輕揉推拿法對兔骨骼肌急性鈍挫傷后肌球蛋白重鏈和膠原表達的影響

張嬋娟　成羿　董學亮

輕揉推拿法對兔骨骼肌急性鈍挫傷后肌球蛋白重鏈和膠原表達的影響

張嬋娟成羿董學亮

目的 通過應用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術分析內源性Ⅱb型肌球蛋白重鏈及Ⅲ型膠原mRNA的表達來探討輕柔推拿法對骨骼肌鈍挫傷修復的作用及其可能機制。方法 27只實驗兔中24只實施后腿腓腸肌自由落體致傷，建立實驗模型后分為推拿組、外傷對照組，每組12只，另取3只作為正常對照組。采用“重物自由落體致傷法”制作大白兔骨骼肌急性鈍挫傷模型。分別在3d、10d、20d、27d處死大白兔，每組每個時間點處死3只兔子，每只兔子在兩條后腿腓腸肌取標本，共計6個標本。結果 RT-PCR技術檢測內源性Ⅱb型主要組織相容性復合體（MHC）mRNA，第3天推拿組與外傷組比較差異無統計學意義（P＞0.05），第10天推拿組與外傷組比較差異有統計學意義（P＜0.05），第20天、27天推拿組表達量比外傷組表達高（P＜0.05）。RT-PCR技術檢測內源性I型膠原mRNA的表達量：第3天、10天外傷組與推拿組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。第20天推拿組表達量低于外傷組（P＜0.05）。RT-PCR技術檢測內源性Ⅲ型膠原mRNA的表達量：第3天推拿組與外傷組比較差異無統計學意義（P＞0.05），第10天、20天、27天推拿組表達量低于外傷組（P＜0.05）。結論 輕揉推拿法在骨骼肌急性鈍挫傷修復中晚期能有效促進Ⅱb型MHC內源性mRNA表達升高，從而促進新骨骼肌生成。輕揉推拿法在骨骼肌急性鈍挫傷修復中晚期能有效降低I及Ⅲ型膠原內源性mRNA過高表達，從而減緩骨骼肌內纖維化過程的發生，改善骨骼肌愈合質量。

輕柔推拿法 骨骼肌 Ⅱb型MHC I型膠原 Ⅲ型膠原

傳統的中醫推拿治療骨骼肌損傷有著獨特的療效，如何采用實驗研究支持和詮釋臨床療效。本實驗是模仿臨床中醫推拿療法，對兔子腓腸肌鈍挫傷進行的治療研究，通過應用RT-PCR技術對Ⅱb型主要組織相容性復合體（MHC）、I 型膠原、Ⅲ 型膠原mRNA的測定，來了解推拿療法對骨骼肌損傷修復的進程和質量，探討推拿療法對骨骼肌修復的可能機制。

1　材料與方法

1.1動物與儀器 （1）實驗動物：中國大白兔27只，平均體重（2.5±0.2）kg，雌雄各半，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。飼養及取標本皆在該中心完成。（2）主要儀器：Quantity One全自動凝膠圖象分析系統（Bio-Rad公司，美國）。eppendorf centrifuge 5418高速離心機（德國）。HITACHI H-7650透射電鏡（日本電子公司）。BioRad-iCycler M367999型 PCR擴增儀（Bio-Rad公司，美國）。美國Labnet Gel XL Ultra V-2電泳儀（上海）。Quantity One凝膠圖象處理系統（Bio-Rad公司，美國）。Nanodrop ND-1000，ND-2000超微量核酸蛋白測定儀（北京）。Heraeus高速臺式冷凍離心機（德國）。DK-8D型 電熱恒溫水槽（上海）。AEL-200電子天平（日本島津公司）。（3）實驗材料：兔解剖臺、電動剃毛刀、自制1m高木架臺、3m卷尺、1000g打擊棒（直徑2cm）、塑料管（直徑2.2cm）。

