營養因子強化麥角硫因生物合成的研究

梅保良，劉琦，姜文俠，*，張維亞，楊萍

（1.天津科技大學，天津300457；2.中國科學院天津工業生物技術研究所，中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津300308）

營養因子強化麥角硫因生物合成的研究

梅保良1，2，劉琦2，姜文俠2，*，張維亞1，2，楊萍2

（1.天津科技大學，天津300457；2.中國科學院天津工業生物技術研究所，中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津300308）

以糙皮側耳CGMCC 6232菌絲體深層發酵制備麥角硫因，通過向發酵培養基中添加不同種類及濃度的無機鹽、維生素、生長調節劑、有機酸、氨基酸等營養因子，考察對麥角硫因合成積累的影響，研究可能的前體氨基酸對麥角硫因生物合成的影響規律。結果表明：添加氯化銨、硝酸銨、葉酸、VB1、吲哚丁酸、丙酮酸、檸檬酸、谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、組氨酸和甜菜堿對麥角硫因的合成有一定的促進作用，其中以發酵第4天向發酵液中添加15 mmol/L蛋氨酸最利于麥角硫因的合成，發酵液中麥角硫因的含量達192.4 mg/L，比對照組（102 mg/L）提高了88.6%。

麥角硫因；生物合成；發酵強化；營養因子；糙皮側耳

麥角硫因（L-Ergothioneine，EGT）是一種結構及功能獨特的天然稀有手性氨基酸，是一種多功能的細胞生理保護劑［1］，在醫藥、食品和化妝品等行業具有廣泛的應用前景。利用食用菌深層發酵制備麥角硫因，具有生產成本低、可通過代謝調控等技術手段提高產物的產量，易于規模化生產等優勢，更能夠保證產品的安全性，是合成麥角硫因的發展方向［2］。

目前對蕈菌合成麥角硫因的發酵優化研究多限于碳源、氮源和常量營養元素的篩選以及發酵過程的工藝優化［2-5］。麥角硫因是次生代謝產物，前體、維生素、生長調節劑、氨基酸等常常是次級代謝物生物合成的重要營養和調節因子。本文基于對食用菌生物合成麥角硫因途徑的推測及對食用菌菌絲體發酵過程的認識，考察了多種營養因子和可能的合成前體對麥角硫因合成積累的影響，強化麥角硫因的發酵積累過程。

1材料與方法

1.1菌種與培養基

菌種：糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）CGMCC 6232。

斜面培養基：PDA培養基。

種子培養基（g/L）：玉米粉30.0，豆粕粉15.0，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，α-淀粉酶80 U/L，自然pH，500 mL三角瓶裝液量為150 mL，121℃滅菌20 min。

發酵基礎培養基（g/L）：甘油50.0，胰酪胨35.0，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，pH 5.6，500 mL三角瓶裝液量為150 mL，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與主要試劑

IS-RDV3型臥式恒溫振蕩器：美國精騏有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀：Agilent Technologies；TW-20型恒溫水浴鍋：Julabo公司；WH240型磁力攪拌器：WIGGENS公司；SW-OJ-2F型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；S20K型臺式pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-16M型臺式冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；Mill-Q型純水機、3 ku超濾離心管：Millipore公司；麥角硫因對照品：Biomol International Inc；甲醇（色譜純）：Merck公司；一水甜菜堿：濰坊祥維斯化學品有限公司。

1.3方法

1.3.1搖瓶發酵方法

挑取CGMCC 6232斜面菌種約1 cm2，接種至種子培養基，25℃搖床150 r/min培養96 h，制備種子液。將種子液按體積比5%的接種量接入發酵培養基，25℃搖床150 r/min培養，制備菌絲體發酵液。

1.3.2麥角硫因的定量檢測方法

1.3.2.1樣品的預處理

菌絲體深層發酵結束，將菌絲體發酵液置于90℃水浴，200 r/min攪拌浸提15 min，麥角硫因浸提到細胞外的發酵液中。過濾，收集濾液置于截留分子量3 ku的超濾離心管，10 000 r/min離心超濾10 min，透過液即為發酵液中麥角硫因含量檢測的待測樣。

