玉米花粉粗多糖及級(jí)分體外抗氧化效果的比較

李云捷，湯尚文，郭壯，余海忠

（湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄陽441053）

玉米花粉粗多糖及級(jí)分體外抗氧化效果的比較

李云捷，湯尚文，郭壯，余海忠

（湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄陽441053）

通過對(duì)小鼠組織及體液的體外試驗(yàn)，研究不同體系中玉米花粉粗多糖及級(jí)分的體外抗氧化活性，并進(jìn)行比較。結(jié)果表明，玉米花粉粗多糖及級(jí)分可抑制小鼠肝組織的脂質(zhì)過氧化，對(duì)Fe2+和H2O2誘導(dǎo)的肝組織過氧化物損傷具有保護(hù)作用，能減輕線粒體腫脹和減少紅細(xì)胞溶血的發(fā)生，且其效果具有隨用量的增加呈遞增趨勢(shì)。經(jīng)比較，玉米花粉粗多糖在以上作用中顯示出比其它玉米花粉多糖級(jí)分更好的效果。

玉米花粉粗多糖；玉米花粉多糖級(jí)分；體外抗氧化

蜂花粉是指蜜蜂采蜜時(shí)帶回的花粉團(tuán)，在蜂巢內(nèi)經(jīng)過儲(chǔ)藏和發(fā)酵后形成的花粉。它富含人體所需的各種營(yíng)養(yǎng)素，且研究表明，其具有抗氧化、延緩衰老、提高免疫力等作用［1］。玉米自16世紀(jì)傳入我國，至今已有470多年的栽培歷史，目前，我國玉米產(chǎn)量位居世界第二。玉米主要通過蜜蜂授粉，簡(jiǎn)稱玉米花粉。如按照2005年全國玉米種植面積3.9億畝計(jì)算，玉米花粉畝產(chǎn)量平均為18.3 kg，共可采集玉米花粉713.7萬t［2］。充分利用好該資源，必將產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

研究顯示，玉米花粉多糖的含量是蜂花粉類中最高的，具有抗腫瘤效用、對(duì)巨噬細(xì)胞的具有一定的激活作用［3］。但其抗氧化的活性報(bào)道較少。本文從亞細(xì)胞器、組織及動(dòng)物體水平上評(píng)價(jià)了玉米花粉粗多糖及其級(jí)分的抗氧化作用，并比較了不同玉米花粉多糖級(jí)分之間的抗氧化活性大小，以期為玉米花粉多糖功能食品的開發(fā)利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)樣品采用水提醇沉法，得到玉米花粉粗多糖CPP（Corn pollen polysaccharide，以下簡(jiǎn)稱CPP）；CPP經(jīng)savag法脫蛋白后，并分別用體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、75%的乙醇分級(jí)，得到級(jí)分FCPP-A（fraction-A from Corn pollen polysaccharide以下簡(jiǎn)稱FCPP-A）、FCPP-B（fraction-B from Corn pollen polysaccharide以下簡(jiǎn)稱FCPP-B）、FCPP-C（fraction-C from Corn pollen polysaccharide以下簡(jiǎn)稱FCPP-C）［4］。

試驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠，雄性，體重（20±2）g。由湖北省醫(yī)學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。

1.2試劑及儀器

1.2.1主要試劑

牛血清白蛋白（生物試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；MDA及活性氧測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；VC、硫酸亞鐵及其它均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2主要儀器

UV-265FW型紫外可見分光光度計(jì)：Shimadzu Co. Japan；AC210S型電子天平：SartoriusGermany；A1930049型電子恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠；DGT-G500-X型干燥箱：重慶試驗(yàn)設(shè)備廠一分廠；CT15RE低溫超速離心機(jī)：Htachi，Japan。

