改良多平臺法建立大鼠部分睡眠剝奪模型及其效果評價＊

何玉宏，王培歡，吳高義，孫志衛(wèi)，席蘭蘭

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

改良多平臺法建立大鼠部分睡眠剝奪模型及其效果評價＊

何玉宏，王培歡，吳高義，孫志衛(wèi)，席蘭蘭

目的利用改良多平臺法建立一種大鼠部分睡眠剝奪模型，并對該模型進行評價。方法將50只大鼠隨機分為正常對照組、大平臺對照組、睡眠剝奪1天組、5天組、9天組，共五組，并采用改良后的多平臺方法建立相應(yīng)的模型體系；觀察睡眠剝奪各時間段大鼠行為學(xué)變化以及睡眠剝奪后血清促腎上腺皮質(zhì)激素（CORT）、皮質(zhì)醇（ACTH）、促甲狀腺激素（TSH）含量的變化。結(jié)果睡眠剝奪組大鼠行為學(xué)發(fā)生巨大改變，曠場試驗中在垂直活動得分以及水平活動得分中NC組和TC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，睡眠剝奪1天以及睡眠剝奪5天組垂直活動得分和水平活動得分均高于正常對照組和大平臺對照組，而睡眠剝奪9天組兩方面得分均低于正常對照組和大平臺對照組，且均有統(tǒng)計學(xué)差異。與正常對照組和大平臺對照組相比，隨著睡眠剝奪時間的延長大鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素（CORT）、皮質(zhì)醇（ACTH）、促甲狀腺激素（TSH）的含量均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。結(jié)論利用改良多平臺方法建立相應(yīng)的大鼠睡眠剝奪模型體系，具有良好的睡眠剝奪模擬效果，可以用來進行睡眠障礙實驗的研究。

睡眠剝奪；曠場試驗；改良多平臺法

睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）是研究睡眠的功能和發(fā)生機制的重要方法之一［1］，睡眠剝奪模型的可靠性及準(zhǔn)確性直接影響睡眠剝奪實驗結(jié)果。根據(jù)睡眠過程中腦電圖表現(xiàn)、肌肉張力的變化及眼球運動狀況，可以將睡眠過程分為快動眼睡眠（rapid eye movement，REM）非快動眼睡眠（non rapid eye movements，NREM）兩種不同的時相，在正常情況下，兩者有規(guī)律地交替循環(huán)進行，快動眼睡眠主要用于恢復(fù)腦力，而非快動眼睡眠主要用于恢復(fù)體力。在人類因各種因素所導(dǎo)致的睡眠障礙中，很少有完全的睡眠剝奪，一般為部分睡眠剝奪，而被剝奪的部分正是睡眠時相中的快動眼睡眠時相。基于這種情況，筆者通過改良多平臺睡眠剝奪法［2］（MMPM）建立大鼠睡眠剝奪的模型，最大限度地模擬人類睡眠障礙。睡眠剝奪是一種典型的內(nèi)源性氧化應(yīng)激模型［3］，對睡眠剝奪動物模型的評價可以采用一般心理應(yīng)激模型的評價方法。由于動物無法明確表達(dá)其精神心理狀態(tài)，到目前為止尚沒有一個公認(rèn)的用于評價動物精神心理異常的標(biāo)準(zhǔn)。本實驗旨在通過建立大鼠睡眠剝奪模型，通過檢測大鼠在睡眠剝奪不同時期行為學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)的變化，初步睡眠剝奪動物模型的建立方法及評價標(biāo)準(zhǔn)。

1　材料與方法

1.1動物及儀器試劑

1.1.1實驗動物成年Wistar大鼠，雄性，共50只，體重（200±15）g，清潔級，經(jīng)檢查所有實驗大鼠身體狀況良好，口頜系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能正常無全身性疾病，動物及飼料由山東大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2主要試劑和儀器10%水合氯醛（30ml，濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，濟南）；電子天平（JA2603B，上海精密儀器儀表有限公司，上海）；離心機（Key Wite-D，Thermo Electron Corporation，USA）；全自動免疫發(fā)光分析儀（IMMULITE 2000，SIEMENS，Germany）；全自動微粒子化學(xué)發(fā)光儀（UniCel DxI800 Access，Beckman Coulter，USA）；大鼠睡眠剝奪箱（自制）；曠場試驗箱（自制）。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組和處理將50只大鼠進行隨機分組，使之分成正常對照組（NC）、大平臺對照組（TC）、睡眠剝奪1天組、5天組、9天組，共五組，各組在對應(yīng)時間點進行觀察，并進行曠場試驗，然后腹腔注射麻醉下行心臟取血。睡眠剝奪9天組心臟取血后再對正常對照組和大平臺對照組進行處理。

