紫花苜蓿多糖的體外抗腫瘤活性研究

劉立新，張羽男，張強，張楠楠

（佳木斯大學藥學院，黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，黑龍江佳木斯154007）

紫花苜蓿多糖的體外抗腫瘤活性研究

劉立新，張羽男，張強，張楠楠

（佳木斯大學藥學院，黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，黑龍江佳木斯154007）

探究超聲輔助法提取紫花苜蓿多糖的最佳工藝，并對其進行體外抗腫瘤活性研究。利用超聲輔助提取法提取紫花苜蓿多糖；利用細胞活力測定法、LDH活性測定和雙熒光染色法研究紫花苜蓿多糖的體外抗腫瘤活性。細胞活力分析儀測定結果顯示紫花苜蓿多糖能抑制人乳腺癌細胞的活性；LDH活性測定表明紫花苜蓿多糖能影響人乳腺癌細胞并呈現出劑量-效應關系；雙熒光染色法結果表明紫花苜蓿多糖作用后人乳腺癌細胞凋亡數量較對照組增加；紫花苜蓿多糖具有較為良好的體外抗腫瘤活性。

紫花苜蓿；多糖；提取；抗腫瘤活性

紫花苜蓿（Medicago sativaL）是豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）的代表性植物。由于其具有儲量多、營養價值高和易于消化等特點而一直作為牧草飼料在世界范圍內廣泛應用［1-2］。現代研究發現紫花苜蓿中含有萜類、多糖及皂苷等多種具有良好抗腫瘤活性成分［3-6］。因此，將價格低廉、產量豐富的紫花苜蓿開發成具有高附加值藥用保健食品資源將極具現實意義。植物中多糖的傳統提取方法主要是水煎法，但提取效率較低、能耗較大。相比較而言，超聲波輔助提取法則具有效率高、能耗小、操作簡便等顯著優點［7-8］。本文將延續以往的工作［9］，通過研究紫花苜蓿總多糖的超聲波輔助提取工藝及其體外抗腫瘤活性，為開發紫花苜蓿中的高附加值成分提供理論參考。

1材料、試劑及儀器

1.1主要材料

原材料：紫花苜蓿，購自北京禾木青科技有限公司。

試劑：DMEM（高糖）培養液、優質胎牛血清購自Gibco公司；胰蛋白酶（Sigma）購自上海化學試劑采購供應站；葡萄糖標準品購自上海楚定分析儀器有限公司；乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸等均分析純。

1.2主要儀器

FS-20粉碎機：莊河市南甸機械廠；FA2004電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；KQ-250DE型數控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；離心機：北京醫療儀器修理廠；HD-136超凈工作臺：哈爾濱市東聯電子儀器有限公司；LX-S50高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；Olympus IX50倒置顯微鏡：日本奧林巴斯公司；RCO3000TVB型CO2培養箱：美國REVCO公司。

1.3細胞株

人乳腺癌細胞MCF-7。細胞株由佳木斯大學藥學院細胞室提供。

2方法

2.1紫花苜蓿多糖的提取

2.1.1原料的預處理

用粉碎機將紫花苜蓿干草粉碎過60目篩，備用。

2.1.2葡萄糖標準曲線的繪制

精密稱取葡萄糖標準品10 mg，置25 mL容量瓶中，加水溶解并加至刻度，搖勻，靜置，備用。精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分置于具塞試管中，用蒸餾水配制成2 mL溶液，再分別加入1 mL苯酚和5 mL濃硫酸，搖勻，備用。在490 nm的波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。

2.1.3提取方法

在單因素試驗成功的基礎上確定以料液比、浸提時間、提取功率和提取溫度四因素且每因素三水平進行正交試驗設計，試驗確定的因素水平見表1。

表1　試驗因素水平表Table 1Table of factors and levels

通過測定紫花苜蓿供試品中的多糖的濃度，確定最佳提取工藝條件為提取時間30 min，提取溫度70℃，固液比1∶40 g/mL，頻率80 Hz。

2.1.4提取物的提取

稱取處理好的供試品10.0 g，在優化的最佳提取工藝條件下進行提取。提取后用紗布粗過濾，濾液趁熱抽濾。將提取液放在旋轉蒸發器中減壓濃縮至相同體積后，將濾液靜置。待濾液冷卻至室溫后加入相同體積的乙醇（95%），使混合后的溶液中醇濃度達到80%以上。醇沉48 h后，將混合液通過低速離心機，以3 500 r/min離心15 min，取沉淀干燥后得粗多糖，稱量后放入冰箱備用。

