蔗糖異構酶突變菌株的構建及其應用研究

滕菲，肖華，王寧鶴，李玉，路福平

（天津科技大學生物工程學院，天津300457）

蔗糖異構酶突變菌株的構建及其應用研究

滕菲，肖華，王寧鶴，李玉，路福平

（天津科技大學生物工程學院，天津300457）

蔗糖異構酶是糖苷水解酶13家族的重要成員，可以異構化蔗糖生成異麥芽酮糖和海藻酮糖，同時水解生成少量的葡萄糖和果糖。通過定點突變法對土壤發散菌來源的蔗糖異構酶基因進行定點突變，在大腸桿菌中實現異源表達，獲得3例突變菌株R-M1（Q299E），R-M2（Q299D），R-M3（Q299N）。R-M1轉化蔗糖的產物當中，異麥芽酮糖的比例從90.28%升至93.16%，海藻酮糖比例從3.09%降低到1.79%。對突變菌株R-M1游離細胞轉化蔗糖底物的條件進行了優化，確定了最適轉化條件為：30℃條件下，投入濃度為8×109cfu/mL的細胞到蔗糖濃度為50%的10 mL的磷酸檸檬酸緩沖液中，反應90 min，可實現蔗糖最大程度的轉化，麥芽酮糖產物濃度達到460 mg/mL。

蔗糖異構酶；土壤發散菌；異麥芽酮糖；全細胞轉化

蔗糖異構酶（sucroseisomerase，SIase，EC5.4.99.11）是一類重要的葡萄糖基轉移酶，主要有兩種作用，一是異構化，可以催化蔗糖異構化反應生成異麥芽酮糖（α-D-吡喃葡糖基-1，6-D-果糖，isomaltulose）和海藻酮糖（α-D-吡喃葡糖基-1，1-D-果糖，trehalulose）兩種主要產物；二是水解，異構化的同時水解蔗糖生成少量的葡萄糖和果糖。

SIase以蔗糖為底物，可生成異麥芽酮糖，異麥芽酮糖除具有與蔗糖類似的物理性質和口感外，還有低熱量、不致齲、不吸濕、耐酸解等特點，因此在無糖甜食品的生產中具有較好的應用前景［1-2］。不同微生物來源的SIase作用于蔗糖所形成的產物比例各不相同，尤其是異麥芽酮糖和海藻酮糖的比例差別較大，如紅色精朊桿菌、普城沙雷氏菌、大黃歐文氏菌、植生克雷伯氏菌、克雷伯氏菌LX3和分散泛菌UQ68J轉化蔗糖產物主要是異麥芽酮糖（75%～91%）［4-9］；而嗜溫嗜酸假單胞菌MX-45和放射形土壤桿菌MX-232轉化蔗糖產物為海藻酮糖（88%～90%）［10-11］。

據報道，不同來源的SIase中，土壤發散菌UQ68J來源的SIase催化蔗糖獲得異麥芽酮糖產物的比例最高。本實驗室已構建了土壤發散菌來源的SIase在大腸桿菌中表達的重組菌R-W（BL21/pET22b-sim），在此基礎上，本研究擬通過對蔗糖異構酶基因進行定點突變，構建重組突變株，并對催化產物中異麥芽酮糖比例較高的突變株的轉化條件進行優化，為開發細胞催化或酶法催化生產異麥芽酮糖的工業應用提供理論參考。

1材料與方法

1.1菌株和質粒

大腸桿菌重組菌R-W：天津科技大學生物工程學院實驗室構建和保存。

1.2試劑與儀器

限制性內切酶SacI、BamHI、T4DNA連接酶、PCR試劑、DNA marker、DNA片段純化試劑盒：均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA抽提試劑盒和質粒快速抽提試劑盒：均購自上海申能博彩科技有限公司；IPTG、蛋白質相對分子質量標準品：購自美國Bio RAD公司；其他常用試劑均為國產分析純；異麥芽酮糖標準品：購自Sigma公司。

