交叉引物等溫擴增檢測霍亂弧菌方法的建立

張霞，高琳，王淞，趙良娟，鄭文杰，王碩

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

交叉引物等溫擴增檢測霍亂弧菌方法的建立

張霞1，2，高琳2，王淞2，趙良娟2，鄭文杰2，王碩1，*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

建立食品中全血清型霍亂弧菌的交叉引物等溫擴增檢測方法。針對霍亂弧菌設計特異性引物及探針，建立交叉引物等溫擴增法，利用免疫金標試紙條對結果進行檢測。用57株霍亂弧菌及相近株細菌進行特異性試驗；通過定量DNA、純菌液計數、樣品中添菌檢測及與環介導等溫擴增方法進行靈敏度驗證及比較工作。結果表明，建立方法具有較好特異性；DNA檢測靈敏度為79.28 fg/test，增菌液檢測靈敏度為4.2×102CFU/mL，當每25克樣品中有5.6 CFU菌時經增菌步驟后即可檢出。建立的交叉引物恒溫檢測方法可作為食品中霍亂弧菌快速初篩檢測方法使用，較環介導等溫擴增方法靈敏且易于操作。

交叉引物等溫擴增技術；霍亂弧菌；檢測

人類在飲食過程中，由于食用污染霍亂弧菌（Vibrio cholera）的食物，導致胃腸道紊亂，產生明顯的腹瀉、嘔吐等臨床癥狀。通常人們認為O1與O139血清型的霍亂弧菌容易導致霍亂疾病的流行，而非O1和非O139的霍亂弧菌是普遍存在于河流、水域的正常菌群，不具有致病性，稱為非致病性霍亂弧菌［1］。但是，在近十幾年的研究中發現，非致病性霍亂弧菌也可導致胃腸炎、敗血癥及腦膜炎等疾病［2-3］。因此，針對食品中霍亂弧菌的檢測不應僅局限于對O1和O139等致病性霍亂弧菌，還應包括非致病性霍亂弧菌，即對于全血清型霍亂弧菌進行檢測成為保障食品安全的必然。

目前對于霍亂弧菌的檢測主要有常規生化培養法、PCR方法、實時熒光PCR方法［4-8］及LAMP方法［9］等；常規生化培養方法作為檢測用金標準，檢測流程在3 d以上，可以對全血清型霍亂弧菌進行檢測；目前分子生物學檢測方法主要針對mshA、RTX及ctxA等基因［10-12］進行O1群及O139群霍亂弧菌檢測，還鮮見檢測全血清型霍亂弧菌方法報道。

本研究旨在應用新型交叉引物等溫擴增技術［13］建立全血清型霍亂弧菌檢測方法，不依賴PCR、熒光PCR等昂貴儀器，避免LAMP方法結果檢測需要電泳使用EB危害、PCR產物污染等問題，將分子生物學檢測推廣至基層實驗室或經濟不發達地區。

1材料與儀器

1.1主要材料與試劑

dNTPs：Fermentas；10×Bst buffer：New England Biolabs；Bst DNA polymerase large fragment：New England Biolabs；MgSO4、betaine：Sigma；核酸快速檢測試紙條：杭州優思達公司；DNA ladder II：北京天為時代科技有限公司；瓊脂糖：promega公司；10×loading buffer：大連寶生物工程公司；5×TBE：大連寶生物工程公司。

菌株采用16株霍亂弧菌，其中5株O1群、1株O139群，10非O1和非O139，來源于臨床分離2株、食品中分離10株；17株其他弧菌，24株食品中常見致病菌，詳見表1。

1.2主要儀器與設備

PCR儀：Biometra；離心機：Eppendorf，5417R；DNA/RNA/蛋白分析儀：BHIMUZDA，Bio Specmini；電泳儀：Hoefer，PS3000，American；凝膠成像儀：Bio-Rad，Italy。