1.2.2模型建立與方法［2］采用MMPM法建立大鼠睡眠剝奪模型，利用厚80mm的玻璃制作110 cm× 70 cm×45 cm的玻璃睡眠剝奪箱，箱內(nèi)放置15個高8 cm，直徑6.3 cm金屬小平臺，平臺之間相距15 cm。實驗中，箱內(nèi)注水深度7 cm，水溫度保持22℃左右，玻璃睡眠剝奪箱上面置網(wǎng)蓋，網(wǎng)蓋上放置飼料及飲水瓶，大鼠可自由攝食攝水，當(dāng)其進入睡眠狀態(tài)時，身體肌張力降低后頭部觸水，驚醒。大平臺采用1個長105 cm、寬65 cm的長方形鋼絲網(wǎng)板，置于小平臺上組建一個大的網(wǎng)格平臺，網(wǎng)格由相互間隔2.0 cm的不銹鋼條組成，可以避免大鼠落入水中，其余條件與小平臺組條件一致，正常對照組單籠飼養(yǎng)。晝夜光照、室內(nèi)溫度和飼養(yǎng)條件各組相同。

1.2.3曠場試驗［4］制作長寬各為100 cm，高為50 cm的方箱，四周壁為復(fù)合板制作而成，底壁為涂有黑色的板材制成，底面分成25個20 cm×20 cm的方格。在實驗過程中，把單個大鼠放置在曠場試驗箱的正中央方格中，2名實驗人員對于大鼠在五分鐘之內(nèi)的各種行為進行觀察并分別記錄。垂直活動得分（rearing score）以大鼠兩個前腳離開平面的時候為標(biāo)志，到放下雙腳的時候記做1分，站立時間不做統(tǒng)計；水平活動得分（crossing score）以大鼠跨越一個方格記1分。曠場試驗得分為兩者之和。一只大鼠測完后，利用75%乙醇對曠場箱進行清潔并充分晾干后，再觀察下一只大鼠，避免因為氣味而對結(jié)果產(chǎn)生不良影響。

1.2.4大鼠血清ACTH、CORT及TSH含量的測定

各實驗組大鼠在相應(yīng)時間點集中處理，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，小動物實驗臺固定，75%乙醇胸部皮膚局部消毒后，取5ml一次性注射器，于大鼠胸骨劍突下緣正中處30°角斜穿刺入心臟，緩慢抽拉并調(diào)整進針深度至血液輕松抽出，取血約5ml，輕柔注入5ml消毒EP管內(nèi)，垂直放置15min后離心機離心10min，3000 r/min，抽取上清液至2ml EP管內(nèi)，即刻置于-20℃冰箱凍存。集中血清樣本后分別測量ACTH、CORT及TSH的含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)利用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理，采用單因素方差分析（one－way ANOVA）進行檢驗，檢驗水準(zhǔn)設(shè)定α=0.05。

2　結(jié)果

2.1大鼠基本情況大鼠睡眠剝奪1 d時，其活動增多，興奮性明顯提高（圖1-a）；睡眠剝奪5 d時，大鼠表現(xiàn)出容易激惹狀態(tài)，刺激后易怒，相互之間有明顯的攻擊行為（圖1-b）；睡眠剝奪達(dá)9 d時，大鼠表現(xiàn)為活動能力的降低，對外界刺激反應(yīng)淡漠，精神不振，呼吸頻率加快，甚至進食時達(dá)到睡眠狀態(tài)，呈現(xiàn)出身體極度疲弱、精神萎靡的狀態(tài)（圖1-c）。大平臺對照組（圖1-d）及正常對照組大鼠則能夠正常的攝食和飲水，體重及體質(zhì)較實驗前均有增加，對外界刺激反應(yīng)準(zhǔn)確靈敏。

2.2曠場試驗NC組和TC組在水平活動得分和垂直活動得分雖略有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義；SD 1天組兩方面得分均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SD 5天組得分明顯高于兩對照組，且差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而SD 9天組得分情況均低于對照組，且差異也具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。各實驗組水平得分和垂直得分情況見表1，水平得分及垂直得分大致變化如圖2，水平得分和垂直得分出現(xiàn)先升高后降低趨勢。