1.2分組與造模 27只實驗兔中24只實施后腿腓腸肌自由落體致傷，建立實驗模型后分為推拿組和外傷對照組，每組12只，另取3只作為正常對照組。依據觀察的時間點，推拿組和外傷對照組再分為4小組，每組3只。參照張靜等［1］的模型，并稍加改進。造模過程：將日本大耳白兔俯臥位固定在解剖臺上，在雙后肢褪毛，利用重力棒選定腓腸肌肌腹中段作為落體擊落目標（距跟骨6.5cm處）。將打擊棒放于塑料管中，管下口垂直對準打擊部位，重物自由落體下落導致一次打擊傷，造成腓腸肌急性挫傷模型。打擊物重1000g，下落高度50cm，重力為9.8N，動能為4.9J，打擊面積約3.14cm2。

1.3實驗動物的處理 造模成功后分別在第3、10、20、27天處死實驗兔取標本。推拿組：傷后第3天開始推拿，10～20min/d。推拿方法：在兔小腿三頭肌處采用化瘀止痛輕揉手法。先用輕推法，以大拇指指端著力于跟腱，向腘窩方向進行直線推移。頻率20次/ min，持續5min。再用拇指揉法，持續5min，頻率為60～80次/min。最后用擦法，即用手掌的大魚際做跟腱與腘窩間的來回摩擦，頻率80～100次/min，持續5min。外傷對照組：僅予紗布包扎傷處。

1.4觀察指標 在動物損傷后第3、10、20、27天，采用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注入（40mg/kg）將實驗兔麻醉后取下雙側腓腸肌損傷區域肌肉，貯于-80℃冰箱保存。采用半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）分析Ⅱb型MHC、I型及Ⅲ型膠原mRNA的表達。

1.5引物設計與合成 檢索 NCB I GenBank數據庫中Ⅱb型MHC、I型膠原、Ⅲ型膠原全長 mRNA序列，應用PrimerⅡ premier5.0軟件設計出Ⅱb型MHC、I型膠原、Ⅲ型膠基因以及內參GAPDH基因的上下游引物序列。引物均由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，三組的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1推拿對修復過程中骨骼肌Ⅱb型MHC蛋白表達的影響 見表1。

表1?、騜型MHC的mRNA含量同一時間點內比較（x±s）

2.2推拿對修復過程中骨骼?、裥湍z原蛋白表達的影響 見表2。

表2　Ⅰ型膠原的mRNA含量同一時間點內比較（x±s）

2.3推拿對修復過程中骨骼?、笮湍z原蛋白表達的影響 見表3。

表3?、笮湍z原的mRNA含量同一時間點內比較（x±s）

3　討論

在日常生活、施工建設、交通事故和競技運動中，骨骼肌損傷是常見多發病。骨骼肌損傷恢復時間長，愈合質量不可靠，容易反復再傷，延續數年，直至肌肉變性和瘢痕形成。長期疼痛和肌肉彈性減弱可影響日常生活，運動員因此而喪失運動能力。推拿是我國傳統醫學的重要組成部分，也是中醫的一大特色，其基本功效在于活血化瘀、通絡舒筋、消腫止痛，從而使氣行則血行，血活則瘀去，瘀去則生新，損傷的組織即可得到修復。推拿治療骨骼肌損傷臨床上具有顯著療效，故該治療方法應用于運動員更具優勢。