表1　試驗菌株Table 1Bacterial strains for detection

1.3方法

1.3.1引物及探針的設計

利用霍亂弧菌toxR基因序列（GenBank CP001233）［14-15］設計特異性引物及探針見表2。參照已發表的LAMP方法［16］設計引物，序列見表2。

表2　檢測霍亂弧菌引物序列Table 2 Primers and probe used for the detection of V.cholera

1.3.2反應體系和反應條件

1.3.2.1交叉引物等溫擴增方法

反應體系50 μL，各試劑濃度為：10×ThermoPol buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，100 mmol/L MgSO42 μL，5 mol/L betaine 5 μL，8 U/μL Bst DNA酶2.5 μL，2 μmol/L VCF及VCR各1 μL，20 μmol/L VCCF及VCCR各2 μL，20 μmol/L VCDF及VCDR各2 μL，1 μL模板，22.5 μL水。

反應條件：60℃反應60 min。

1.3.2.2環介導等溫擴增方法

反應體系50 μL，各試劑濃度為：濃度50 μmol/L的FI及BI引物各1.6 μL，10 μmol/L的F3及B3引物1 μL，50 μmol/L的L引物0.8 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，100 mmol/L MgSO43 μL，5 mol/L betaine 4 μL，8 U/μL Bst DNA酶2 μL，10×ThermoPol buffer 5 μL，1 μL模板，水補足至50 μL。

反應條件：60℃反應75 min。

1.3.3特異性試驗

對表1中菌株核酸樣本進行試驗，以證明交叉引物等溫擴增檢測方法是否具有通用性及特異性。

1.3.4靈敏度試驗

霍亂弧菌CDC1201、CDC0904及MCCC1A02608為試驗菌株，37℃培養16 h，取1 mL用于細菌基因組提取，利用DNA/RNA/蛋白分析儀檢測進行DNA定量。對培養的純菌液計數后10倍稀釋，按照CPA及LAMP反應體系進行試驗。

1.3.5樣品添菌檢測

取經證實不含霍亂弧菌的魚糜樣品A、B在增菌前分別添加101CFU/25g，100CFU/25g霍亂弧菌MCCC1A02608菌液1 mL，混勻1 min，加入225 mL堿性胨水（APW）37℃培養24 h，取1 mL樣品增菌液按照本研究方法進行檢測，未添加菌的樣品A、B作為空白對照，同時做細菌計數。

2結果與分析

2.1特異性試驗

圖1是交叉引物等溫擴增方法部分霍亂弧菌檢測結果。

圖1　霍亂弧菌交叉引物等溫擴增特異性檢測Fig.1Specificity of detecting V.cholera

56株實驗菌株，其中16株霍亂弧菌檢測全部為陽性，其余17株其他弧菌及24株陰性相關菌檢測為陰性，說明交叉引物等溫擴增結合免疫金標試紙條檢測方法特異性良好，而且對于霍亂弧菌全血清型具有很好的通用性。

2.2檢測靈敏度

2.2.1DNA檢測

利用紫外分光光度計檢測CDC1201，CDC0904 and MCCC1A02608的OD 260/280在1.83-1.982，說明DNA質量好，可以進行分子生物學檢測，DNA濃度分別為79.28、74.02、67.39 μg/mL，10倍梯度稀釋至10-8，按照2種等溫擴增反應體系進行試驗，重復3次，結果見表3。

說明交叉引物等溫擴增方法DNA檢測靈敏度高于環介導等溫擴方法，交叉引物在79 fg/test時，檢測全部為陽性，環介導3個檢測出現1個陽性。

2.2.2純菌液檢測

霍亂弧菌試驗菌株過夜培養后菌液濃度分別為CDC1201（4.2×108CFU/mL）、CDC0904（8.7×107CFU/mL）、MCCC1A02608（6.7×107CFU/mL），用PBS對菌液進行10倍梯度稀釋至100CFU/mL數量級，各取1 mL提取DNA做實驗模板，兩種等溫擴增方法結果見表4。