圖1　大鼠基本情況

表1　實驗各階段大鼠曠場試驗評分情況（±s）

表1　實驗各階段大鼠曠場試驗評分情況（±s）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；與大平臺對照組比較，#P＜0.05；與正常對照組及大平臺對照組比較，＊P＜0.01

正常對照組大平臺對照組SD 1 d組SD 5 d組SD 9 d組水平得分52.13±8.16 53.49±9.21 61.17±6.43△#108.26±9.45＊21.13±5.28＊垂直得分24.21±3.52 22.62±3.15 29.11±3.21△#33.86±4.12＊9.13±2.31＊

2.3血清學(xué)指標(biāo)

2.3.1大鼠血清ACTH含量正常對照組和大平臺對照組血清中促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）含量無明顯差別，SD 1天組與兩對照組相比ACTH含量有一定的升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SD 5天組ACTH含量升高，明顯高于兩對照組（P＜0.05）；SD 9天組ACTH含量出現(xiàn)降低，并且遠(yuǎn)低于兩對照組，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。由實驗組血清內(nèi)ACTH含量線狀圖（圖3）可見，大鼠血清ACTH含量隨著睡眠剝奪時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

圖2　實驗各階段大鼠曠場試驗評分情況

表2　不同睡眠剝奪時間后大鼠血清ACTH、CORT和TSH含量（±s）

表2　不同睡眠剝奪時間后大鼠血清ACTH、CORT和TSH含量（±s）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；與大平臺對照組比較，#P＜0.05；與正常對照組及大平臺對照組比較，＊P＜0.01

組別ACTH（pg/mL）CORT（μg/dL）TSH（μIU/ml）NC 312±36 0.79±0.12 0.21±0.08 TC 321±32 0.81±0.14 0.22±0.10 SD 1 d 357±35 1.22±0.19△#0.38±0.09△#SD 5 d 427±40△#1.78±0.17＊0.82±0.11＊SD 9 d 257±39△#0.89±0.15 0.53±0.07＊

2.3.2大鼠血清CORT含量大平臺對照組CORT含量略高于正常對照組但差別不具有統(tǒng)計學(xué)意義。睡眠剝奪1 d后，大鼠血清CORT含量迅速升高，與兩對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SD 5 d組血清CORT含量繼續(xù)升高，最終超過兩對照組的1倍，差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；至睡眠剝奪9 d時CORT含量較5 d時含量明顯下降，約為5 d組的1/2水平，與對照組持平，與兩對照組比較無明顯差異（P＞0.05）（表2）。血清內(nèi)ACTH含量變化圖（圖4）可見，大鼠血清CORT含量隨著睡眠剝奪時間的延長亦呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

圖3　不同睡眠剝奪時間后大鼠血清ACTH含量

圖4　不同睡眠剝奪時間后大鼠血清CORT含量

2.3.3大鼠血清TSH含量正常對照組與大平臺對照組TSH含量雖略有差異（相差僅0.01μIU/ ml），但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），大鼠睡眠剝奪1 d后，血清TSH含量即出現(xiàn)明顯升高，與正常對照組和大平臺對照組相比增加近1倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；至SD 5 d時，TSH含量急劇升高，遠(yuǎn)高于對照組（約為對照組4倍），有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；然而，隨睡眠剝奪時間的延長，至SD 9 d時TSH含量雖有明顯下降，但仍均高于正常對照組和大平臺對照組（高出超過1倍），差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。隨著睡眠剝奪時間的延長，大鼠血清TSH含量變化呈先升高后降低的趨勢（圖5）。

圖5　不同睡眠剝奪時間后大鼠血清TSH含量

3　討論

睡眠約占人們生命的1/3，是生物機體的本能行為之一，對于維持種族延續(xù)和個體生存具有重要的意義。另外，睡眠也是一種生命中非常獨特的運動形式，是機體在生命活動中所進行的一種自我調(diào)節(jié)以及自我保護的過程，對于機體的正常生理和心理方面的維護都有非常關(guān)鍵的作用。睡眠剝奪表示因為環(huán)境或個體原因?qū)е滤叩馁|(zhì)量下降或者睡眠數(shù)量減少的一種狀態(tài)。睡眠剝奪不僅可以引起機體行為、情緒、學(xué)習(xí)、記憶等方面的變化，還能引起激素分泌、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、即刻早期基因表達(dá)及一些特異蛋白表達(dá)的變化，從而影響人體的正常生理功能。