骨骼肌挫傷修復表現為一個動態過程，這個過程反映了組織對于創傷以及鍛煉等各種超負荷狀態的適應能力。所有這些情況導致了一系列病理變化的發生，包括肌纖維再生和膠原合成。創傷的反應過程是有規律的，調節和控制這一系列過程的分子機制已成為當前研究的熱點。骨骼肌挫傷修復所表現的肌纖維壞死凋亡和再生及膠原合成，這兩個過程相互支持同時又相互競爭制約，共同影響骨骼肌挫傷后修復的質量［2］。骨骼肌損傷會累及肌纖維、間質連接組織及血管。斷裂的肌纖維向兩端收縮而使肌纖維殘端之間出現腔隙，該腔隙較快被血腫填充。血腫又逐漸被增殖的成纖維細胞及細胞外基質成分所取代，以保證連接組織的完整性，此過程是瘢痕形成的過程。同時，骨骼肌細胞也進行增殖而企圖將兩殘端連接起來，此過程是骨骼肌再生的過程。以往資料多從挫傷肌肉形態結構變化、有氧代謝酶活性、血液中致痛物質變化方面探討治療肌肉損傷的作用機制，不能充分反映骨骼肌挫傷后愈合的過程和質量，且推拿對骨骼肌損傷治療作用的基礎研究較少。本實驗采用RT-PCR技術，觀察骨骼肌鈍挫傷后推拿對骨骼肌挫傷修復過程中不同時間點成肌標志物及瘢痕形成標志物表達的影響，可了解骨骼肌損傷治療后，成肌細胞增生、肌球蛋白變化和瘢痕組織形成情況，從而判斷推拿在促進骨骼肌功能性恢復，減少瘢痕組織，優化骨骼肌收縮結構功能方面的作用。探討推拿手法促進骨骼肌鈍挫傷愈合的療效和可能機制。

肌球蛋白重鏈是骨骼肌纖維中最重要的肌原纖維蛋白之一。其使肌纖維收縮產生能量，含有與肌肉收縮速度有關的酶活性，維持肌細胞結構的完整性。在嚙齒動物中已證實了幾種成年型肌球蛋白的異構體：Ⅰ型MHC存在于Ⅰ型慢肌纖維中，Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb型MHC分別存在于ⅡA、ⅡX、ⅡB型快肌纖維中。肌肉中的MHC類型對肌肉生理至關重要。而膠原作為肌細胞外成分之一，是結締組織的主要蛋白成分，在細胞的發生、發育以及整個生命周期中起著重要作用［3，4］。依據分子組成的不同，目前發現的膠原至少有15種類型。Ⅰ型膠原主要存在于骨、肌腱、牙釉質及皮膚中；Ⅲ型膠原主要存在于皮膚、血管、子宮內膜等組織發生的早期；有些組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原可同時存在，如骨骼肌組織同時含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原，其中Ⅰ、Ⅲ 型膠原含量最豐富。正常骨骼肌的Ⅰ型與Ⅲ 型膠原主要位于肌內膜與肌束膜處，Ⅰ型膠原形成致密的長束狀，而Ⅲ型膠原形成疏松的網狀，故彈性與抗應力性均較好。完全由Ⅰ型膠原組成的組織（如肌腱組織）則幾乎無彈性［5，6］。在骨骼肌組織中，膠原作為其組織連接的主要結構成分具有重要功能：其形成原纖維使骨骼肌細胞彼此相連，也使骨骼肌細胞與肌腱、筋膜組織相連接；另外，其對肌肉細胞、毛細血管及神經有支持作用，還與肌肉的機械性質及粘彈性有關。因此，Ⅱb型肌球蛋白重鏈及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是骨骼肌損傷后修復研究中極有價值的指標。

本實驗結果顯示推拿能有效促進骨骼肌再生，與外傷對照組比較，在骨骼肌損傷的中晚期其能使MHC-Ⅱb mRNA 表達水平明顯提高（P＜0.05）。同時還顯示推拿治療后，骨骼肌修復組織的Collagen-Ⅲ與Collagen-I 的 mRNA 表達水平升幅比外傷對照組低，提示該治療方法亦能減緩纖維化過程的發生。作者認為推拿能抑制膠原的表達可能是通過促進肌細胞大量再生而抑制了瘢痕組織的形成有關，也許還存在其它機制，有待進一步的探討。

推拿能促進骨骼肌鈍挫傷后的肌肉再生和抑制瘢痕組織的形成，這似乎有利于骨骼肌組織的功能修復。作者的前期工作已經表明，推拿可以促進骨骼肌損傷后肌肉形態與結構的恢復。但是，由于組織功能的執行者是蛋白質，而從 mRNA 到蛋白質還需要一個翻譯的過程。因此，作者還需了解 MHC-Ⅱb、Collagen-Ⅲ 及 Collagen-I 在骨骼肌鈍挫傷修復過程中蛋白水平及其它相關指標，對推拿在骨骼肌損傷后修復過程中的作用才能作進一步的了解和客觀評價。

1張靜，趙斌.按摩對兔骨骼肌挫傷后修復作用的研究.河北師范大學學報，2003，15（1）：106.

