樺褐孔菌抗氧化物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化及其活性

李孝坤，馬金菊，王浩，王振強(qiáng)，*

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475003；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

樺褐孔菌抗氧化物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化及其活性

李孝坤1，馬金菊1，王浩2，王振強(qiáng)1，*

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475003；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

通過響應(yīng)面分析對(duì)樺褐孔菌抗氧化活性成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)提取物的鐵離子還原能力（FRAP）、DPPH自由基清除能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，最佳提取工藝為料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度65%，提取溫度85℃，提取時(shí)間2.5 h。根據(jù)最佳提取工藝，得到樺褐孔菌抗氧化活性成分提取物得率為21.6%，其多酚含量為12.04 mg/g，鐵離子還原能力測(cè)試（FRAP）值為1.42 mmol/g樣品，提取物濃度為400 μg/mL時(shí)DPPH自由基清除率為78.05%。加熱實(shí)驗(yàn)表明，樺褐孔菌提取物具有一定的熱穩(wěn)定性。

響應(yīng)面法；樺褐孔菌；提取；抗氧化活性

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，是一種生于樺樹上的藥用真菌，主要分布于中國(guó)北部（黑龍江和吉林長(zhǎng)白山）、俄羅斯北部、日本北海道和北歐等地。民間廣泛用于防治消化道疾病和腫瘤（胃癌、腸癌及肝癌等）、心血管疾病、糖尿病和抗病毒等［1-2］。大量研究表明，樺褐孔菌中含有三萜類［3］、多酚類［4］、黑色素［5］和多糖［6］等活性物質(zhì)，具有很高的抗氧化活性［4-6］。通過響應(yīng)面分析對(duì)樺褐孔菌抗氧化活性成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)提取物的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

三吡啶三吖嗪（tripyridyl triazine，TPTZ）、二苯代苦味肼基自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：購(gòu)自Sigma公司；其余為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純?cè)噭?/p>

樺褐孔菌由吉林延邊自治州延吉食用菌研究所提供，粉碎、備用。

1.2儀器設(shè)備

Uvmini-1240紫外可見分光光度計(jì)：日本島津；干浴器：美國(guó)labnet；YP型電子天平：上海天平儀器廠；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LG16-W離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.3方法

1.3.1乙醇濃度對(duì)樺褐孔菌抗氧化物質(zhì)提取的影響

準(zhǔn)確稱取10.00 g樺褐孔菌，按1∶20（g/mL）的料液比加入不同濃度的乙醇，80℃回流提取3次，每次1 h，合并提取液、減壓濃縮、冷凍干燥，得粗提物干粉，于4℃冰箱中備用。

1.3.2不同料液比對(duì)提取物的得率的影響

65%乙醇不同料液比80℃回流提取3次，每次1 h，提取物經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥，得粗提物干粉。

1.3.3響應(yīng)面分析優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上選取乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度三因素進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗(yàn)，以得率和總還原力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其因素水平及結(jié)果如表3所示，重復(fù)3次。

1.3.4FRAP法總抗氧化能力的測(cè)定

采用Zoran Maksimovic等［7］方法，0.1 mL樣液（500 μg/mL）同3.0 mL FRAP工作液（0.3 mol/L pH 3.6乙酸鈉緩沖液、10 mmol/LTPTZ和20 mmol/L三氯化鐵以體積比10∶1∶1混合）混均，37℃反應(yīng)10 min，以1.0 mmol/L FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的抗氧化能力以mmol/g樣品表示。

1.3.5DPPH自由基清除能力的測(cè)定

采用Cuendet等［8］方法，0.6 mL提取液（200 μg/mL～400 μg/mL）同3.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液混均，于37℃反應(yīng)30 min，517 nm比色。DPPH自由基抑制率采用以下方程式計(jì)算。

1.3.6總還原力的測(cè)定

按照Oyaizu等［9］方法，1.0 mL提取液（250 μg/mL）加入到2.5 mL磷酸緩沖液中（0.2 mol/L，pH 6.6），然后加2.5 mL 1%六氰合鐵酸鉀K3［Fe（CN）6］，50℃水浴30 min后加2.5 mL 10%三氯乙酸，混均后1 500 r/min離心10 min，上清液2.5 mL同2.5 mL水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵混均，700 nm比色測(cè)定，以O(shè)D700表示，吸光度值越大表示其還原力越強(qiáng)。

1.3.7提取物的熱穩(wěn)定性

準(zhǔn)確量取提取物（1 mg/mL）10 mL于10 mL比色管中，在干浴器上分別于25、50、75、100℃條件加熱，試驗(yàn)結(jié)束補(bǔ)水，維持濃度不變，通過測(cè)定其FRAP值的變化評(píng)價(jià)其熱穩(wěn)定性。

1.3.8多酚含量的測(cè)定［10-11］

取1 mL（1 mg/mL）樣液加到10 mL比色管中，依次加入去離子水1 mL，福林-酚試液0.5 mL，26.7% Na2CO3溶液1.5 mL，然后用水定容至10 mL，在50℃水浴下保持10min，冷卻，在760nm下測(cè)定其吸光度，求得試樣中總酚的含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品（8 μg/mL～100 μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與分析