改良多平臺睡眠剝奪法（MMPM）是平臺睡眠剝奪技術(shù)（platform technique）［2］的改進，也是利用大鼠怕水及在水中無法睡眠的習(xí)性基本原理，把10只大鼠同時放在裝有15個小平臺的水槽中，大鼠想要睡眠進入REM期時由于全身肌張力的下降，引起節(jié)律性低頭、觸水、驚醒，以此來達(dá)到剝奪REM睡眠的目的。實驗中既能模擬大鼠群居生活環(huán)境在，又可以允許大鼠在不同平臺間自由活動，這樣不但避免了單平臺睡眠剝奪法（SP）及多平臺睡眠剝奪法（MP）中單只大鼠與群體隔離的缺點而且同時保留了多平臺睡眠剝奪法（MP）中活動范圍增大的優(yōu)點。

曠場試驗通常用來測定大鼠的活動性、探索性和焦慮樣行為，動物心理學(xué)研究中用來觀察動物應(yīng)激反應(yīng)行為變化的一個比較直接的方法。曠場試驗分值分為垂直活動得分和水平活動得分，主要反映動物對周圍環(huán)境的不確定性、探究趨勢及興奮性［5-7］。本實驗中，NC組和TC組在水平活動得分和垂直活動得分雖略有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義，說明大平臺組大鼠隨著時間延長對水環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性；SD 1天組兩方面得分均高于對照組（P＜0.05），而SD 5天組得分明顯高于兩對照組（P＜0.01），說明睡眠剝奪前期大鼠興奮性和探索性增加，而SD 9天組兩方面得分卻明顯低于大平臺對照組和正常對照組，且差異也具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），大鼠行為能力迅速下降。說明在整個睡眠剝奪過程中，大鼠的興奮性及探索性先增強，然后隨著剝奪時間增長機體機能出現(xiàn)衰退，大鼠的興奮性及探索能力也隨之降低，呈現(xiàn)萎靡狀態(tài)，結(jié)果和劉詩翔［8］研究相似。大鼠作為一種社會學(xué)動物，在睡眠剝奪進程中先表現(xiàn)出活動增多，興奮性明顯提高、繼而出容易激惹易怒狀態(tài)，最后呈現(xiàn)出身體極度疲弱、甚至瀕死的狀態(tài)。與人類經(jīng)常失眠后會表現(xiàn)出精神易興奮，腦力易疲勞，情緒不穩(wěn)定繼而無精打采、抑郁冷漠等行為有很大程度的相似性。

應(yīng)激指的是機體對外界或內(nèi)部各種刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和，應(yīng)激反應(yīng)激發(fā)交感神經(jīng)興奮和垂體-腎上腺皮質(zhì)激素分泌，引起的機體內(nèi)部生理機能的變化和細(xì)胞代謝的改變。睡眠剝奪作為一種典型的內(nèi)源性氧化應(yīng)激在激發(fā)機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)中，目前，作為評價動物應(yīng)激程度的指標(biāo)，研究中大多采用測定動物血清中促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropin，ACTH）、皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）及促甲狀腺激素（thyrotropin，TSH）等激素水平的變化進行判斷［9］。

本實驗中，大鼠血清ACTH、CORT及TSH含量變化趨勢基本一致（先升后降），可能是大鼠經(jīng)受睡眠剝奪這一應(yīng)激后，內(nèi)源性氧化應(yīng)激反應(yīng)激活HPA軸，下丘腦首先產(chǎn)生興奮，產(chǎn)生釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，該激素經(jīng)由垂體束中的門脈系統(tǒng)運輸?shù)酱贵w前葉。垂體前葉促皮質(zhì)激素細(xì)胞受到促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的作用，產(chǎn)生并釋放促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH，ACTH通過血液到達(dá)腎上腺的皮質(zhì)區(qū)域，促進腎上腺迅速合成CORT，引起CORT分泌增多。同時，應(yīng)激狀態(tài)也激活了下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸，SD初期，下丘腦首先興奮產(chǎn)生促甲狀腺激素釋放激素（TRH），該激素被運輸?shù)酱贵w前葉后刺激垂體產(chǎn)生促甲狀腺激素（TSH）生成，血清中TSH水平升高，但隨著SD的延長，神經(jīng)內(nèi)分泌反饋環(huán)路出現(xiàn)惡性循環(huán)，機體生理性應(yīng)激反應(yīng)過度，最終造成機體神經(jīng)內(nèi)分泌器官的損傷，從而引起ACTH、CORT及TSH含量的迅速降低，導(dǎo)致機體應(yīng)激反應(yīng)紊亂。