1.3方法

1.3.1突變菌株的構建

1.3.1.1定點突變引物的設計

根據質粒pET22b-sim的基因序列，和突變位點Q299E，Q299D，Q299N的選擇，利用Primer5.0設計出全長擴增引物sim-f、sim-p，重疊引物mid-f1、mid-p1；midf2、mid-p2；mid-f3、mid-p3，如表1所示。

表1　引物序列表Table 1The table of primer sequence

1.3.1.2重疊PCR擴增突變基因及重組突變株的構建

早期構建的重組菌R-W，實現了SIase在大腸桿菌的可溶性表達。本研究以重組表達質粒pET22b-sim為模板，通過定點突變得到突變基因sim1（Q299E），sim2（Q299D），sim3（Q299N），分別克隆于pET-22b表達載體，轉入E.coli BL21表達宿主，獲得重組菌R-M1（Q299E），R-M2（Q299D），R-M3（Q299N）。

1.3.2突變重組菌的培養及重組酶的誘導表達

LB培養配方參考文獻［12］；菌體生長量以OD600值表示。挑取重組菌接種于2 mL含100 mg/mL Amp的LB液體培養基中，37℃，200 r/mim培養過夜。取1 mL培養物接種于裝有50 mL LB（Amp）液體培養基的250mL搖瓶中，37℃，200 r/mim培養，直到OD600=0.6～0.8，加入0.5 mmol/L的IPTG，于20℃下誘導10h，誘導結束后收集菌體細胞，于6 000 r/min，4℃離心20 min，去除上清，將菌體細胞用緩沖液洗滌重懸。

1.3.3重組酶活力的測定

取經誘導表達后的細胞培養液1 mL，6 000 r/min離心10 min收集菌體，使用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液洗滌3次，后重懸至1 mL，加入30℃下預熱的，體積為5 mL的10%蔗糖濃度的pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液作為底物，在30℃的恒溫槽中反應10 min，后沸水浴5 min終止酶促反應，12 000 r/min離心10 min取上清液，同樣的方法應用于不含目的基因的大腸桿菌制備空白對照。各取5 mL于50 mL比色管中稀釋10倍；各取1 mL稀釋液加入0.5 mL DNS溶液，混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫后加入4 mL蒸餾水；以空白樣品作參比，用1 cm比色皿在540 nm測定吸光值；以烘干恒重的葡萄糖標準物代替酶液做標準曲線，將其轉化為葡萄糖（還原糖）濃度，可以根據標準曲線查出所測粗酶液轉化蔗糖產生還原糖的含量，從而測定SIase的酶活。

酶活力的定義為：1 mL酶液或1 g酶粉在30℃，pH 6.0的條件下，1 min催化可形成相當于1 μmol葡萄糖的還原糖，即為一個酶活力單位，符號為：1 kat/mL或1 kat/g［13］。

1.3.4重組突變株轉化產物中異麥芽酮糖的分析檢測

取經誘導表達后的細胞培養液5 mL，6 000 r/min離心10 min收集菌體，使用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液洗滌3次，后重懸至1 mL，在50 mL離心管中加入10 mL，10%蔗糖濃度的pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液，放入30℃的恒溫槽中預熱5 min，加入1 mL菌體重懸液，搖勻，恒溫槽中反應60 min，反應液經離心過膜處理，作為HPLC樣品，用于檢測各糖組分濃度。

轉化產物的HPLC檢測條件如下，檢測器：RID示差檢測器；色譜柱：TSK-gel分析柱；流動相：乙腈∶水= 90∶10（體積比）；柱溫：80℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3.5重組菌R-M1（Q299E）合成異麥芽酮糖的條件研究

