HPLC法測定芹菜中綠原酸和芹菜苷的含量

龔金炎，石嘉琦，章佳盈，陳麗春，毛建衛(wèi)，陳峰

（1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029；3.紹興市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江紹興312000；4.美國克萊姆森大學(xué)食品、營養(yǎng)與包裝系，南卡羅來納州克萊姆森USA 29634）

HPLC法測定芹菜中綠原酸和芹菜苷的含量

龔金炎1，2，3，石嘉琦1，章佳盈1，陳麗春1，毛建衛(wèi)1，陳峰4

（1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029；3.紹興市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江紹興312000；4.美國克萊姆森大學(xué)食品、營養(yǎng)與包裝系，南卡羅來納州克萊姆森USA 29634）

建立芹菜中綠原酸和芹菜苷的HPLC測定方法。測定3個不同產(chǎn)地的芹菜葉和莖中的綠原酸和芹菜苷含量。采用Luna C18ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-1%乙酸溶液梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：330 nm。綠原酸和芹菜苷分別在0.51 μg/mL～102 μg/mL（R2=0.999 9）和0.505 μg/mL～101 μg/mL（R2=0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率分別為98.90%和97.83%，RSD分別為0.87%和0.39%。經(jīng)測定芹菜中綠原酸和芹菜苷的含量分別在0.268 mg/g～1.712 mg/g和1.802 mg/g～63.870 mg/g之間。

芹菜；綠原酸；芹菜苷；高效液相色譜

芹菜（Apium graveolens L.）別名芹、藥芹，傘形科，一年或多年生草本植物。芹菜是我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｊ秤玫囊环N蔬菜，古代本草已記載其具有“補(bǔ)血、祛風(fēng)、健脾利濕”的作用和一定的藥用保健功能，因而人們稱之為“廚房里的藥物”。

芹菜莖葉中含有芹菜素、木犀草素、芹菜苷、綠原酸等活性成分［1-3］，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌癥、抗衰老、抗高血壓、抗高血脂及預(yù)防心血管疾病等多種藥理作用［1-5］。目前芹菜的食用部位主要集中在莖上，對葉的研究和資源化利用較少。在食用芹菜莖的同時，每年都會有大量的芹菜葉被丟棄，不僅造成了極大的資源浪費，而且還對環(huán)境造成污染。芹菜中黃酮類物質(zhì)主要是芹菜素，以芹菜苷的形式存在為主［3］。綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，是許多中草藥如金銀花、杜仲、淡竹葉等的主要有效成分之一，也是眾多水果蔬菜中的重要活性成分［6-8］。本文通過對芹菜莖葉中綠原酸和芹菜苷分析研究，了解其在芹菜莖葉中的分布，為我國芹菜資源產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、環(huán)境、社會效益協(xié)同發(fā)展做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

芹菜樣品：由中澳合資亞寶（興化）有限公司提供的脫水芹菜葉和莖，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，于60℃烘箱恒溫干燥4 h；色譜級甲醇：天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；色譜級乙腈：西班牙薩勞（Scharlau）有限公司；芹菜苷（純度≥98%）：上海永恒生物科技有限公司（批號：20110908）；綠原酸（純度≥98%）：上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；優(yōu)級純乙酸：上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：美國Waters 2695，配置Waters PDA 2489檢測器；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗器、過濾器：天津奧特賽思斯儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；中藥粉碎機(jī)：上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司；循環(huán)水式多用真空泵：杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司；XMTA-6000數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海葉拓儀器儀表有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：LunaC18ODS（4.6mm×250 mm，5μm）。流動相：A為乙腈；B為1%乙酸水溶液（體積比）。洗脫條件：0 min～7 min時，A 15%，B 85%；7 min～25 min時，A 15%～25%，B 85%～75%；25min～30 min時，A 25%～15%，B 75%～85%。流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；檢測波長：330 nm。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