總之，改良多平臺睡眠剝奪法可建立有效的大鼠睡眠剝奪模型，準(zhǔn)確可靠的模擬大鼠睡眠剝奪狀態(tài)，行為學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)是評價睡眠剝奪動物模型建立成功與否的有效方法。該模型可為后續(xù)研究睡眠障礙對大鼠口頜系統(tǒng)運動功能的影響奠定基礎(chǔ)。

［1］Bueno OFA，Lobo LL，Olivedra MGM，et al.Dissociated paradoxieal sleep deprivation effects on inhibiting avoidanee and conditioned fear［J］.Physiol Behav，1994，56（4）：775-779.

［2］VanHulzen ZJM，Coenen AML.Paradoxical sleep deprivation and locomotor activity in rats［J］.Physiology and Behavior，1981，27（7）：741-744.

［3］Everson CA，Laatsch CD，Hogg N，et al.Antioxidant defense responses to sleeploss and sleeprecovery［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2005，288（2）：374-383.

［4］Katz RJ，Roth KA，Carroll BJ.Acute and chronic stress effects on open field activity in therat：implications for a model of depression［J］.Neurosci Biobehav Rev，1981，5（2）：247-251.

［5］Harris RB，Zhou J，Youngblood BD，et al.Failure to change exploration saccharin preferenee in rats exposed to chronic mild stress［J］.Physiol Behav，1997，63（1）：91-100.

［6］Keeney AJ，Hogg S.Behavioural consequences of repeated social defeat in the mouse：preliminary evaluation of a potential animal model of depression［J］.Behav Pharmavol，1999，10（7）：753-776.

［7］鄧穎，孫學(xué)禮.情緒應(yīng)激動物模型的建立及評估［J］.華西醫(yī)學(xué)，2007，22（4）：902-903.

［8］劉詩翔，汪洪，孔繁一，等.大鼠低氧低溫睡眠剝奪模型建立及其行為學(xué)與大腦組織病理學(xué)變化［J］.疑難病雜志，2011，10（11）：849-851.

［9］Gerra G，Zaimovic A，Mascetti GG，et al.Neuroen docrine responses to experimentally induced psychological stress inhealthy humans［J］.Psychoneuroendocrinology，2001，26（1）：91-107.

［2015-05-14收稿，2015-06-12修回］

［本文編輯：韓仲琪］

Establishment and evaluation of partial sleep deprivation model of rats by modified multiple p latform method

HE Yu-hong，WANG Pei-huan，WU Gao-yi，et al.Department of Stomatology，the General Hospital of Jinan Military Region of Chinese PLA，Jinan，Shandong 250031，China

Objective To establish the partial sleep deprivation model of rats by modified multiple platform method and to evaluate it.M ethods Fifty rats were randomly divided into five groups，1d，5d，9d sleep deprivation group，normal control group，and big platform control group；Modified multiple platform method was adopted to establish the rat sleep deprivation model；At each period the rats＇behavior change，the content changes of CORT，ACTH and TSH in serum after sleep deprivation were observed.Result s The basic situation of rats changed much in sleep deprivation groups.Big platform control group and normal control group had no statistical difference on rearing scores and crossing scores（P＞0.05）.Both SD1d group and SD5d group had significant difference in rearing scores and crossing scores compared with control group.SD9d group had lower rearing score and crossing score than that of normal control group and the big platform group，and had significant difference（P＜0.05）.Compared with normal control group and a big platform control，it presents the trend of first increase and then decrease about the content level of adrenocorticotropic hormone（CORT），cortisol（ACTH），thyroid stimulating hormone（TSH）in serum of rats with duration of sleep deprivation.Conclusion Through improv ing multiple platform sleep deprivation method to establish the rat model of sleep deprivation it has a good simulation in the effect of sleep deprivation.It can be used in the study about sleep disorder of rats.

Sleep deprivation；Open field test；Modified multiple platform method

R338.36：R-331

A

濟南軍區(qū)總醫(yī)院院長基金資助項目（2012Q003）

250031山東濟南，濟南軍區(qū)總醫(yī)院口腔科（何玉宏，王培歡，吳高義，孫志衛(wèi)，席蘭蘭）