結腸癌患者血清中microRNA-31的表達和臨床意義

袁政　陳昭華　王亞南*

結腸癌患者血清中microRNA-31的表達和臨床意義

袁政陳昭華王亞南*

目的 探討miR-31在結腸癌患者血清中的表達及臨床意義。方法 采用熒光定量 PCR（SYBR Green）法檢測結腸癌患者（60例）和正常對照組（60例）血清中miR-31的表達。結果 miR-31在結腸癌血清中的相對表達量為（4.83±0.46），與正常對照組血清中miR-31的表達量（1.010±0.12）比較，其差異有顯著性（P＜0.01）；受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示，以miR-31相對表達量4.62為臨界點時，血清miR-31診斷結腸癌的敏感性為83.4%，特異性為85.6%。血清miR-31在淋巴結有轉移組的相對表達量為（5.22±0.42），在淋巴結無轉移組中為（3.96±0.13），差異有顯著性（P＜0.01）；血清miR-31在高分化、中分化、低分化結腸癌血清中的表達水平差異有統計學意義（P＜0.05），隨著分化程度的降低血清miR-31的表達增高。結論 miR-31能作為一種新的生物標志物用于結腸癌病情的輔助診斷。

結腸癌 miR-31 Real-time PCR

結腸癌是對人類健康極大危害的最常見惡性腫瘤之一，近年來發病率和病死率呈逐年增高的趨勢［1］，microRNA（miRNA，miR）是一類非編碼小RNA分子，通常在轉錄后水平調控基因表達［2］。miRNA的異常表達將對細胞的正常周期和生理過程產生影響而引起結腸癌的發生。有研究報道，miR-31的表達與結腸癌有相關性［3，4］，結腸癌組織中miR-31的表達增高。人類血清中的miRNAs不被內源性RNase酶分解，以非常穩定的形式存在血清中［5］，血液標本獲取簡便，故檢測血清中miRNA診斷結腸癌及判斷預后更適于臨床應用。本文采用Real-time PCR技術檢測miR-31在結腸癌血清中的表達情況，研究其與各臨床病理參數之間的關系，探索miR-31在結腸癌中的表達和臨床意義。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集蘇州市立醫院（本部）2011年6月至2012年10月60例住院的結腸癌患者，其中男28例，女32例；平均年齡62.2歲。均未經任何手術治療以及放、化療，均經病理檢查確診。健康對照組60例，為本院2012年1月至2012年3月的健康體檢者。本項目經過本院倫理委員會同意并簽署患者知情同意書。結腸癌患者手術前和術后第3天采集血液，使用一次性真空采血管（惰性分離膠促凝管），采集受試者外周血標本5 ml，分離血清，吸取 1 ml 血清于1.5 ml離心管中，將血清11000r/min離心10min后將上清液置入新的離心管中，置-80℃低溫保存。

1.2材料與試劑 （1）主要試劑：天根TRNzol-A+總RNA提取試劑，miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green），Rnase Free ddH2O。（2）Forward引物合成：由天根有限公司設計合成（引物序列暫不提供）。Reverse引物（天根miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒配套）提供。

1.3儀器與設備 LifePro普通PCR儀（博日科技），PCR System7500擴增儀（美國ABI公司），Eppendof高速冷凍離心機（德國Eppendof公司），超低溫冰箱，生物安全柜（上海瑞仰）。

1.4試驗方法 （1）血清中總RNA的提取：吸取血清250μl，Trizol液750μl于2ml離心管中，震蕩混勻。加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。4℃，12000r/min，離心10min，樣品分成3層：黃色有機相、中間蛋白層和無色水相層，RNA主要在水相中，將水相轉移至新離心管中。加入等體積異丙醇，4℃，12000r/min，離心10min，棄去液體。加入1000μl 75%酒精（用RNase-Free ddH2O配置）洗滌沉淀，4℃，5000r/min，離心3min，棄去液體。將離心管置于超凈臺上，室溫放置晾干。向離心管中加入50μl RNase-free ddH2O，吹打，混勻，充分溶解RNA。測定總RNA的吸光度（A）值，A260/ A280比值在 1.8～2.2。（2）miRNA 3'末端進行加Poly（A）處理：反應體系共20μl：Total RNA 2μl，E.coli Poly（A）Polymerase（5 U/μl）0.4μl，10×Poly（A）Polymerase Buffer 2μl，5×rATP Solution 4μl，RNase-Free ddH2O 11.6μl。緩慢混勻上述配制的反應液，短暫離心后于37℃反應60 min。（3）Poly（A）修飾的miRNA的逆轉錄反應：反應體系共20μl： Poly（A）反應液2μl，10×RT Primer 2μl，10×RT buffer 2μl，Super pure dNTPs（2.5nM）1μl，RNasin（40 U/μl）1μl，Quant RTase 0.5μl，RNase-Free ddH2O 11.5μl。緩慢混勻上述配制的反應液，短暫離心后于37℃反應60min。合成的cDNA于-20℃冰箱保存備用。（4）熒光定量PCR擴增反應（SYBR Green）：反應體系為20μl：2×miRcute miRNA Premix（含SYBR，含ROX）10μl，Forward Primer（10μM）0.4μl，Reverse Primer（10μM）0.4μl，miRNA第一鏈cDNA 2μl，50×ROX Reference Dye 1.6μl，ddH2O 5.6μl。擴增程序：94℃預變性2min；94℃20s，60℃34s，43個循環。（5）結果計算：所有反應設立3個復孔，記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數（Ct值），以miR-16作為內參照，對目標基因進行歸一化處理，以確保相等數量的樣品中比較目標基因的量。采用定量PCR中的相對定量法，表達量倍數的變化采用F=2-△△Ct法計算。△△Ct=（CtmiR-31-CtmiR-16）結腸癌-（CtmiR-31-CtmiR-16）正常對照均值。（6）血清癌胚抗原CEA的檢測：美國 Beckman Coulter 公司 Immulite 2000分析儀及配套試劑，采用化學發光法，正常參考值0～5ng/ml。