2.1不同乙醇濃度提取物的提取率、多酚含量、FRAP值比較

不同乙醇濃度提取物經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥，粗提物得率、多酚含量和FRAP值見表1。

表1　樺褐孔菌不同濃度乙醇提取的得率、多酚含量和FRAP值Table 1The extraction yield、polyphenol concentration、FRAP value with different ethanol concentration from Inonotus obliquus

提取溶劑的差異對(duì)提取過程、產(chǎn)物成分、提取效率等具有重要影響。由表1可以看出，不同濃度乙醇對(duì)樺褐孔菌抗氧化成分提取效果有較大的差異，65%乙醇提取效果最好，其提取物得率、多酚含量、FRAP值分別達(dá)到21.62%、12.04 mg/g和1.42 mmol/g樣品，其抗氧化能力高于其他濃度乙醇提取物。

2.2不同料液比對(duì)提取物得率的影響

65%乙醇按不同料液比回流提取，提取物經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥，粗提物得率見表2。

表2　不同料液比對(duì)得率的影響Table 2The extraction yield with different ratio of materials to solvent

提取溶液的增多有利于活性成分的充分溶出。由表2可以看出，當(dāng)料液比由1∶10（g/mL）增大到1∶20（g/mL）時(shí)，提取物得率由14.86%增加為21.62%，此后再增大料液比，得率增加緩慢，因此，料液比選擇1∶20（g/mL）。

2.3響應(yīng)面分析優(yōu)化

利用SAS 9.0軟件，以得率（%）和總還原力OD700為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度、溫度和時(shí)間三因素進(jìn)行分析，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3The experiment design and results of response surface design

抗氧化物質(zhì)得率（%）的響應(yīng)面試驗(yàn)因素方差分析見表4。

表4　得率（%）的響應(yīng)面試驗(yàn)因素方差分析Table 4Analysis of variance showed the effect of processing variables on the responses considered of Yield（%）

還原力OD700的響應(yīng)面試驗(yàn)因素方差分析見表5。

回歸方程如下：

表5　還原力OD700的響應(yīng)面試驗(yàn)因素方差分析Table 5Analysis of variance showed the effect of processing variables on the responses considered of reducing power OD700

由表3及回歸分析可得到最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度65%、提取溫度85℃、提取時(shí)間2.5 h，模型預(yù)測(cè)提取物得率和總抗氧化力OD700分別為21.5%和0.685，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得率和總抗氧化力OD700分別達(dá)到21.6%和0.692。由表4、表5可知，回歸方程擬合度較好，能較好地反映試驗(yàn)各因素對(duì)得率和還原力的影響。根據(jù)回歸方程，乙醇濃度（X1）、溫度（X2）、時(shí)間（X3）對(duì)得率和總還原力OD700的響應(yīng)面分析如圖1、圖2、圖3所示。

圖1　乙醇濃度和溫度對(duì)得率和總抗氧化力OD700的優(yōu)化曲線圖Fig.1Contour optimizer plot of yield and total reducing power OD700，ethanol concentration（X1）and temperature（X2）

通過分析可知乙醇濃度（X1）對(duì)得率和總還原力OD700的影響趨勢(shì)一致，65%乙醇的提取物得率和提取物的抗氧化活性都最高，明顯優(yōu)于55%和75%乙醇的提取效果。溫度（X2）的增高和時(shí)間（X3）的延長(zhǎng)有利于活性成分的溶出，但高溫可能會(huì)造成提取物抗氧化成分的損失，從而造成其抗氧化活性的降低。

圖2　乙醇濃度和時(shí)間對(duì)得率和總抗氧化力OD700的優(yōu)化曲線圖Fig.2Contour optimizer plot of yield and total reducing power OD700，ethanol concentration（X1）and time（X3）

圖3　溫度和時(shí)間對(duì)得率和總抗氧化力OD700的優(yōu)化曲線圖Fig.3Contour optimizer plot of yield and total reducing power OD700，temperature（X2）and time（X3）

2.3提取物的抗氧化活性研究

提取物的抗氧化活性如表6所示。

表6　提取物的DPPH清除能力Table 6DPPH radical scavenging percentage of extracts

樺褐孔菌抗氧化活性成分提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，提取物濃度為400 μg/mL時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到78.05%。

2.4提取物的熱穩(wěn)定性

提取物（1 mg/mL）在干浴器中分別于25、50、75、 100℃條件下加熱，其熱穩(wěn)定性如圖4所示。

圖4　提取物的FRAP熱穩(wěn)定性Fig.4Heating-stability of extracts to different temperature evaluated by FRAP

在前15 min，提取物在不同處理溫度條件下的FRAP值未發(fā)生明顯變化，即其鐵離子還原能力未發(fā)生明顯損失。100℃加熱60 min和120 min其鐵離子還原能力仍能保留78%和64%以上。

