超聲微波協同萃取法提取菊苣酸條件研究

王英超，王蕾，金紅，*，李秋闖，楊孝麗

（1.天津農學院基礎科學學院，天津300384；2.天津農學院農學與資源環境學院，天津300384）

超聲微波協同萃取法提取菊苣酸條件研究

王英超1，王蕾2，金紅2，*，李秋闖2，楊孝麗2

（1.天津農學院基礎科學學院，天津300384；2.天津農學院農學與資源環境學院，天津300384）

利用超聲微波協同萃取對紫錐菊中菊苣酸最佳提取條件進行研究。采用新鮮的紫錐菊根部，考察乙醇濃度、微波提取時間、微波提取功率、料液比等因素對紫錐菊中菊苣酸提取含量的影響，并采用正交試驗優化提取條件。結果表明：濃度為50%乙醇、料液比1∶25 g/mL、微波提取時間660 s、微波提取功率300 W和提取次數為1次為最佳提取條件。在最佳提取條件下進行了3組平行驗證試驗，得到菊苣酸平均含量為158.4 μg/g。

紫錐菊；菊苣酸；超聲微波協同萃取

紫錐菊（Echinacea purpurea）是原產于美洲的一類菊科野生花卉，也稱“松果菊”［1］。全株具有很高的藥用價值和觀賞價值［2］。我國于20世紀70年代開始引入，已在北京、南京、上海等地引種成功。盡管引種時間短，但各行業對其的研究進展均較快［3］。菊苣酸是紫錐菊中極為重要的免疫活性成分之一，具有增強免疫功能和抗炎作用，并能抑制透明質酸酶，保護膠原蛋白免受可導致降解的自由基的影響［4］。菊苣酸的提取方法主要有：超聲波法、聚酰胺法、相轉移萃取法、正交實驗法［5-8］。目前還沒有利用超聲-微波協同萃取紫錐菊中菊苣酸的研究報道。本工作以天津地區栽植的一年生紫錐菊植株為研究對象，通過超聲微波協同萃取法萃取其中的有效成分—菊苣酸，并利用高效液相色譜法進行含量測定，為菊苣酸的提取方式提供新依據，也為天津地區藥企栽植利用紫錐菊提供參考。

1材料與方法

1.1材料

紫錐菊：采自天津農學院基礎科學學院生化實驗室，常規肥水管理及病蟲害防治，待生長至收獲期，選取生長大小一致，無病害的紫錐菊根部作為試驗材料。使用前對根部進行清洗備用。

1.2試劑

無水乙醇（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；0.1%冰醋酸（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：天津市江天化工技術有限公司；菊苣酸標準品（純度＞98%）：北京百靈威科技有限公司。

1.3儀器與設備

1200 Series Agilent高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；FA-2004電子天平：上海方瑞儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀：美國密理博（中國）有限公司；CW-200超聲-微波協同萃取儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；Haier BCD-241WE/Y冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.4方法

1.4.1不同乙醇濃度對菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按料液比1∶25 g/mL的比例，分別加入20%乙醇、35%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、80%乙醇、無水乙醇于各個萃取瓶中進行提取。程序如下：超聲90 s，無微波功率；關掉超聲，微波300 s、功率300 W。待反應結束后，過濾，濾液于4℃條件下12 000 r/min離心10 min。上清液過0.45 μm有機濾膜，濾出液作為高效液相色譜儀進樣樣品使用。以菊苣酸的含量（μg/g）為評價指標，探討不同乙醇濃度對提取菊苣酸含量的影響。

菊苣酸的含量（μg/g）=樣品中菊苣酸的含量（μg/ mL）×提取液總體積（mL）÷取樣量（g）

1.4.2不同的料液比對提取菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按不同料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）加入不同體積的50%乙醇于各個萃取瓶中進行提取。程序如下：超聲90 s，無微波功率；關掉超聲，微波300 s、功率300 W。后續操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的料液比對提取菊苣酸含量的影響。

1.4.3不同的微波萃取時間對提取菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于各個萃取瓶中進行不同微波時間提取。程序如下：（1）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波180s、功率300 W。（2）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波300 s、功率300 W。（3）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波420 s、功率300 W。（4）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波540 s、功率300 W。（5）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波660 s、功率300 W。后續操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的微波提取時間對提取菊苣酸含量的影響。