1.5統計學方法 采用 SPSS17.0 統計軟件。采用單樣本 Kolmogorov-Smirnov 檢驗法作數據正態分布檢驗，符合正態性分布的兩組樣本的比較采用成組設計的兩樣本t檢驗，多組數據的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1內參miR-16在結腸癌患者和正常對照組中穩定表達 結腸癌組miR-16相應的Ct值為（28.27±0.24），正常對照組血清中miR-16相應的Ct值為（28.95±0.36），差異無統計學意義（P＞0.05）。結果顯示miR-16在結腸癌患者和正常對照組中可作為血清定量檢測miRNA的內參基因。

2.2血清miR-31在結腸癌組和正常對照組中的表達 Real-time PCR（SYBR Green）檢測miR-31在結腸癌組和正常對照組血清中的表達，以miR-16為內參。結果顯示miR-31在結腸癌血清中的相對表達量為（4.83±0.46），與正常對照組血清中miR-31的表達量（1.010±0.12）比較，差異有顯著性（P＜0.01）。

2.3血清miR-31診斷結腸癌的ROC曲線 以手術切除結腸部位癌癥組織的病理報告為金標準，繪制血清miR-31診斷結腸癌的ROC曲線（見圖1），曲線下面積為0.80，95%可信區間（CI）為0.81～0.85。根據ROC曲線，得出miR-31診斷結腸癌的最佳臨界值即最佳cut-off值為4.62。敏感性為83.4%，特異性為85.6%，陽性預測值為86.1%，陰性預測值為87.3%。準確度為83.2%。

2.4結腸癌血清miR-31表達與臨床病理特征的關系 血清miR-31在結腸癌腫塊直徑≤5cm和腫塊直徑＞5cm組中的表達差異無統計學意義（P＞0.05）；血清miR-31在淋巴結有轉移組的相對表達量為（5.22±0.42），在淋巴結無轉移組中為（3.96±0.13），差異有顯著性（P＜0.01）；血清miR-31在高分化、中分化、低分化結腸癌組織中的相對表達量分別為（3.99±0.08）、（4.24±0.15）、（5.02±0.23），血清miR-31在結腸癌各分化組中的表達水平差異有統計學意義（P＜0.05），隨著分化程度的降低血清miR-31的表達增高。

2.5將結腸癌患者血清miR-31與血清CEA做相關性分析 血清miR-141與血清CEA有較好的相關性（r=0.80）。見圖2。

圖1　血清miR-31診斷結腸癌的ROC曲線

圖2　結腸癌患者血清miR-31與血清CEA相關散點圖

3　討論

結腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一。在我國近20年來尤其在大城市，發病率明顯上升，且有結腸癌高于直腸癌的趨勢。結腸癌發生過程是一個由多基因控制，分不同階段，長期形成的一個非常復雜的致病過程［6］。miRNA是一類由18～23個核苷酸構成的單鏈非編碼RNA分子，通常在轉錄后水平調控基因表達［7］。至今，在人類基因組中已發現500多個miRNA，其廣泛參與腫瘤發生、細胞增殖分化以及細胞凋亡等病理過程［8］。近年來已發現較多miRNAs存在于結腸癌中并在結腸癌的發生發展及預后中起著重要的作用［9］。隨著分子生物技術的發展，與結腸癌有關的miRNAs陸續被發現。近年來有報道miR-31與結腸癌有著密切的關系［3，4］。Yang等［10］發現miR-31在結直腸癌組織中高表達，淋巴結發生轉移的結直腸癌組織中miR-31表達量高于淋巴結未發生轉移的結直腸癌組織。在轉移性結直腸癌細胞株（SW620，Lovo，M5，SCP51）中miR-31也顯著高表達。進一步研究發現，SATB2（特異性核基質結合蛋白2）的mRNA水平和蛋白質水平在結直腸癌組織中低表達。SATB2 3’UTR有2個miR-31的互補結合位點。提示SATB2可能是miR-31的主要靶基因。miR-31可能通過誘導SATB2 mRNA降解和抑制翻譯來調節SATB2的表達。miR-31/ SATB2途徑是之前未被發現的結直腸癌癌癥發生和進展的調節路徑。血液標本獲取簡便，對血清中miRNA進行檢測以診斷結腸癌及判斷預后更適于臨床的應用。但有關miR-31在結腸癌血清中的報道并不多見。