1.3.2.2HPLC定量檢測條件

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），兩根色譜柱串聯；流動相：甲醇-水溶液（體積比為1∶99），使用20%的乙酸調節流動相pH至5.0；檢測波長：257 nm；流速：0.7 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：5 μL。

2結果與分析

2.1無機鹽對麥角硫因生物合成的影響

分別向發酵基礎培養基添加0.125 g/L硝酸銅、0.1 g/L硼砂、0.05 g/L硫酸銅、0.005 g/L硫酸亞鐵、0.05 g/L硫酸錳、0.1 g/L氯化鈣、0.025 g/L硫代硫酸鈉、2 g/L氯化銨、5 g/L硫酸銨、2.5 g/L硝酸銨、2 g/L碳酸銨和2 g/L磷酸銨，發酵培養14 d，考察上述無機鹽對麥角硫因合成的影響。以發酵基礎培養基為對照組，將對照組發酵液中麥角硫因的含量設定為100%，結果見圖1。

圖1　無機鹽對合成麥角硫因的影響Fig.1Effects of inorganic salts on EGT production

由圖1可見，添加氯化銨和硝酸銨提高了麥角硫因的合成。進一步優化了這兩種銨鹽的添加濃度，氯化銨和硝酸銨的添加量分別為4 g/L和5 g/L時，發酵液中麥角硫因的含量較對照組提高24.4%和18.5%。試驗結果表明，酪蛋白胨與氯化銨或硝酸銨聯合使用更利于菌絲體中麥角硫因的合成積累。

2.2維生素對麥角硫因生物合成的影響

分別向發酵基礎培養基添加2.56 mg/L葉酸、0.02 mg/L生物素、6.25 mg/L VC、50 mg/L VB1、20 mg/L VB2、4 mg/L VB6和3 mg/L VB12，發酵培養14 d考察上述維生素對麥角硫因合成的影響。以發酵基礎培養基為對照組，將對照組發酵液中麥角硫因的含量定為100%，結果見圖2。

圖2　維生素對合成麥角硫因的影響Fig.2Effects of vitamins on EGT production

維生素是許多蕈菌的重要生長因子，許多維生素作為輔酶或輔基的組成成分參與微生物的生長代謝［6］。從圖2得知，添加葉酸和VB1有利于麥角硫因的合成積累，進一步優化兩種維生素的添加濃度，葉酸和VB1的添加量分別為0.64 mg/L和0.1 g/L，發酵液中麥角硫因的含量較對照組提高25%和11.1%。

2.3生長調節劑對麥角硫因生物合成的影響

生長調節劑是用于調節植物生長發育的一類物質，可調控植物體內的核酸、蛋白質和酶的合成，對植物生長的不同階段起到調節的作用。近年來植物生長調節劑的應用領域愈加廣泛，在食用菌中的應用也日趨擴大［7］。

分別向發酵基礎培養基添加100mg/L肌醇、1mg/L赤霉素、5 mg/L吲哚乙酸、2 mg/L吲哚丁酸、1 mg/L脫落酸、5 mg/L激動素、5 mg/L奈乙酸和5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），發酵培養14 d，考察對麥角硫因合成的影響。以發酵基礎培養基為對照組，將對照組發酵液中麥角硫因的含量定為100%，結果見圖3。

圖3　生長調節劑對合成麥角硫因的影響Fig.3Effects of growth regulators on EGT production

上述生長調節劑中吲哚丁酸對麥角硫因的合成積累具有正向影響。進一步優化了吲哚丁酸的添加量，向發酵基礎培養基添加1 mg/L吲哚丁酸，發酵液中麥角硫因的含量較對照組提高9.32%。吲哚丁酸是一種內源生長素，具有促進細胞分裂和生長的作用。陳都珍等使用木屑培養基對平菇進行固體發酵，考察了不同種類的生長調節劑對平菇菌絲體生長的影響，發現外源添加1 mg/L的吲哚丁酸提高菌絲體增長率7%～10%［8］。

2.4有機酸對麥角硫因生物合成的影響

分別向發酵基礎培養基添加0.5 mg/L乳酸、2.7 g/L丙二酸、1.76 g/L丙酮酸和0.2 g/L檸檬酸，以2 mol/L的NaOH溶液調節培養基pH至5.6，發酵培養14 d，考察有機酸對麥角硫因合成的影響。以發酵基礎培養基為對照組，將對照組發酵液中麥角硫因的含量定為100%，結果見圖4。