準(zhǔn)確稱取5.05 mg芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)品，置10 mL容量瓶中，用色譜級甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得505 μg/mL芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

準(zhǔn)確稱取51.0 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，置100 mL容量瓶中，用色譜級甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得510 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

1.3.3樣品溶液的制備

精密稱取不同產(chǎn)地已粉碎的芹菜樣品約1 g，置于平底燒瓶中，加入甲醇100 mL，70℃恒溫水浴回流2 h后，移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，置于進(jìn)樣瓶中即為供試品溶液。

2結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系考察

分別精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，以色譜級甲醇為溶劑，配制成綠原酸和芹菜苷濃度分別為102.00 μg/mL和101.00 μg/mL的混標(biāo)溶液，并依次稀釋2、8、32、100、200倍。按照1.3.1色譜條件進(jìn)行檢測，分別進(jìn)樣五次，記錄各樣品色譜峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)（μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。得到綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=27 758X-20 448，R2=0.999 9，芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=2 866X+ 1 595.2，R2=0.999 8。結(jié)果表明，綠原酸和芹菜苷在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適用于定量分析。

2.2精密度試驗

取綠原酸濃度為51.00 μg/mL和芹菜苷濃度為50.50 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.3.1色譜條件進(jìn)行檢測，分別進(jìn)樣5次，記錄各樣品色譜峰面積。分別計算綠原酸和芹菜苷色譜峰峰面積RSD，結(jié)果綠原酸和芹菜苷的精密度分別為0.49%和0.15%，表明具有良好的精密度。

2.3穩(wěn)定性試驗

取適量的河南芹菜莖樣品溶液，在室溫下分別放置0、4、8、16、24 h，按照1.3.1色譜條件進(jìn)行檢測，記錄各樣品色譜峰面積。結(jié)果綠原酸和芹菜苷的RSD分別為0.85%和0.14%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4重復(fù)性試驗

取適量的河南芹菜莖樣品溶液，按照1.3.1色譜條件進(jìn)行檢測，記錄各樣品色譜峰面積。結(jié)果顯示樣品中綠原酸平均含量0.96 mg/g，RSD=0.11%，芹菜苷平均含量8.50 mg/g，RSD=0.96%，說明供試品溶液重復(fù)性好。

2.5加樣回收率試驗

準(zhǔn)確稱取河南芹菜莖樣品1 g，平行6組，3組為空白，另3組分別加入綠原酸濃度為1.02 μg/mL和芹菜苷濃度為2.53 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，按照1.3.3樣品溶液的制備方法進(jìn)行樣品溶液制備；按照1.3.1色譜條件進(jìn)行檢測，記錄各樣品色譜峰面積，重復(fù)測定3次。結(jié)果顯示樣品中綠原酸平均回收率98.90%，RSD=0.87%，芹菜苷平均回收率97.83%，RSD=0.39%，說明本方法測定綠原酸和芹菜苷具有良好的回收率。

2.6樣品測定

分別取不同供試品溶液，按照1.3.1色譜條件進(jìn)行檢測，記錄各樣品色譜峰面積，并用外標(biāo)法計算其含量，結(jié)果見圖1和表1。

圖1　綠原酸、芹菜苷的HPLC標(biāo)準(zhǔn)圖譜和樣品HPLC圖譜Fig.1The HPLC chromatograms of chlorogenic acid，apiin and celery

3結(jié)論

建立HPLC方法測定芹菜中綠原酸和芹菜苷的含量，可獲得較好的分離和檢測效果，可用于芹菜及其提取物的質(zhì)量研究控制。

不同產(chǎn)地芹菜中的綠原酸和芹菜苷的含量有較大差異。其中，江蘇興化產(chǎn)芹菜葉中芹菜苷含量最高，浙江麗水產(chǎn)芹菜莖中芹菜苷含量最低，河南洛陽產(chǎn)芹菜葉中綠原酸含量最高，浙江麗水產(chǎn)芹菜莖中綠原酸含量最低；芹菜葉和芹菜莖中的綠原酸和芹菜苷的含量也有較大差異，芹菜葉中綠原酸和芹菜苷的含量普遍高于芹菜莖中二者的含量；芹菜葉中芹菜苷是芹菜莖中的3.51倍～4.86倍，芹菜葉中綠原酸是芹菜莖中的1.79倍～4.31倍。