1.4.4不同的微波功率對提取菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于各個萃取瓶中進行不同微波功率（200、300、400、500、600 W）的提取。程序如下：（1）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波540 s、功率200 W。（2）超聲90s、無微波功率；關掉超聲，微波540s、功率300 W。（3）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波540 s、功率400 W。（4）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波540 s、功率500 W。（5）超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波540 s、功率600 W。后續操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的微波功率對提取菊苣酸含量的影響。

1.4.5不同的提取次數對提取菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于萃取瓶中進行不同次數的提取。反應程序如下：超聲90 s、無微波功率；關掉超聲，微波540 s、功率300 W。提取一次后，將濾后的紫錐菊根吸干表面液體，繼續按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL再次進行提取并重復上述過程。每次提取結束后均將濾液4℃下，12 000 r/min離心10 min。后續操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的提取次數對提取菊苣酸含量的影響。

1.4.6高效液相色譜條件［9］

分離柱：XDB-C18（4.6×50 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈：0.1%冰醋酸=25∶75（體積比）；流動相速度：0.2 mL/min；檢測器：紫外檢測器，波長330 nm；柱溫：40℃；進樣體積：5 μL。

1.4.7菊苣酸標準曲線的制作

將1 mg/mL的菊苣酸標準品稀釋成不同濃度，樣品濃度為0.5、2.5、25、50、100 μg/mL。按照其上述色譜條件進行試驗，以峰面積為縱坐標，菊苣酸的濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.4.8正交試驗

以單因素試驗為基礎，選擇微波功率、時間和料液比三因素，進行三因素三水平正交試驗設計。具體設計見表1。

表1　三因素三水平正交試驗設計Table 1The design of three factors and three levels of orthogonal test

1.4.9數據統計分析

采用Excel軟件進行數據分析。

2結果與分析

2.1菊苣酸標準曲線及標準品高效液相色譜圖

菊苣酸標準曲線及標準品高效液相色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1　菊苣酸標準曲線Fig.1The standard curve of cichoric acid

圖2　菊苣酸標準品高效液相色譜圖Fig.2HPLC chromatogram of cichoric acid

菊苣酸標準曲線圖見圖1，從圖1可以看出，菊苣酸標準曲線方程：y=20.13x-28.359，R2=0.990 7，式中：y為峰面積，（mAU·s）；x為菊苣酸濃度，（μg/mL），可以看出方程線性關系明顯。圖2為菊苣酸標準品的高效液相色譜圖。從圖2可以看出，菊苣酸的出峰時間在3.524 min。

2.2不同乙醇濃度對提取菊苣酸含量的影響

不同乙醇濃度對菊苣酸提取含量的影響結果如圖3所示。

圖3　不同乙醇濃度對菊苣酸提取含量的影響Fig.3Effect of different concentration of ethanol on the content of cichoric acid extraction

從圖3中可以看出，隨著乙醇濃度的增加，菊苣酸的含量逐漸增大，當乙醇濃度為50%時，菊苣酸含量達到最大值229.8 μg/g。當乙醇濃度高于50%時，菊苣酸含量逐漸遞減，最低值為12 μg/g。這可能與微波加熱的機理有關，提高乙醇濃度可以增加提取劑對物料的滲透性，從而提高得率。但進行超聲微波協同萃取時，主要是物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能，產生大量熱量使物料升溫，乙醇濃度增加減小了料液中水的比例，使物料升溫減慢從而影響得率［10-12］。因此選擇50%乙醇作為提取溶劑。

2.3不同的料液比對菊苣酸提取含量的影響

不同料液比對菊苣酸提取含量的影響結果如圖4所示。

圖4　不同料液比對菊苣酸提取含量的影響Fig.4Effects of different ratio of material to liquid on the content of cichoric acid extraction

從圖4可以看出，隨著料液比的逐漸升高，提取的菊苣酸含量逐漸上升，當料液比為1∶20 g/mL時，菊苣酸含量達到最高，數值為171 μg/g。繼續升高料液比，菊苣酸含量降低。當料液比為1∶15 g/mL時，菊苣酸含量為150 μg/g。其原因可能是提取溶劑對微波能量的吸收增大，導致細胞對微波能量吸收減少，細胞破裂不完全［12］，菊苣酸釋放量少。所以選擇1∶20 g/mL為最佳料液比。

2.4不同的微波提取時間對菊苣酸提取含量的影響

不同的微波提取時間對菊苣酸提取含量的影響如圖5所示。

圖5　不同微波萃取時間對菊苣酸提取含量的影響Fig.5Effects of different extraction time on the content of cichoric acid extraction