本文通過采用熒光定量 PCR（SYBR Green）法檢測60例結腸癌患者和60例正常對照組血清中miR-31的表達，結果顯示miR-31在結腸癌患者血清中高表達，與文獻報道的結腸癌組織中miR-31高表達一致。以手術切除結腸部位癌癥組織的病理報告為金標準，血清miR-31診斷結腸癌的ROC曲線下面積為0.80，以相對表達量4.62為臨界點時，血清miR-31診斷結腸癌的敏感性為83.4%，特異性為85.6%，具有較好的診斷效能。通過具體分析結腸癌血清miR-31表達與臨床病理特征的關系，作者發現隨著結腸癌分化程度的降低血清miR-31的表達增高，miR-31在結腸癌低分化組的表達約是結腸癌高分化組的1.25倍，提示miR-31可作為結腸癌腫瘤分化程度的一個良好的輔助指標。在淋巴結有轉移的結腸癌病例組中血清miR-31的表達和淋巴結無轉移結腸癌病例組中的表達差異有顯著性（P＜0.01）。提示其可能作為癌基因在結腸癌的進展階段起作用，血清miR-31的表達可以反映結腸癌進展程度，具有臨床病理學診斷價值，也可以作為判斷結腸癌腫瘤預后的一個輔助診斷標準。將血清miR-31與血清CEA分析發現，血清miR-31與血清CEA有較好的相關性（r=0.80）。目前CEA 在臨床上主要用于結腸癌患者的診斷和療效監測，但是，血清中CEA的水平在良性疾病中也可以升高，如糖尿病、心血管疾病及其他胃腸良性疾病如胰腺炎、消化性潰瘍、肝硬化、非特異性結腸炎等，基于CEA診斷結腸癌的靈敏度和特異度相對較低，目前有必要尋找能夠彌補其缺陷的新型、靈敏并且應用方便的疾病檢測標記物以提高結腸癌的早期診斷率。miRNA的發現及其功能研究為醫學領域帶來了希望。如果能聯合檢測血清miR-31與血清CEA，將更好的提高輔助診斷的準確度。

目前本資料檢測的樣本例數未達到大樣本的要求，但實驗數據可作為前期研究支持大樣本結腸癌患者血清miR-31檢測驗證，以作進一步研究。由于血清獲得簡便、快捷、無創，且血清miRNAs 較穩定，優勢已逐漸凸顯［11，12］，可作為一種新的生物標志物用于輔助診斷結腸癌，具有較好的臨床意義，也使得結直腸癌早期篩查和診斷成為可能。血清中miR-31表達量的變化提示miR-31可以作為潛在的腫瘤標記物，以miR-31為靶點的治療將可能成為結腸癌治療的另一重要手段。

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5占一姍，陳幼祥.micorRNA在結直腸癌中的研究進展.南昌大學學報（醫學版），2013，53（5）：82～86.

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Objective To explore the expression level and clinical value of serum miR-31 in colon cancer patients. Methods The expression level of serum miR-31 in 60 colon cancer cases and 60 normal cases were detected by Real-time PCR（SYBR）. Results The expression level of serum miR-31 was（4.83±0.46）in colon cancer group and（1.010±0.12）in normal group . According to the ROC curve，The sensitivity of miR-31 in colon cancer diagnosis was 83.4% and the specificity was 85.6 when the cut-off value of miR-31 was 4.62.There was significant different in serum miR-31 expression between colon cancer group and normal group（P＜0.05）. The expression level of serum miR-31 was（5.22±0.42）in lymph node metastasis group and（3.96±0.13）in non-lymph node metastasis group. There was statistics difference in serum miR-31 expression between lymph node metastasis group and non-lymph node metastasis group（P＜0.01）. There was statistics difference in serum miR-31 expression in welldifferentiated group，middle-differentiated group and poorly- differentiated group. Serum miR-31 expression level increased with the reduction of the differentiation degree. Conclusion MiR-31 might be expected as a new biomarker for the diagnosis of colon cancer.

Colon cancer miR-31 Real-time PCR

南京醫科大學科技發展基金項目（2011NJMU166）215002 江蘇省蘇州市立醫院（本部）