1.3方法

1.3.1對(duì)小鼠紅細(xì)胞自氧化溶血時(shí)的丙二醛（MDA）生成的影響

昆明種小鼠20只，雄性，體重（20±2）g，眼球取血，肝素抗凝，3 000 r/min離心分離得紅細(xì)胞，冷生理鹽水洗滌3次，制成0.5%懸浮液，取紅細(xì)胞（Red Blood Cell，下簡(jiǎn)稱RBC）懸浮液5.0 mL與0.2 mL一定濃度樣品液混合，并于37℃溫育24 h（對(duì)照管以0.2 mL蒸餾水替代樣品液）。用生理鹽水稀釋5倍，3 000 r/min離心10 min。取上清液按試劑盒操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，以蒸餾水做空白，測(cè)紅細(xì)胞溶血時(shí)丙二醛的生成量，以吸光度表示丙二醛生成的量。

1.3.2對(duì)小鼠肝組織勻漿丙二醛（MDA）生成的影響

制備10%的小鼠肝組織勻漿液［5-6］。按MDA測(cè)定試劑盒方法測(cè)定并計(jì)算MDA含量，并計(jì)算抑制率。肝勻漿蛋白質(zhì)含量用Lowry法測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。FeSO4誘導(dǎo)組和H2O2誘導(dǎo)組按文獻(xiàn)［7-8］方法處理。

式中：A0為空白；A1為樣品。

1.3.3對(duì)小鼠肝線粒體腫脹度的影響

取10%的肝組織勻漿液5 mL，先以3 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，取上清液以10 000 r/min離心10 min，所得的沉淀即為線粒體［9-10］，用Lowry法測(cè)定該懸浮液的蛋白質(zhì)含量，調(diào)整成蛋白質(zhì)濃度為0.5 mg/mL的線粒體懸液，在試管中加入不同濃度的樣品液0.4mL。空白加生理鹽水，再加入3.0 mL線粒體懸液和1.4 mL 0.5 mmol/L的FeSO4溶液及0.4 mL 0.5 mmol/L VC溶液，迅速混勻后于520 nm處比色測(cè)定吸光度，吸光度降低表示線粒體發(fā)生腫脹。抑制率計(jì)算方法同1.3.2。

1.3.4對(duì)小鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響

在試管中加入1.0 mL線粒體懸液（蛋白質(zhì)含量0.5 mg/L），0.4 mL樣品液，0.4 mL 0.5mmol/L的硫酸亞鐵溶液和0.4 mL 0.5 mmol/L的VC溶液，空白以生理鹽水代替樣品溶液，混勻后于37℃溫浴1 h后，按照試劑盒的方法測(cè)定MDA的生成量，并計(jì)算抑制率。抑制率計(jì)算方法同1.3.2。

2結(jié)果及分析

2.1玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)小鼠紅細(xì)胞自氧化溶血時(shí)丙二醛（MDA）生成的影響

玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)RBC溶血時(shí)MDA產(chǎn)生的影響如圖1所示。

圖1　玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)小鼠紅細(xì)胞自氧化溶血時(shí)MDA生成的影響Fig.1Eeffct of CPP on MDA formation during the hemolysis of rat RBC

在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)MDA的生成均有一定程度的抑制作用，表明玉米花粉多糖及級(jí)分對(duì)紅細(xì)胞自氧化溶血的保護(hù)作用與其抑制紅細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有一定的關(guān)聯(lián)。

2.2玉米花粉粗多糖及對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性生成MDA的影響

玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性生成MDA的影響及量效關(guān)系分別見表1和表2。

表1　玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性生成MDA的影響Table 1Effects of CPP on MDA formation of rat liver incubated in vitro（n=3，±s）

表1　玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性生成MDA的影響Table 1Effects of CPP on MDA formation of rat liver incubated in vitro（n=3，±s）

注：a為與空白比較誤差在P＜0.01以內(nèi)；b為與空白比較誤差在P＜0.05以內(nèi)；—為0。

試樣濃度/（μg/mL）MDA吸光值（A540）抑制率/% CPP1250.280±0.005a16.67 2500.246±0.004a24.79 5000.234±0.005a32.36 1 0000.180±0.005a46.43 FCPP-A1250.294±0.004a12.5 2500.284±0.007a17.48 5000.184±0.004a40.24 1 0000.162±0.011a51.79 FCPP-B1250.280±0.007a16.67 2500.268±0.006a24.24 5000.204±0.006a39.29 1 0000.186±0.004a44.64 FCPP-C1250.312±0.004a7.14 2500.286±0.003a14.88 5000.232±0.004a30.95 1 0000.214±0.006a36.31 Control00.336±0.002a—

