正交試驗優選馬鞭草中總三萜酸的提取工藝

陳改敏，龔如東，張迪

（南陽醫學高等專科學校，河南南陽473061）

正交試驗優選馬鞭草中總三萜酸的提取工藝

陳改敏，龔如東，張迪

（南陽醫學高等專科學校，河南南陽473061）

優選馬鞭草中總三萜酸的提取工藝。采用紫外分光光度法測定總三萜酸含量；以總三萜酸得率為指標，采用單因素試驗考察乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數的影響，在此基礎上設計正交試驗優選馬鞭草中總三萜酸的提取工藝。最佳提取工藝為80%乙醇35倍量超聲提取3次，每次30 min。在此條件下，總三萜酸得率21.91 mg/g。該工藝穩定可行，為馬鞭草中三萜酸的開發利用提供參考。

馬鞭草；總三萜酸；正交試驗

馬鞭草作為傳統中藥，藥用部分為其全草或帶根全草，具有活血散瘀、解毒、利水、退黃、截瘧等功效，用于治療痛經經閉、水腫、黃疸、瘧疾等病癥［1］。馬鞭草主要成分有黃酮類、苯丙素類、環烯醚萜類、三萜類、甾體類、糖苷類、揮發性成分和有機酸類等［2-4］。近年來，科研工作者對三萜酸的藥理作用研究較多，三萜酸的藥理作用主要為抗炎、鎮咳、降血脂、降血糖、抗腫瘤［5-7］，生物活性廣泛。目前，馬鞭草中總三萜酸提取工藝鮮見報道，本試驗參照文獻［8-10］，采用超聲波提取、紫外可見分光光度法進行總三萜酸的含量測定，通過單因素試驗和正交試驗優化提取工藝，為馬鞭草中三萜酸的開發利用奠定基礎。

1材料

TU-1901型雙光束紫外分光光度計、普析GWAUN2-C-20型超純水機：北京普析通用儀器有限責任公司；METTLER-XS105DO萬分之一分析天平：梅特勒-托利多公司；FW-200A型萬能粉碎機：北京科偉有限責任公司；KQ-50E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；齊墩果酸對照品：購自上海晶純生化科技股份有限公司，批號110087；甲醇、乙醇、石油醚均為分析純。

馬鞭草購于河南省藥材公司，經南陽醫專藥學系姚學文鑒定為Verbena Officinalis L.全草；除雜后，經FW-200A型萬能粉碎機粉碎過60目篩網，稱取適量樣品置于索氏提取器中，加入3倍體積的石油醚于80℃脫色，40℃烘干備用。

2方法與結果

2.1供試品溶液的制備

稱取石油醚脫色后粉末2.00 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入80%的乙醇30 mL，超聲提取2次，每次30 min，過濾，合并濾液減壓濃縮，加入甲醇溶解轉移至100 mL容量瓶中，定容搖勻，即得。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對照品適量，用甲醇定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.120 0 g/L的對照品溶液，待用。

2.3顯色方法及檢測波長的確定

分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液0.2，0.4 mL于10 mL具塞試管中，水浴將溶劑蒸干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入0.8 mL的高氯酸，充分搖勻，在70℃的水浴中加熱15 min，冰水冷卻，再加入5 mL的冰醋酸，放置20 min后，用紫外可見分光光度計在400 nm～800 nm范圍內進行掃描其吸光度。結果表明，供試品和對照品溶液均在540 nm處有最大吸收峰，因此選540 nm作為測定波長。

2.4標準曲線的繪制

分別精密吸取齊墩果酸對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞試管中，按2.3項下方法顯色，以試劑空白為對照，用1 cm×1 cm的比色皿在540 nm處測定吸光度（A）。以齊墩果酸的濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。線性回歸方程為：y=8.034 02 x+0.032 06，r=0.999 5。

2.5單因素試驗

2.5.1乙醇濃度對總三萜酸得率的影響

準確稱取6份經石油醚脫色后馬鞭草粉末2.00 g，以料液比1∶35（g/mL），提取時間30 min，提取次數2次，設計乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%，考察乙醇濃度對總三萜酸得率的影響，結果如圖1所示。

圖1　乙醇濃度對總三萜酸得率的影響Fig.1Effect of volume fraction of ethanol on extraction rate of total triterpenoids

乙醇濃度在80%時，得率達到最大值，之后隨濃度增加得率反而逐漸減小。所以乙醇濃度為80%時的提取效果好。故選擇乙醇濃度70%、80%、90%3個水平進行優化。

2.5.2料液比對總三萜酸得率的影響

準確稱取6份經石油醚脫色后馬鞭草粉末2.00 g，以乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取次數2次，設計料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50（g/mL），考察料液比對三萜酸得率的影響，結果如圖2所示。

圖2　料液比對總三萜酸得率的影響Fig.2Effect of the ratio of water to materials on extraction rate of total triterpenoids

得率隨著料液比的增加而逐漸增加且趨于平緩。由于提取液體積的增大會增加蒸發濃縮的工作量，為降低分離純化的成本，因此選擇料液比1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）3個水平進行優化。