2.5提取物多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)關(guān)系

樺褐孔菌不同乙醇濃度提取物的多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性關(guān)系如表7所示。

表7　多酚含量與FRAP值和DPPH自由基清除能力的相關(guān)性Table 7The correlation between the contents of polyphenol and FRAP value，DPPH radical scavenging percentage

多酚含量與FRAP值的相關(guān)性最高達(dá)到0.861 2，與DPPH自由基清除能力的相關(guān)性也達(dá)到了0.839 5，顯示樺褐孔菌乙醇提取物中的多酚物質(zhì)可能是其表現(xiàn)抗氧化活性的主要原因之一，這與Yong Cui［4］等的報(bào)道一致。

3結(jié)論

通過響應(yīng)面分析對(duì)樺褐孔菌抗氧化活性成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取工藝為料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度65%，提取溫度85℃，提取時(shí)間2.5 h，在此條件下得率為21.6%，多酚含量為12.04 mg/g。

提取物鐵離子還原能力（FRAP）、DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)表明：樺褐孔菌提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，鐵離子還原能力測(cè)試（FRAP）值為1.42 mmol/g樣品，提取物濃度為400 μg/mL時(shí)DPPH自由基清除率為78.05%。

［1］陳慶敏，傅茂潤(rùn)，王慶國(guó).鳳尾蘭中抗果蔬病原菌成分的提取工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23（1）:268-271

［2］Yusoo Shin，Yutaka Tamai，Minoru Terazawa.Chemical constituents of Inonotus obliquus，a new triterpene，21，24-cyclopentalanosta-3β，21，25-triol-8-ene from sclerotium［J］.The Japan Wood Research Society，2001，47:313-316

［3］Yong Cui，Dong-Seok Kim，Kyoung-Chan Park.Antioxidant effect of Inonotus obliquus［J］.Journal of Ethnopharmacology，2005，96:79-85

［4］董周永，胡青霞，郭松年，等.石榴果皮中抑菌活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（3）:274-277

［5］Yong Ook Kim，Hae Woong Park，Jong Hoon Kim，et al.Anti-cancer effect and structural characterization of endo-polysacchride from cultivated mycelia of Inonotus obliquus［J］.Life science，2006，79:72-80

［6］Song HS，Lee YJ，Kim SK，et al.Downregulatory effect of AGI-1120（α-glucosidase inhibitor）and Chaga mushoom（Inonotus obliquus）on clluar nfκb activation and their antioxidant activity［J］.Korean Jpharmacogen，2004，35:92-97

［7］姚勇芳，連曉蔚，朱美娟，等.溪黃草中抑菌物質(zhì)的提取及抑菌效果的研究［J］.食品科技，2008，35（1）:191-193

［8］Zoran Maksimovic，Dorde Malencic，Nada Kovacevc.Polyphenol contents and antioxidant activity of Maydis stigma extracts［J］.Bioresource Technology，2005，96:873-877

［9］Cuendet M，Hostettmann K，Potterat O.Iridoid glucosides with free radical scavenging properties from Fagraea blumei［J］.Helvetica Chimical Acta，1997，80:1144-1152

［10］Oyaizu M.Studies on products of browning reaction:antioxidative activity of products of browning reaction［J］.Jpn J Nutr，1986，40: 307-315

［11］Skerget，Merike Vaher，Anne Orav，et al.Phenols，proanthocyanidins，flavones and flavonols in some plant materials and their antioxidant activities［J］.Food Chemistry，2005，89:191-198

［12］凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:5

Optimization of Extraction of Antioxidants from Inonotus obliquus and Its Antioxidant Activities

LI Xiao-kun1，MA Jin-ju1，WANG Hao2，WANG Zhen-qiang1，*
（1.Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475003，Henan，China；2.Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The extracting technology of crude antioxidants from Inonotus obliquus was studied and response surface methodology（RSM）was applied to optimize the process.And antioxidant activities of extracts from Inonotus obliquus were evaluated by FRAP assay and DPPH radical scavenging capacity.The optimal extracting conditions were ratio of materials to solvent 1∶20（g/mL），concentration of ethanol 65%，extraction temperature 85℃and extraction time 2.5 h.Under these conditions，extraction yield of antioxidants was 21.6%，12.04 mg/g polyphenol could be obtained.The Inonotus obliquus extracts had a strong antioxidant activity，the FRAP value，DPPH radical scavenging capacity with a concentration of 400 μg/mL were 1.42 mmol/g sample（FeSO4·7H2O equivalents）and 78.05%，respectively.Characterization of the Inonotus obliquus extracts antioxidants proved that those antioxidants were heat-resistant.

response surface methodology（RSM）；Inonotus obliquus；extraction；antioxidant activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.013

2014-12-24

李孝坤（1982—），男（漢），講師，碩士，主要從事化學(xué)檢測(cè)分析教學(xué)與研究。

王振強(qiáng)（1979—），男（漢），講師，碩士，主要從事食品檢測(cè)分析教學(xué)與研究。