從圖5中可以看出隨著時間的增加，菊苣酸的含量也在逐漸增大。當提取時間達到540 s時，提取的菊苣酸含量最大，數值為115.9 μg/g。超過540 s后，菊苣酸含量呈下降趨勢。可能是由于微波時間過長，部分菊苣酸被破壞，導致菊苣酸含量降低。所以微波萃取的最佳時間為540 s。

2.5不同的微波提取功率對菊苣酸提取含量的影響

不同的微波萃取功率對菊苣酸提取含量的影響如圖6所示。

圖6　不同微波提取功率對菊苣酸提取含量的影響Fig.6Effect of microwave power on the content of Cichoric Acid extraction

從圖6可以看出，隨著微波功率的增加，提取的菊苣酸的含量也在逐漸增加。在300 W時提取的菊苣酸含量達到最大值143.9 μg/g。超過300 W后，菊苣酸的含量明顯下降。這是因為外加電場作用增強，分子熱運動作用增大，得到菊苣酸的提取含量較高；隨著功率繼續增大，提取的菊苣酸容易發生變質，增加能耗。綜合以上因素，所以選擇300 W作為最佳微波提取功率。

2.6不同的提取次數對菊苣酸提取含量的影響

不同的提取次數對菊苣酸提取含量的影響的結果如圖7所示。

圖7　不同提取次數對菊苣酸含量的影響Fig.7Effect of extraction times on the content of Cichoric Acid extraction

從圖7可以看出，在同一條件下，隨著提取次數的增加，菊苣酸的含量逐漸降低，提取1次時，菊苣酸的含量115.9 μg/g，提取第2次時，菊苣酸含量為0 μg/g。說明提取1次可以將根部中的菊苣酸提取完全。故而選擇提取1次為最佳提取次數。

2.7正交試驗法優化試驗

通過對單一因素的篩選，我們確定了兩個因素水平：提取溶劑為50%乙醇，提取次數為一次。另外3個因素對菊苣酸含量影響較大，所以我們選擇微波提取時間、微波功率和料液比3因素做正交試驗。由極差分析可知，對菊苣酸含量的影響因素從大到小依次為料液比、提取時間、提取功率。說明料液比對菊苣酸含量的影響最大，是主要因素，其次是時間和功率。提取條件的優化組合為A2B3C3。由此確定最佳酶解條件為提取功率300 W、提取時間660 s和料液比1∶25 g/mL。該優化組合在上述9組試驗并中出現。在此提取條件下進行3組平行驗證試驗，得出平均菊苣酸含量為158.4 μg/g。

表2　三因素三水平正交試驗結果Table 2Results the three factors and three levels orthogonal experiment

3結論

菊苣酸最佳提取條件為50%乙醇、料液比1∶25 g/mL、微波提取時間660 s、微波提取功率300 W和提取次數為1次。在最佳提取條件下進行了3組平行驗證試驗，得到菊苣酸平均含量為158.4 μg/g。與傳統提取方法相比，該方法具有簡便、可靠、省時的優點。

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Study on Extraction Conditions of Ultrasonic Microwave Synergistic Extraction Method of Cichoric Acid

WANG Ying-chao1，WANG Lei2，JIN Hong2，*，LI Qiu-chuang2，YANG Xiao-li2
（1.College of Basic Science，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；2.College of Agronomy and Resource Environment，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Studing on optimum extraction conditions of cichoric acid from Echinacea purpurea with ultrasonic microwave extraction.Using the fresh Echinacea root，exploring the concentration of ethanol，extraction time，microwave power，ratio of material to liquid and other factors on the content of cichoric acid from Echinacea purpurea，and adopting the optimization extraction conditions by orthogonal test.The results showed that the concentration of 50%ethanol，solid-liquid ratio 1∶25 g/mL，microwave power 300 W，one times extraction and extraction times of 660 s as the best extraction conditions.Three groups of parallel test under the optimum condition were conducted，the average content of cichoric acid was 158.4 μg/g.

Echinacea purpurea；cichoric acid；ultrasonic microwave synergistic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.008

2015-05-04

天津市大學生創新創業訓練計劃項目（201410061092）

王英超（1981—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：生物化學實驗教學與研究工作。

金紅（1967—），女，教授，碩士，研究方向：生物化學教學與生物技術研究。