2.5.3提取時間對總三萜酸得率的影響

準確稱取5份經石油醚脫色后馬鞭草粉末2.00 g，以料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度80%，提取次數2次，設置20、30、40、50、60 min不同的提取時間，研究提取時間對得率的影響，結果如圖3所示。

圖3　提取時間對總三萜酸得率的影響Fig.3Effect of extracting time on extraction rate of total triterpenoids

在40 min時，總三萜酸得率最大，在此之后得率隨時間的延長而逐步下降。故選擇提取時間30、40、50 min 3個水平進行優化。

2.5.4提取次數對總三萜酸得率的影響

準確稱取5份經石油醚脫色后馬鞭草粉末2.00 g，以料液比1∶40g/mL，乙醇濃度80%，提取時間40min，提取不同次數，提取次數與得率的關系如圖4所示。

圖4　提取次數對總三萜酸得率的影響Fig.4Effect of extraction times on extraction rate of total triterpenoids

隨著提取次數的增加，得率逐漸增大且趨于平緩，但溶劑的消耗量增大，考慮到效益諸多方面的因素，故選擇提取次數為1、2、3次3個水平進行優化。

2.6正交試驗

在單因素試驗的基礎上，我們選取乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數4個因素為優化條件，用正交表L9（34）設計正交試驗。因素水平見表1，試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表1　正交試驗因素及水平表Table 1Factors and levels of orthogonal experiments

表2　正交試驗結果Table 2Result of orthogonal experiments

由表2、表3可知，各因素對馬鞭草中總三萜得率的影響大小次序為：提取次數＞料液比＞乙醇濃度＞提取時間。以極差最小的提取時間為誤差項進行方差分析，結果顯示提取次數對馬鞭草總三萜酸得率有顯著影響，因而確定最佳的提取工藝條件為A2B2C1D3，即乙醇濃度80%，料液比1∶35（g/mL），提取時間30min，提取次數3次。

表3　方差分析結果Table 3Results of variance analysis

2.7驗證試驗

按照選定的條件A2B2C1D3重復試驗3次，得率分別為21.89、21.90、21.95 mg/g，平均值為21.91 mg/g，說明上述提取工藝是合理的。

3小結

本文在單因素試驗的基礎上進行了正交試驗，確定了超聲波法提取馬鞭草中總三萜酸的最佳工藝；本試驗采用紫外分光光度法進行測定，操作方便，測定結果準確、快速，簡單易行。本文首次研究了馬鞭草中總三萜酸的含量測定及提取工藝，為馬鞭草中三萜酸的開發利用奠定基礎。

［1］中國藥典委員會.中國藥典:一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:49

［2］任非，段坤峰，付穎，等.馬鞭草鎮咳有效部位化學成分的研究［J］.中國醫院藥學雜志，2013，33（6）:445-449

［3］陳興麗，孟巖，張蘭桐，等.馬鞭草化學成分和藥理作用的研究進展［J］.河北醫藥，2010，32（15）:2089-2091

［4］田菁，趙毅民，欒新慧.馬鞭草化學成分的研究［J］.中國中藥雜志，2005，30（4）:268-269

［5］鞠建華，周亮，林耕，等.枇杷葉中三萜酸類成分及其抗炎、鎮咳活性研究［J］.中國藥學雜志，2003，38（10）:752-757

［6］馬路，史大卓，陳可冀，等.山楂總三萜酸對大鼠肝細胞合成14C-膽固醇及肝細胞膜HDL受體活性的影響［J］.中國醫院藥學雜志，2009，29（21）:1807-1810

［7］李鋒，王航，薛原楷，等.枇杷葉三萜酸降血糖活性實驗研究［J］.藥物生物技術，2011，18（4）:328-331

［8］尤努斯江·吐拉洪，木妮熱·依布拉音，吐爾洪·買買提.阿里紅中總三萜酸的提取工藝優選及含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（17）:24-27

［9］張慧，尹永芹，湯文偉，等.鴨腳木皮中總三萜的提取工藝優化［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（8）:5-7

［10］賴紅芳，鄧秋芬.半仿生法提取雞骨草中總三萜酸的工藝優選［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（24）:46-48

Optimization of Extraction Technology of Total Triterpenoids from Verbena officinalis L.by Orthogonal Test

CHEN Gai-min，GONG Ru-dong，ZHANG Di
（Nanyang Medical College，Nanyang 473061，Henan，China）

To optimize the extraction technology of total triterpenoids from Verbena officinalis L..The content of total triterpenoids was determined by UV with oleanic as reference；Effects of concentration of extraction solvent，solid-liquid ratio，extraction time and extraction times by taking yield of total triterpenoids as the index，basis on this，extraction technology was optimized by orthogonal test.The optimum extraction technology were as follow：extracted 3 times with 35 times the amount of 80%ethanol，30 min each time.Under these conditions，yield of total triterpenoids from Verbena officinalis L.was 21.91 mg/g.This extraction process was stable and feasible，which provide the reference for the development and utilization of triterpenoids from Verbena officinalis.

Verbena officinalis L.；total triterpenoids；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.017

2015-05-04

南陽市科技局項目（2013GG056）

陳改敏（1980—），女（漢），講師，主要從事天然藥物化學和藥物分析的研究。