由表1所示，玉米花粉多糖各級(jí)分FCPP-A、FCPP-B、FCPP-C及粗多糖CPP對(duì)肝勻漿MDA的生成均有較好的抑制作用，且隨著濃度的加大而增大。其中，CPP和FCPP-A的效果最好。說明玉米花粉粗多糖及級(jí)分可通過對(duì)自由基產(chǎn)生的抑制作用來抑制肝組織自氧化，從而達(dá)到保護(hù)肝組織的目的，但不一定純度越高，效果越好。

表2　玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)抑制小鼠肝勻漿自發(fā)性生成MDA的量效關(guān)系Table 2The relationship of CPP on MDA formation of rat liver incubated

線形回歸（見表2）分析表明，F(xiàn)CPP-A、FCPP-B、FCPP-C及粗多糖CPP對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性生成MDA的抑制效果與它們的濃度符合一元二次方程模型，其相關(guān)系數(shù)r2分別是：0.992 4、0.977 5、0.996 2和0.995 1。

2.3玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)誘導(dǎo)小鼠肝勻漿生成MDA的影響

玉米花粉粗多糖及對(duì)Fe2+和H2O2誘導(dǎo)小鼠肝勻漿生成MDA的影響見表3。

表3　玉米花粉粗多糖及對(duì)Fe2+和H2O2誘導(dǎo)小鼠肝勻漿生成MDA的影響Table 3Effects of CPP on MDA formation of rat liver induced by Fe2+and H2O2in vitro（n=3，±s）

表3　玉米花粉粗多糖及對(duì)Fe2+和H2O2誘導(dǎo)小鼠肝勻漿生成MDA的影響Table 3Effects of CPP on MDA formation of rat liver induced by Fe2+and H2O2in vitro（n=3，±s）

抑制率/% CPP630.919±0.026b23.410.682±0.001a18.42 1250.840±0.014b30.060.672±0.008a19.62 2500.830±0.001a30.890.658±0.001a21.29 5000.795±0.021b33.810.650±0.001a22.25 1 0000.775±0.035b35.470.624±0.018b25.36 FCPP-A631.01±0.014a15.900.760±0.035b9.09 1250.990±0.028b17.570.714±0.010a14.59 2500.930±0.028b22.560.708±0.006a15.31 5000.840±0.014b30.060.684±0.011a18.18 1 0000.830±0.001a30.890.654±0.004a21.77 FCPP-B631.025±0.021b14.650.754±0.004a9.81 1250.990±0.014b17.570.750±0.004a10.29 2500.975±0.007a18.820.648±0.008a22.49 5000.945±0.007a21.320.640±0.007a23.44樣品濃度/（μg/mL）Fe2+-誘導(dǎo)H2O2-誘導(dǎo)MDA吸光值（A540）抑制率/% MDA吸光值（A540）

續(xù)表3玉米花粉粗多糖及對(duì)Fe2+和H2O2誘導(dǎo)小鼠肝勻漿生成MDA的影響Continue table 3Effects of CPP on MDA formation of rat liver induced by Fe2+and H2O2in vitro（n=3，±s）

續(xù)表3玉米花粉粗多糖及對(duì)Fe2+和H2O2誘導(dǎo)小鼠肝勻漿生成MDA的影響Continue table 3Effects of CPP on MDA formation of rat liver induced by Fe2+and H2O2in vitro（n=3，±s）

注：a為與空白比較誤差在P＜0.01以內(nèi)；b為與空白比較誤差在P＜0.05以內(nèi)；—為0。

抑制率/% 1 0000.845±0.007a29.640.622±0.009a25.60 FCPP-C631.025±0.007a14.650.710±0.001a15.07 1251.010±0.014a15.900.694±0.003a16.99 2500.960±0.042b20.070.680±0.007a18.66 5000.925±0.007a22.980.664±0.004a20.57 1 0000.905±0.021b24.650.630±0.028b24.64 control01.201±0.007—0.836±0.003—樣品濃度/（μg/mL）Fe2+-誘導(dǎo)H2O2-誘導(dǎo)MDA吸光值（A540）抑制率/% MDA吸光值（A540）