2.2紫花苜蓿多糖的純化和鑒定

用蒸餾水加熱溶解粗多糖→sevage法去蛋白5次→上層溶液加2倍體積95%乙醇醇析→沉淀多糖→依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次→室溫干燥后得純紫花苜蓿多糖。

將分離純化得到的多糖純品配制成5 mg/mL的溶液進行檢驗。茚三酮反應鑒別是否含氨基酸，或蛋白質等雜質；α-萘酚反應鑒別是否為糖類物質；三氯化鐵反應鑒別是否含有酚類物質；碘-碘化鉀反應鑒別是否含淀粉類雜質。

2.3樣品含量測定

精密吸取0.6 mL多糖純品置于具塞試管中，用蒸餾水配置成2 mL溶液，再分別加入1 mL苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，靜置10 min，然后將具塞試管放入水浴鍋中，40℃水浴加熱15 min，經流水冷卻后。在490 nm的波長處測定吸光度。通過葡萄糖標準曲線的回歸方程，求出該樣品的葡萄糖濃度（mg/mL）。

結果計算：多糖含量=（C×D）/V×100%

式中：C為供試液葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為供試液的稀釋因數；V為供試液體積，mL。

2.4體外抗腫瘤活性研究［8］

2.4.1細胞的培養

人乳腺癌細胞MCF-7在5%CO2和37℃的條件下，在含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素的DMEM培養液中貼壁生長。用0.25%胰蛋白酶消化進行傳代。

2.4.2細胞活力測定

利用CASY細胞活力分析儀測定細胞活力。調整細胞密度為6×105個/mL接種于12孔培養板中，5% CO2和37℃條件培養24 h，棄去培養液，每孔加入紫花苜蓿多糖使其終濃度分別為25、50、100、200、400 μg/mL，同時設立不加紫花苜蓿多糖的對照組和加100 μg/mL的5-氟尿嘧啶組分別為陰性對照組和陽性對照組，培養24 h后，將12孔板內的細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，取100 μL加入到10 mL CASY-ton緩沖液中稀釋搖勻，運行控制面板上的START，進行3次測量體積為400 μL的檢測。

2.4.3乳酸脫氫酶（LDH）活性的檢測

采用乳酸脫氫酶試劑盒測定：二硝基苯肼比色法。按試劑盒說明書進行操作。

2.4.4吖啶橙-溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色法

待細胞在12孔板中培養長成單層后，加紫花苜蓿多糖溶液，使其終濃度分別為100、200、400 μg/mL，同時設立空白對照著組，37℃培養24 h后，用胰酶消化收集細胞，將細胞密度調整為105個/mL，取95 μL細胞懸液加入5 μL AO/EB熒光染色液，混勻，將細胞懸液滴加到載玻片上，加蓋玻片后于熒光顯微鏡下觀察計數，每個樣品計數200個細胞，根據以下公式計算細胞凋亡指數和細胞壞死指數。

凋亡指數=［凋亡細胞數/（正常細胞數+凋亡細胞數+壞死細胞數）］×100%

3結果與討論

3.1提取物含量測定結果

3.1.1葡萄糖標準曲線

標準曲線如圖1所示。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1Dextrose standard sample

進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.010 4+13.52X，R=0.999 54。

3.1.2紫花苜蓿多糖的含量

在最佳提取工藝條件下，從紫花苜蓿中提取出的多糖含量為15.14 mg/g。

3.2提取物中多糖成分的鑒別結果

3.2.1α-萘酚反應

觀察到兩層液面出現紫紅色環，證明提取物中含有多糖。

3.2.2茚三酮反應

滴加茚三酮溶液，無藍色出現，說明所獲多糖制品不含蛋白質和核酸類物質，非糖蛋白形式。

3.2.3三氯化鐵反應和碘-碘化鉀反應

結果均呈陰性，說明提取物中不含酚類和淀粉類物質。

3.3體外抗腫瘤結果

3.3.1紫花苜蓿多糖對乳腺癌細胞活力的影響

紫花苜蓿多糖作用24 h后，CASY細胞活力分析儀分析乳腺癌細胞數目及細胞活性，見表2。

表2　紫花苜蓿多糖對乳腺癌細胞活性的影響Table 2The effect of polysaccharides from Medicago sativaL on activities of breast cancer cells

結果表明隨著紫花苜蓿多糖濃度的增加，乳腺癌細胞的數目和活性都顯著低于陰性對照組。

3.3.2乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測結果

乳酸脫氫酶（LDH）是存在細胞胞質中的一種非特異性酶，正常情況下多存在于細胞內，當受外來刺激或致傷因素影響后，如細胞膜通透性發生改變或受到損傷時，可大量釋放或漏出到細胞外，引起細胞培養上清中LDH活性增強，利用該特點將其作為細胞活性的檢測指標，測定有毒物質對細胞的毒性作用。本實驗以紫花苜蓿多糖作用乳腺癌細胞24 h后，測定上清液中LDH活性，結果見表3。