表3　霍亂弧菌DNA靈敏度試驗結果Table 3Sensitivity of detecting V.cholerae genomic DNA

表4　霍亂弧菌菌液靈敏度試驗結果Table 4Sensitivity of detecting V.cholerae in pure cultures

其靈敏度穩定達到102CFU/mL，在101CFU/mL數量級時，CPA方法可以檢出，但LAMP方法檢測全部為陰性。

2.3樣品添菌實驗

對魚糜空白樣品細菌計數，即樣品本底雜菌數為7.2×102CFU/g，向樣品中添菌量為5.6及56 CFU/25 g，兩種方法均可檢出，說明經增菌后的檢測靈敏度二者一致，在有其他干擾菌的情況下均可以達到100CFU/ 25 g的檢測低限。

3結論

霍亂弧菌作為人類食源性致病菌其致病性及檢測方法早已引起各國學者的重視，對非致病性霍亂弧菌在近年來發展迅速，研究發現非致病性霍亂弧菌也導致人類疾病，推測可能與有關毒力因子有關，如毒素協同調節菌毛（TCP）［17］，毒力調節基因toxR，細胞毒素因子［18］溶血素（Hly A）［19］等，其中ToxR在所有的非致病性霍亂弧菌中被發現，其與霍亂毒素A基因的調節有關［20-21］，因此本研究以toxR為靶基因檢測全血清型霍亂弧菌，經特異性試驗結果表明，以該基因為目的片段檢測霍亂弧菌具有良好的特異性及通用性。

隨著等溫擴增技術的發展，解決了分子生物學快速檢測方法對儀器的依賴，將其應用推廣到一個新的高度。通過研究發現，由于引物設計原理的不同，交叉引物等溫擴增方法實際檢測靈敏度要略高于環介導等溫擴增方法，但是由于樣品增菌后目標菌濃度一般可達到104CFU/mL左右，二者添菌試驗檢測靈敏度一致，由于方法操作簡便，不需要特殊設備，均可應用于基層實驗室檢測以及樣品的快速篩選檢測。但是本研究交叉引物等溫擴增結合免疫金標試紙條檢測方法的建立，解決了環介導等溫擴增方法檢測結果的缺陷，避免電泳時PCR產物的二次污染和EB對人體的危害，同時克服了觀察沉淀或顏色變化造成的不客觀性，在結果觀察方面明顯優于環介導等溫擴增方法，所以本研究建立的霍亂弧菌檢測方法具有較強的推廣效應。

［1］Ottaviani D，Leoni F，Rocchegiani E，et al.Prevalence and virulence properties of non-O1 non-O139 Vibrio cholera strains from seafood and clinical samples collected in Italy［J］.Int J Food Microbiol，2009，132:47-53

［2］Matte G R，Matte M H，Rivera I G，et al.Distribution of potentially pathogenic vibrios in oysters from a tropical region［J］.J Food Prot，1994，57:870-873

［3］Morris J G，Takeda T，Tall B D，et al.Experimental non-O1 group Vibrio cholerae gastroenteritis in humans［J］.J Clin Invest，1990，85: 697-705

［4］Chakraborty S，Khanam J，Takeda Y，et al.Application of PCR for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 in water samples during an outbreak of cholera［J］.Trans R Soc Trop Med Hyg，1999，93:527-538

［5］Gubala A J，Proll D F.Molecular-Beacon Multiplex Real-Time PCR Assay for Detection of Vibrio cholerae［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72:6424-6428

［6］Lyon W J.TaqMan PCR for Detection of Vibrio cholerae O1，O139，Non-O1，and Non-O139 in Pure Cultures，Raw Oysters，and Synthetic Seawater［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67:4685-4693

［7］Singh D V，Isac S R，Colwell R R.Development of a Hexaplex PCR Assay for Rapid Detection of Virulence and Regulatory Genes in Vibrio cholerae and Vibrio mimicus［J］.J Clin Microbiol，2002，40: 4321-4324

［8］Fykse E M，Nilsen T，Nielsen A D，et al.Real-time PCR and NASBA for rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae in ballast water［J］.Mar Pollut Bull，2012，64:200-206

［9］Yamazaki W.Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loop-mediated isothermal amplification［J］.Methods Mol Biol，2011，739:13-22