亞鐵離子和雙氧水是很強(qiáng)的自由基誘導(dǎo)劑，可見在小鼠肝勻漿中添加自由基誘導(dǎo)劑后其自氧化產(chǎn)生的MDA顯著增加。如表3所示，在這兩種體系內(nèi)，玉米花粉粗多糖及級(jí)分均表現(xiàn)出一定的抑制MDA生成活性。其中，二者表現(xiàn)均最佳的是CPP。

2.4玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)誘導(dǎo)小鼠肝線粒體腫脹度的影響

玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)Fe2++VC誘導(dǎo)小鼠肝線粒體腫脹度的影響見表4。

表4　玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)Fe2++VC誘導(dǎo)小鼠肝線粒體腫脹度的影響Table 4Effects of CPP on mitochondria swelling induced by Fe2++ VC（n=3±s）

表4　玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)Fe2++VC誘導(dǎo)小鼠肝線粒體腫脹度的影響Table 4Effects of CPP on mitochondria swelling induced by Fe2++ VC（n=3±s）

注：a為與空白比較誤差在P＜0.01以內(nèi)；b為與空白比較誤差在P＜0.05以內(nèi)；—為0。

試樣時(shí)間/min抑制率/% 0102040 Control0.278± 0.001 0.249± 0.001 0.240± 0.001 0.236± 0.002—CPP0.302± 0.006a0.301± 0.001a0.284± 0.003a0.276± 0.003a43.02 FCPP-A0.312± 0.001a0.304± 0.003a0.290± 0.005a0.278± 0.001a27.86 FCPP-B0.316± 0.004a0.312± 0.002a0.289± 0.001a0.282± 0.002a28.79 FCPP-C0.314± 0.004a0.306± 0.008a0.284± 0.003a0.276± 0.003a19.92

脂質(zhì)過氧化會(huì)使膜的通透性增加，引起膜內(nèi)外物質(zhì)的外瀉或內(nèi)流，造成如線粒體腫脹等現(xiàn)象的發(fā)生，加入抗壞血酸和硫酸亞鐵可以誘導(dǎo)產(chǎn)生羥基自由基，直接與線粒體膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，改變膜的流動(dòng)性和通透性，引起線粒體腫脹或破壞其膜結(jié)構(gòu)的完整。不同玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)誘導(dǎo)小鼠肝線粒體腫脹度的影響大小依次為粗多糖CPP、FCPP-B、FCPP-A、FCPP-C。

2.5玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)小鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響

玉米花粉粗多糖及對(duì)小鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響見表5。

表5　玉米花粉粗多糖及對(duì)小鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響Table 5Effects of CPP on lipid peroxidation of rat liver mitochondria（n=3，±s）

表5　玉米花粉粗多糖及對(duì)小鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響Table 5Effects of CPP on lipid peroxidation of rat liver mitochondria（n=3，±s）

注：a為與空白比較誤差在P＜0.01以內(nèi)；b為與空白比較誤差在P＜0.05以內(nèi)；—為0。

試樣濃度/（μg/mL）MDA吸光值（A540）抑制率/% CPP1250.265±0.008a44.33 2500.237±0.018a50.21 5000.214±0.006a55.04 FCPP-A1250.248±0.007a47.90 2500.225±0.006a52.73 5000.212±0.003a55.46 FCPP-B1250.241±0.007a49.37 2500.228±0.008a52.10 5000.209±0.007a56.09 FCPP-C1250.267±0.029ab43.91 2500.213±0.005a55.25 5000.206±0.004a56.72 Control00.476±0.013—

由抗壞血酸和硫酸亞鐵誘導(dǎo)引起線粒體膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA，這一過程中由于線粒體膜上的多不飽和脂肪酸過氧化，會(huì)伴隨造成線粒體膜結(jié)構(gòu)破壞，檢測(cè)MDA含量的變化可以間接反應(yīng)線粒體膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和膜被破壞的程度。如表5所示，F(xiàn)CPP-A、FCPP-B、FCPP-C及粗多糖CPP可顯著抑制肝線粒體MDA的生成，且其抑制率隨著濃度的增大而增加。在125 μg/mL～500 μg/mL的劑量范圍里，不同玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)小鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的抑制活性大小依次為FCPP-C、FCPP-B、FCPP-A、及粗多糖CPP。