表3　紫花苜蓿多糖對乳腺癌細胞LDH活性的影響Table 3The effect of polysaccharides from Medicago sativaL on LDH activity of breast cancer cells

紫花苜蓿多糖能夠增加細胞內的LDH漏出率，隨著紫花苜蓿多糖濃度的增加，乳腺癌細胞培養上清液中LDH活性增加，試驗組與對照組及試驗組間比較差異均極顯著。

3.3.3吖啶橙-溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色結果

圖2AO/EB雙熒光染色形態學變化
Fig.2The morphological changes of AO/EB fluorescein staining

死的細胞被EB染成紅色。見圖2。

對照組可見被染成綠色的正常細胞，胞核完整，界限清晰。隨著紫花苜蓿多糖濃度的增加，具有細胞膜皺縮、染色體固縮、邊聚、碎裂等凋亡典型特征的凋亡細胞數逐漸增多，部分細胞被染成橙紅色。

4結論

本研究表明，利用超聲輔助提取法可以高效地提取紫花苜蓿總多糖。采用細胞活力分析、LDH活性測定及雙熒光染色法研究紫花苜蓿總多糖體外抗腫瘤活性，發現紫花苜蓿多糖能夠抑制人乳腺癌細胞的活性并呈現出劑量-效應關系，人乳腺癌細胞的凋亡數量較對照組明顯增加，表明紫花苜蓿多糖具有較為良好的抗腫瘤活性。本研究為開發紫花苜蓿中的高附加值抗腫瘤成分提供了一定的理論參考。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第四十二卷，第二分冊［M］.北京:科學出版社，1998:312

［2］洪紱曾.苜蓿科學［M］.北京:中國農業出版社，2009:3

［3］王鑫，馬永祥，李娟.紫花苜蓿營養成分及主要生物學特性［J］.草業科學2003，20（10）:39-40

［4］M Magdel-Din Hussein，Wafaa A Helmy，H M Salem.Biological activities of some galactomannans and their suLfated derivatives［J］. Phytochemistry，1998，48（3）:479-484

［5］何云，劉圈煒，王成章，等.紫花苜蓿活性成分研究進展［J］.飼料工業，2005，26（17）:52-54

［6］Gomathi Gandhi GokuLakannan，Karsten Niehaus.Characterization of the Medicago truncatuLa cell wall proteome in cell suspension cuLture upon elicitation and suppression of plant defense［J］.Journal of Plant Physiology，2010，167（18）:1533-1541

［7］蔣珍菊，王周玉.超聲波輔助提取女貞子有效成分及其含量分析［J］.時珍國醫國藥，2010，21（4）:819-821

［8］Martin Tongai Mazvimba，Yu Ying，Cui Zhi-Qin.Optimization and orthogonaldesign of an uLtrasonic-assisted aqueous extraction process for extracting chlorogenic acid from dry tobacco leaves［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2012，10（4）:311-320

［9］張羽男，劉立新，張強，等.紫花苜蓿皂苷抗腫瘤活性研究［J］.時珍國醫國藥，2013，24（5）:1035-1036

Study on Antitumor Activity of Polysaccharides in Vitro from Medicago sativaL

LIU Li-xin，ZHANG YU-nan，ZHANG Qiang，ZHANG Nan-nan
（School of Pharmacological Sciences，The Key Laboratory for Biological Drug of the Education Department Heilongjiang，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

To discuss the best ultrasonic-assisted extraction condition of the total polysaccharides from Medicago sativaL and to study the antitumor activity in vitro of total polysaccharides from Medicago sativaL. Ultrasonic-assisted extraction was employed in the extraction of the total polysaccharides from Medicago sativaL.Antitumor activity of total polysaccharides from Medicago sativaL was measured by using the cell viability assay，LDH activity and double staining immunofluorescence techniques.Cell viability assay and LDH activity measurement indicated that total polysaccharides from Medicago sativaL can dose-dependently inhibited the proliferation activity of human breast cancer cells.Double staining immunofluorescence techniques showed that human breast cancer cells apparently increased after the treatment of total polysaccharides from Medicago sativaL than the control groups.Total polysaccharides from Medicago sativaL had comparatively obvious antitumor activity in vitro.

Medicago sativaL；polysaccharides；extraction；antitumor activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.001

2014-06-18

國家自然科學基金（No.31101250）；黑龍江省教育廳科學技術研究項目（No.12521560）

劉立新（1978—），女（漢），講師，在讀博士，主要從事天然藥物活性成分研究工作。