［10］Thattiyaphong A，Okada K，Khangrang S，et al.Development of a 5-minute rapid test for detecting Vibrio cholerae O139［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，2013，44:448-555

［11］DePaola A，Hwang G C.Effect of dilution，incubation time，and temperature of enrichment on cultural and PCR detection of Vibrio cholerae obtained from the oyster Crassostrea virginica［J］.Mol Cell Probes，1995，9:75-81

［12］Fields PI，Popovic T，Wachsmuth K，et al.Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic［J］.J Clin Microbiol，1992，30: 2118-2121

［13］Fang R，Li X，Hu L，et al.Cross-priming amplification for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens［J］.J Clin Microbiol，2009，47:845-847

［14］Waldor M K，Mekalanos J J.ToxR regulates virulence gene expression in non-O1 strains of Vibrio choleraethat cause epidemic cholera［J］.Infect Immun，1994，62:72-78

［15］Kumar R，Lalitha K V.Prevalence and molecular characterization of Vibrio cholerae O1，non-O1 and non-O139 in tropical seafood in Cochin India［J］.Foodborne Pathog Dis，2013，10:278-283

［16］Srisuk C，Chaivisuthangkura P，Rukpratanporn S，et al.Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW［J］.Lett Appl Microbiol，2010，50:36-42

［17］Sarkar A，Nandy R K，Nair G B，et al.Vibriopathogenicity island and cholera toxin genetic element-associated virulence genes and their expression in non O1 non O139 strains ofVibrio cholerae［J］. Infect Immun，2002，70:4735-4742

［18］Saka HA，Bidinost C，Sola C，et al.Vibrio is essential for high enterotoxicity and apoptosis induction produced by a colera toxin gene-negative V.choleraeenon-O1，non-O139 strain［J］.Microb Pathog，2008，44:118-128

［19］Dutta D，Chowdhury G，Pazhani G P，et al.Vibrio cholerae non-O1，non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea，Kolkata，India［J］. Emerg Infect Dis，2013，19:464-467

［20］Preeprem S，Mittraparp-arthorn P，Bhoopong P，et al.Isolation and characterization of Vibrio cholerae isolates from seafood in Hat Yai City，Songkhla，Thailand［J］.FoodbornePathogDis，2014，11:881-886

［21］Rajpara N，Vinothkumar K，Mohanty P，et al.Synergistic effect of various virulence factors leading to high toxicity of environmental V. cholerae non-O1/non-O139 isolates lacking ctx gene:comparative study with clinical strains［J］.PLoS One，2013，8:1-10

Detection of Vibrio cholera by Lsothermal Cross-priming Amplification

ZHANG Xia1，2，GAO Lin2，WANG Song2，ZHAO Liang-juan2，ZHENG Wen-jie2，WANG Shuo1，*
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin，300457，China；2.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

To develop a cross-priming amplification（CPA）method for the detection of all serotypes of V. cholera on food.Specific primers and probe were designed，we developed cross-primer isothermal amplification method，using the immuno-gold standard test strip to test results.The specificity of the method was evaluated by 57 different bacterial strains.The sensitivity of the method was evaluated by testing the quantitative DNA，pure bacteria counted and the sample of adding V.cholera comparing with the loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method.All of the V.cholera strains showed positive results，and 41 other types of bacteria gave negative results.The limit of detection of the CPA method was 79.28 fg of genomic DNA，4.2×102CFU/mL for bacteria in pure culture，and 5.6 CFU per 25 g of sample with pre-enrichment.This method showed a higher sensitivity than the LAMP method did and was more convenient to perform.These results indicate that the CPA method can be used for the rapid preliminary screening of V.cholera.

cross prime isothermal amplification；Vibrio cholera；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.028

2015-07-21

質檢總局科研專項《食源性致病菌恒溫擴增結合免疫金標檢測技術的研究》資助（2011IK241）

張霞（1975—），女（漢），高級工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測。

王碩（1969—），男，教授，研究方向：食品安全檢測。