3結(jié)論

1）本研究表明玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)各種活性氧均有抗氧化作用，這表明玉米花粉粗多糖及級(jí)分具有直接清除自由基及脂質(zhì)過氧化的活性，這為進(jìn)一步研究其保健功效，探討其作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

2）從效果來看，玉米花粉粗多糖及級(jí)分對(duì)脂質(zhì)抗氧化作用隨用量的增加呈遞增趨勢(shì)。其中，粗多糖CPP在對(duì)小鼠紅細(xì)胞自氧化溶血時(shí)對(duì)MDA的抑制作用、對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)性及誘導(dǎo)性產(chǎn)生MDA的抑制作用及對(duì)誘導(dǎo)小鼠肝線粒體腫脹度的抑制作用顯示出比其它玉米花粉粗多糖及級(jí)分更好的效果，可能是由于CPP中含有多糖與蛋白結(jié)合形成的糖蛋白結(jié)構(gòu)共同作用的結(jié)果，有待于進(jìn)一步研究。

3）玉米花粉多糖抗氧化的機(jī)理尚待研究，其對(duì)脂質(zhì)抗氧化的作用與多糖的結(jié)構(gòu)關(guān)系仍不明確。因此，從分子水平上闡明其結(jié)構(gòu)與抗氧化作用之間的關(guān)系將成為下一步深入研究的重點(diǎn)。

［1］王開發(fā).花粉的功能與運(yùn)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:1-20

［2］楊虎.20世紀(jì)中國玉米種業(yè)發(fā)展研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011:6

［3］趙昌輝，李泳財(cái)，何東，等.玉米花粉成分、功能及其應(yīng)用的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010（9）:414-416

［4］李云捷，吳謀成，鄧家慶，等.玉米花粉多糖的提取與結(jié)構(gòu)的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009（12）:93-94

［5］Xue Z H，Wu M C，Yin J Z．Technological optimizatation forhydrolysis of rapeseed albumin with alcalase［J］．Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，2003，19（5）:176-l81

［6］汪艷，吳曙光，徐繼紅，等．米糠多糖與環(huán)磷酰胺聯(lián)合抗腫瘤作用的免疫藥理學(xué)機(jī)制研究［J］．解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，17（6）:291-294

［7］張爾賢，俞麗君，周意琳，等．Fe2+誘發(fā)脂蛋白PUFA過氧化體系及對(duì)若干天然產(chǎn)物抗氧化作用的評(píng)價(jià)［J］．生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1996，28（2）:218-222

［8］黃曉蘭，閻俊，吳曉曼，等．枸杞多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠生殖細(xì)胞損傷的影響［J］．食品科學(xué)，2003，24（12）:116-118

［9］游育紅，林志彬．靈芝多糖肽的抗氧化作用［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（2）:85-88

［10］Srigiridhar K，Nair K M，Subramanian R，et al．Oralrepletion of iron induces free radical mediated alterations in the gastrointestinal tract of rat［J］．Molecular and Cellular Biochemistry，2001，219（3）:91-98

The Comparison of the Vitro Anti-oxidative Effect from Corn Pollen Polysaccharide and Fractions

LI Yun-jie，TANG Shang-wen，GUO Zhuang，YU Hai-zhong
（College of Chemical Engineering and Food Science，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，Hubei，China）

Through the vitro tests to the organization and body fluids of mice，the vitro antioxidant activity of different systems of corn pollen polysaccharide and fractions had been researched.The results showed that CPP and fractions could restrain the mouse liver tissue lipid peroxidation，and protect the liver tissue peroxide which was damaged by Fe2+and H2O2.It also could reduce mitochondria swelling.And those effects were increased with the increase of dosage of degrees.By comparison，corn pollen polysaccharide in the above role showed better results than other fractions from corn pollen polysaccharide.

corn pollen polysaccharide；fractions from corn pollen polysaccharide；vitro antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.003

2014-07-25

李云捷（1979—），女（漢），副教授，碩士，主要從事食品化學(xué)和功能食品的教學(xué)與研究。