2朱文輝，陳世益.肌球蛋白重鏈及I、Ⅲ 型膠原在骨骼肌損傷修復中的作用.中國運動醫學雜志，2002，21（2）：179～182.

3Guillermo H. Graziotti， Clara M. Ríos，José-Luis L. Evidence for Three Fast Myosin Heavy Chain Isoforms in Type Ⅱ Skeletal Muscle Fibers in the Adult Llama. Journal of Histochemistry & Cytochemist ry，2001，49：1033～1044.

4Devor ST， White TP. Myosin heavy chain phenotype in regenerating skeletal muscle is affected by thyroid hormone. Med Sci Sports Exerc，1995，27（5）：674～681.

5Ellen M. Arruda， Kevin Mundy， Sarah Calve， et al. Denervation does not change the ratio of collagen I and collagen Ⅲ mRNA in the extracellular matrix of muscle. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol，2007，292： R983～R987.

6K. M. Heinemeier，J. L. Olesen，F. Haddad，et al. Effect of unloading followed by reloading on expression of collagen and related growth factors in rat tendon and muscle.J Appl Physiol，2009，106（1）： 178～186.

Objective To study the function of massage in recovery from blunt skeletal muscular contusion and its possible mechanism by using reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） technology to detect the endogenous Ⅱb MHC，I and Ⅲ collagen mRNA expression. Method 27 rabbits were randomly divided into the massage group，the trauma comparison group，each with 12 rabbits，and the normal comparison group with the other 3 rabbits. The model of the rabbits’ acute blunt skeletal muscular contusion is made by using the “blow of heavy weight free falling”. Three rabbits from each group were put to death at each time point on the 3rd day，the 10th day，the 20th day and the 27th day，with two hind gastrocnemius muscles of each rabbit taken as specimens，6 specimens in total each time. Results By using the RT-PCR technology to detect endogenous Ⅱb MHC mRNA，it showed no statistical significance to compare the massage group on the 3rd day with the trauma comparison group； it was statistically rewarding to compare the massage group with the trauma comparison group on the 10th day （P＜0.05）. Besides，the expression levels of the massage group on the 20th and 27th days were higher than those of the trauma comparison group，which was statistically rewarding （P＜0.05）. By using the RT-PCR technology to detect the expression level of endogenous I collagen mRNA，it was not rewarding statistically to compare the trauma comparison group with the massage group on the 3rd and 10th days. The expression level of the massage group on the 20th day was lower than that of the trauma comparison group （P＜0.05）. By using the RT-PCR technology to detect the expression level of endogenous Ⅲ collagen mRNA，it was not rewarding statistically to compare the massage group with the trauma comparison group on the 3rd day. The expression levels of the massage group on the 10th，20th and 27th days were lower than those of the trauma comparison group （P＜0.05）.Conclusions Firstly，the massage at the intermediate and late stages of the acute blunt skeletal muscle contusion can effectively raise the Ⅱb MHC endogenous mRNA expression. Secondly，massage at the intermediate and late stages of the recovery of acute blunt skeletal muscle contusion can effectively reduce the over-expression of I，Ⅲ collagen endogenous mRNA，thus improving the healing quality of skeletal muscles.

The effects of gentle massage Skeletal muscle Ⅱb MHC I collagen Ⅲ collagen

浙江省科技計劃項目（2009C33100）

310007 杭州市中醫院