

根據GenBank中CSFV和PRV的核酸序列分別設計引物，其中CSFV陽性擴增片段為270 bp，PRV陽性擴增片段為192 bp。參照周丹（2012）建立的鑒別診斷PRRSV普通株與變異株RT-PCR方法，區分是經典PRRSV感染還是高致病性PRRSV感染（豬藍耳病病毒普通株擴增片段為267 bp，變異株擴增片段為180 bp）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（見表1）。

1.4細菌學檢測

1.4.1觸片鏡檢 將無菌采集的病料觸片后革蘭氏染色鏡檢。

1.4.2分離培養 將無菌采集的病料接種于普通營養瓊脂平板于37 ℃恒溫箱中培養24 h后，觀察菌落生長情況。

1.5核酸提取

1.5.1總DNA的提取

取適量病變肺臟和腦組織置于研缽中，加入3～5倍體積的磷酸緩沖液（PBS）研磨成勻漿，-20 ℃反復凍融3次，取200 μL懸液加入蛋白酶K（終濃度為200 μg/mL），56 ℃水浴30 min；再加入等體積的Tris平衡酚，反復顛倒混勻；室溫 12 000 r/ min 離心10 min；吸取上清轉移到新的離心管中，加入苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25∶24∶1的混合液重復上述抽提步驟；轉移上清到新的離心管中，加入氯仿/異戊醇體積比為24∶1的混合液重復上述抽提步驟；向最后獲得的上清液中加入2倍體積的無水乙醇沉淀 DNA，室溫12 000 r/min離心10 min，再用 500 μL 700 mL/L乙醇洗滌1次；輕輕棄去無水乙醇，自然風干，溶解于20 μL TE中，-20 ℃保存備用。

1.5.2總RNA的提取與cDNA的合成

取適量的頜下淋巴結、脾臟、肺臟、扁桃體放入勻漿器里，加入1 mL TRIZOL裂解液進行勻漿，勻漿充分后室溫靜置5 min，l2 000 r/min，離心5 min；取上清液，加入200 mL氯仿 （迅速振蕩），室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心 15 min；向最后獲得的上清液中加入等量異丙醇沉淀RNA，輕輕搖晃混勻，室溫作用10 min后，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加1mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min離心5 min，輕輕棄去無水乙醇，自然風干，溶解于20 μL 無Rnase水中，-20 ℃保存備用。按照寶生物工程（大連）有限公司RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，將反轉錄產物于-20 ℃保存備用。

1.6豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測

反應體系為：引物稀釋濃度為20 μmol/L，Primer Mix 1.5μl（P1∶P2∶P3=1∶1∶2），2×Mix 12.5 μL，cDNA 3 μL，加ddH2O至25 μL，反應條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，最后72 ℃再延伸10 min。同時設立陰性對照，PCR 產物用 10 g/L瓊脂糖凝膠進行鑒定。

1.7豬瘟病毒檢測

利用套式PCR技術檢測CSFV，其中第一輪PCR反應體系為：P4、P5（10 μmol/L）各 0.5 μL，2×Mix 12.5 μL，cDNA 2.5 μL， 加ddH2O至25 μL。第二輪PCR反應體系為：P6、P7（10 μmol/L）各 0.5 μL，2×Mix 12.5 μL，第1輪PCR產物1 μL，加ddH2O至25 μL。反應條件均為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環，最后72 ℃再延伸10 min。同時設立陰性對照，PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行鑒定。

1.8豬偽狂犬病毒檢測

采用25 μL體系進行PCR 反應， 其 中P8、P9（20 μmol/L） 各0.5 μL，2×GC buffer 12.5μl，dNTP 4μl， Mg2+1.5μl， rap 酶0.5μl， ddH2O 4.5 μL，DNA 1 μL。反應條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，最后72 ℃再延伸10 min。同時設立陰性對照，PCR 產物用 10 g/L瓊脂糖凝膠進行鑒定。

2　結果

2.1細菌分離

觸片鏡檢未見細菌，分離培養后無菌落生長，表明該豬場疫病不是由細菌感染所致。

2.2豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測

電泳結果（見圖1）顯示從病料中擴增出180 bp的電泳條帶，表明為高致病性PRRSV感染陽性。

2.3豬瘟病毒檢測

電泳結果（見圖2）顯示從病料中擴增出270 bp的電泳條帶，表明為豬瘟病毒感染陽性。

2.4豬偽狂犬病毒檢測

電泳結果（見圖3）顯示從病料中擴增出192 bp的電泳條帶，表明為豬偽狂犬病毒感染陽性。

3　討論

根據實驗室檢查結果，病豬體內未分離出任何細菌，即排除了由細菌感染所致；CSFV、PRRSV RT-PCR和PRV PCR檢測結果均為陽性，且結果顯示PRRSV為PRRSV變異毒株，因此本次疫病確診為豬瘟、高致病性豬藍耳病和豬偽狂犬病混合感染。本次疫情可能主要是由于該豬場沒有免疫豬偽狂犬病和豬藍耳病疫苗導致豬群患病，而豬偽狂犬病和豬藍耳病通過破壞機體免疫系統會干擾豬瘟抗體產生，使豬瘟抗體水平大幅下降， 從而使豬群亦受到豬瘟病毒感染。因此，在做好豬瘟防疫工作的同時更要高度重視豬偽狂犬病和豬藍耳病的防疫工作。

圖1　PRRSV檢測結果

圖2　CSFV檢測結果

圖3　PRV檢測結果

豬瘟、豬偽狂犬病是當前困擾我國豬場的主要病毒性疫病，管理不好的豬場豬藍耳病也會長期存在，使癥狀往往由典型轉為慢性經過，給治療帶來很大難度。因此，平時要堅持做好基礎免疫工作，提高抗體水平。搞好豬舍的環境衛生工作，做好保溫和通風換氣工作，適當降低保育豬的飼養密度，保證飼料營養的充足和均衡，給豬創造一個良好的營養和生長環境。疫情發生并確診后立即向上級獸醫部門匯報，制定緊急防疫措施；及時隔離發病豬，嚴格觀察可疑豬，對死亡病豬進行無害化處理以防病原傳播，對豬場進行全面消毒處理，控制細菌繼發感染；同時加強豬群的疫苗免疫，并使用干擾素和抗病毒藥物進行治療。發病后及時隔離治療病豬、果斷淘汰帶毒豬是凈化豬群、控制持續感染的關鍵措施。

隨著養豬業規?；图s化發展，近些年發生的豬傳染病，大多為多種因素導致多種病菌并發、繼發或混合感染，其中病原體的混合感染既有細菌+細菌，也有病毒+病毒和細菌+病毒，并造成一些豬傳染病以非典型或綜合征的形式出現，使豬病的診斷和防治的難度增加，給養殖業造成較大影響，嚴重影響了養殖業的發展。針對目前規?；i場疫病的復雜局面，要樹立保健和預防觀念，采取合理的免疫程序，建立完善的預防方案。同時對患豬制定科學的用藥方案，正確配伍，協同用藥，辨證施治，綜合治療。

2015-07-21）

蔡雨函（1990-），女，四川南充人。

周遠成，博士，主要從事動物傳染病病原分子生物學研究，E-mail：abtczyc@163.com