圖4　有機酸對合成麥角硫因的影響Fig.4Effects of organic acids on EGT production

由圖4看出，添加丙酮酸和檸檬酸有利于麥角硫因的合成積累。進一步優化了兩種有機酸的添加濃度，向發酵基礎培養基分別添加2.2 g/L丙酮酸和0.4 g/L檸檬酸，發酵液中麥角硫因的含量比對照組提高了5.85%和10.4%。丙酮酸和檸檬酸是三羧酸循環的起始物和重要的中間產物，三羧酸循環是生物體內糖、脂類和氨基酸代謝的共同途徑，許多合成代謝均利用三羧酸循環的中間產物作為生物合成的前體來源［9］。

2.5氨基酸對麥角硫因生物合成的影響

Donald B.Melville等［10］利用同位素示蹤法驗證了麥角硫因在粗糙鏈孢霉中的合成前體為組氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸，麥角硫因分子中的咪唑環和側鏈來源于組氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸則是甲基供體和巰基供體，生物合成順序為組氨酸先經蛋氨酸轉甲基作用生成組氨酸甜菜堿，再經半胱氨酸巰基化合成麥角硫因［11］。然而，至今麥角硫因在蕈菌中的生物合成途徑尚不清楚。為此，本研究向發酵基礎培養基分別添加谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和組氨酸，發酵培養15 d，考查上述氨基酸對菌絲體合成麥角硫因的影響，結果見圖5～圖8。

圖5　外源谷氨酸對合成麥角硫因的影響Fig.5Effects of glutamic acid supplementation on EGT production

圖6　外源蛋氨酸對合成麥角硫因的影響Fig.6Effects of methionine supplementation on EGT production

圖7　外源半胱氨酸對合成麥角硫因的影響Fig.7Effects of cysteine supplementation on EGT production

圖8　外源組氨酸對合成麥角硫因的影響Fig.8Effects of histidine supplementation on EGT production

谷氨酸是生物機體內氮代謝的基本氨基酸之一，本試驗中谷氨酸的添加量為10 μmol/L時，發酵液中麥角硫因的最高含量達131mg/L，較對照組提高9.1%。

由圖6和圖7得知，分別向發酵基礎培養基添加1 mmol/L～20 mmol/L的蛋氨酸和半胱氨酸，發酵液中麥角硫因的含量均高于對照組。蛋氨酸和半胱氨酸的添加量為15 mmol/L，發酵液中麥角硫因的含量最高，分別達到179.6 mg/L和175.5 mg/L，較對照組提高49.5%和46%。試驗結果表明，兩種外源氨基酸的添加有效地促進了CGMCC 6232菌絲體發酵過程中麥角硫因的合成積累，推測蛋氨酸和半胱氨酸可能是CGMCC 6232合成麥角硫因的前體。

由圖8看出，向發酵基礎培養基添加0.5 mmol/L～12 mmmol/L的組氨酸，麥角硫因的發酵水平隨組氨酸含量的增加呈下降趨勢，添加量為1 mmol/L，發酵液中麥角硫因的最高含量達129.5 mg/L，較對照組提高7.7%，組氨酸添加量超過4 mmol/L，麥角硫因的發酵水平卻低于對照組。推測外源組氨酸的添加可能抑制了內源組氨酸合成麥角硫因的途徑，與DonaldB.Melville的研究結果一致：向粗糙鏈孢霉培養基添加外源組氨酸，內源組氨酸合成麥角硫因的途徑即被抑制［11］。

2.6甜菜堿對麥角硫因生物合成的影響

1個甜菜堿分子中有3個非穩態甲基，是有效的甲基供體，麥角硫因分子中含有甜菜堿的結構，因此，向發酵基礎培養基添加1 mmol/L～200 mmol/L的甜菜堿，用2 mol/L的NaOH調節培養基pH至5.6，發酵培養15 d，考察添加甜菜堿對合成麥角硫因的影響，結果見圖9。

圖9　甜菜堿對合成麥角硫因的影響Fig.9Effects of betaine on EGT production

隨甜菜堿添加量的增加，發酵液中麥角硫因的含量呈現先上升后下降的趨勢，添加量為150 mmol/L時，麥角硫因的最高發酵水平達146.6 mg/L，較對照組提高了21.8%。