表1　不同產(chǎn)地芹菜中樣品中綠原酸和芹菜苷的含量（mg/g）Table 1Determination of chlorogenic acid and apiin in different place celery（mg/g）

［1］Han D，Row KH.Determination of luteolin and apigenin in celery using ultrasonic-assisted extraction based on aqueous solution of ionic liquid coupled with HPLC quantification［J］.J Sci Food Agric，2011，91（15）:2888-2892

［2］Zhang Q，Zhou MM，Chen PL，et al.Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis for the extraction of luteolin and apigenin from celery［J］.J Food Sci，2011，76（5）:680-685

［3］易建華，朱振寶．響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取芹菜黃酮工藝研究［J］．食品科學(xué)，2009，30（10）:92-96

［4］吳韶梅，哈婧，劉小爭，等．芹菜葉提取物抗氧化作用研究［J］．食品科學(xué)，2010，31（9）:103-105

［5］賈佳，謝靜莉，許學(xué)書．芹菜苷體外活性的研究［J］．食品科學(xué)，2008，29（12）:99-101

［6］杜延兵，裘愛泳．綠原酸生物活性、資源及其提取純化［J］．現(xiàn)代食品科技，2006，22（2）:250-252

［7］龔金炎，吳曉琴，張英．RP-HPLC法同步檢測竹葉提取物中4種黃酮和4種酚酸成分［J］．中草藥，2010，41（1）:63-65

［8］張英，龔金炎，吳曉琴．竹葉黃酮最新研究進(jìn)展之一——竹葉黃酮制劑中酚酸類化合物的存在及其作用［J］．中國食品添加劑，2009（4）:46-53

Determination of Chlorogenic Acid and Apiin in Celery by HPLC

GONG Jin-yan1，2，3，SHI Jia-qi1，ZHANG Jia-ying1，CHEN Li-chun1，MAO Jian-wei1，CHEN Feng4
（1.Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Produces，School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，Zhejiang，China；3.Shaoxing Testing Institute of Quality Technical Supervision，Shaoxing 312000，Zhejiang，China；4.Department of Food，Nutrition and Packaging Sciences，Clemson University，Clemson USA29634
South Carolina，America）

A simple and rapid method was developed for determination of chlorogenic acid and apiin in celery by HPLC.HPLC method was used with Luna C18ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）column.The mobile phase was acetonitrile-1%acetic acid solution with 1.0 mL/min flow rate；the column temperature was 30℃and the detection wavelength was set at 330 nm.The calibration curve of chlorogenic acid and apiin were linear in the range of 0.510 μg/mL-102 μg/mL（R2=0.999 9）and 0.505 μg/mL-101 μg/mL（R2=0.999 8），respectively.The linearity the average recovery was 98.90%and 97.83%，RSD were 0.87%and 0.39%.The content of chlorogenic acid and apiin were 0.268 mg/g to 1.712 mg/g and 1.802 mg/g to 63.870 mg/g in several kinds of celery，respectively.

celery；chlorogenic acid；apiin；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.030

2014-05-12

國家自然科學(xué)基金資助項目（31240054）；國家十二五科技支撐計劃資助項目（2011BAD23B02）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LQ13C200006，LY14C200007）；浙江省科技計劃資助項目（2012C22026）；浙江省重點科技創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目（2009R09028-12）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃項目（2013R415015，2014R415021）；浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物技術(shù)加工重點實驗室開放基金（2013KF0305）

龔金炎（1982—），男（漢），副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物與功能性食品的研究與開發(fā)。