2.7氨基酸的添加時間對麥角硫因合成積累的影響

Chih-Hung Liang等利用杏鮑菇菌絲體發酵合成麥角硫因，發現外源氨基酸的添加時間對麥角硫因合成的影響較大，分別在發酵起始和發酵第7天向培養基中添加4 mmol/L組氨酸，菌絲體中麥角硫因的含量較對照組（2.28 mg/g DW）提高了51.8%和72.4%［12］。本試驗考察了蛋氨酸和半胱氨酸的添加時間對麥角硫因合成積累的影響，分別在發酵起始、第2天、第4天、第6天和第8天向培養基添加15 mmol/L蛋氨酸和15 mmol/L半胱氨酸，發酵培養15 d，測定發酵液中麥角硫因的含量，結果見圖10。

圖10　氨基酸的添加時間對合成麥角硫因的影響Fig.10Effects of amino acids supplementation at various days on EGT production

兩種氨基酸的添加時間對麥角硫因合成積累的影響不同。在發酵第4天添加蛋氨酸，發酵液中麥角硫因的含量達192.4 mg/L，較對照組（102 mg/L）提高了88.6%。在發酵第6天添加半胱氨酸，發酵液中麥角硫因含量達168.5 mg/L，比對照組（114.4 mg/L）提高47.3%。由于麥角硫因是次生代謝產物，主要在發酵的中后期合成積累，在發酵中期添加蛋氨酸和半胱氨酸更利于麥角硫因的合成。

3結論

通過考察無機鹽、維生素、生長調節劑、有機酸、氨基酸和甜菜堿等營養因子對CGMCC 6232菌絲體深層發酵合成麥角硫因的影響，篩選到了12種促進麥角硫因合成積累的化合物，強化了麥角硫因的發酵積累過程。進一步考察了外源氨基酸的添加時間對麥角硫因合成積累的強化效果，在發酵第4天添加15 mmol/L的蛋氨酸，發酵液中麥角硫因的積累量最高，達192.4 mg/L，比對照組的102 mg/L提高了88.6%。

Donald B.Melville等［10］實驗確定了蛋氨酸和半胱氨酸是麥角硫因在粗糙鏈孢霉中的合成前體，本文試驗證明了蛋氨酸和半胱氨酸可以大幅度提高糙皮側耳合成積累麥角硫因，但還不能確定蕈菌中麥角硫因的合成代謝途徑是否與粗糙鏈孢霉中的合成途徑相同。因此，有必要深入探究蕈菌合成麥角硫因的前體，解析麥角硫因在蕈菌中的生物合成途徑，建立基于代謝調控的發酵過程優化控制策略，進一步提高麥角硫因的發酵水平。

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Study on the Biosynthesis of L-ergothioneine by Enhancement of Nutritional Factors

MEI Bao-liang1，2，LIU Qi2，JIANG Wen-xia2，*，ZHANG Wei-ya1，2，YANG Ping2
（1.Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering，Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

The mycelium of Pleurtus ostreatus CGMCC 6232 was used to produce L-ergothioneine by sub-merged fermentation in this study，the effect of adding different kinds and concentrations of inorganic salts，vitamins，growth regulators，organic acids and amino acids to culture medium on the production of EGT were investigated，particularly，the influencing rules of probable precursors on EGT biosynthesis was studied.The results showed that ammonium chloride，ammonium nitrate，folic acid，VB1，indolebutyric acid，pyruvic acid，citric acid，glutamic acid，methionine，cysteine，histidine and betaine improved EGT production，the effect of methionine on increasing EGT production was the most significant，the individual supplementation of 15 mmol/L methionine at the 4th day yielded a significantly 88.6%higher content of EGT in fermentation liquid（192.4mg/L）compared to that of the control medium（102 mg/L）.

L-ergothioneine；biosynthesis；enhancement of fermentation；nutritional factors；Pleurotus ostreatus

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.027

2014-03-27

天津市青年基金（13JCQNJC10100）；天津市科技支撐計劃重點項目（10ZCKFSY06300）

梅保良（1987—），男（漢），碩士研究生，研究方向：輕工技術與工程（發酵）。