1.3.5.1細胞濃度對異麥芽酮糖產量的影響

取經誘導表達后的細胞培養液于4℃，6 000 r/min離心10 min獲得菌體細胞，用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液將細胞洗滌3次，以不同的菌體濃度（1×109、2× 109、4×109、6×109、8×109、1×1010cfu/mL）添加到轉化液中，用于轉化10 mL質量分數為60%蔗糖溶液，考察細胞用量對異麥芽酮糖產量的影響。

1.3.5.2溫度對異麥芽酮糖產量的影響

取經誘導表達后的細胞培養液于4℃，6 000 r/min離心10 min獲得菌體細胞，用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液將細胞洗滌3次，以約為8×109cfu/mL的菌體濃度投入到轉化液中，在溫度分別為30、35、40℃的條件下，用于轉化10 mL質量分數為60%蔗糖溶液，考察溫度對異麥芽酮糖產量的影響。

1.3.5.3蔗糖質量分數對異麥芽酮糖產量的影響

取經誘導表達后的細胞培養液于4℃，6 000 r/min離心10 min獲得菌體細胞，用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液將細胞洗滌3次，以約為8×109cfu/mL的菌體濃度，在30℃條件下，添加入不同蔗糖濃度的溶液中（40%、50%、60%、70%）進行轉化反應，考察蔗糖質量分數對異麥芽酮糖產量的影響。

2結果分析

2.1突變菌株的構建

2.1.1Gln299突變為Glu獲得sim1

以質粒pET22b-sim為模板，分別以引物sim-f和重疊引物mid-p1，重疊引物mid-f1和引物sim-p進行PCR，得到PCR產物1和PCR產物2。結果見圖1。

圖1　重疊PCR產物結果檢測圖譜Fig.1Agarose gel electrophoresis of recombinant PCR

電泳條帶顯示一條約900 bp和一條約800 bp的條帶分別與產物1和產物2預期大小相當。結果如圖1-A所示。然后經過重疊PCR及大量擴增PCR，將PCR產物1和PCR產物2進行重組，得到一條全長約1700 bp的條帶，與目的基因sim1大小相符。結果如圖1-B所示。

2.1.2Gln299突變為Asp獲得sim2，Gln299突變為Asn獲得sim3

方法同2.1.1。

2.1.3突變菌株R-M1，R-M2，R-M3的鑒定

SacI和BamHI雙酶切，回收sim1，sim2，sim3片段，將其與經相同酶切線性化的pET-22b（+）載體連接，構建重組質粒轉入E.coli DH5α，提取轉化子酶切驗證，獲得大小約為1 700 bp和5 500 bp大小的片段，結果正確，如圖2所示。將重組質粒轉入載體E.coli BL21，獲得突變菌株R-M1，R-M2，R-M3。

2.2HPLC定量分析異麥芽酮糖

圖2　雙酶切鑒定重組質粒Fig.2Identification of recombinant plasmid by digestion with SacI and BamHI

圖3　HPLC法對轉化產物的分析檢測圖譜Fig.3HPLC analysis of the sugars converted by SIase

異麥芽酮糖標準品及反應樣品的HPLC結果如圖3所示（A、B），從色譜圖中可以看出，異麥芽酮糖出峰時間為60.375 min，果糖12.393 min，葡萄糖18.676 min，蔗糖49.582 min，海藻酮糖67.829 min。果糖、葡萄糖、蔗糖、異麥芽酮糖、海藻酮糖5者能夠完全分開，且峰形較好。反應樣品與標準品樣品圖譜相比，兩個主峰形狀相似，保留時間一致，該HPLC方法可以對異麥芽酮糖進行有效、同步的定量分析。

2.3突變菌株R-M1，R-M2，R-M3的重組酶活力及催化產物分析

經酶活力檢測及HPLC法對轉化產物中各糖組分含量的測定，結果如表2所示。

與R-W菌株相比，3株突變株的酶活力均沒有顯著的變化。而在產物特異性方面，只有R-M1的異麥芽酮糖比例有一定的升高，從野生型的異麥芽酮糖占90.28%升至93.16%，海藻酮糖比例從3.09%下降至1.79%，同時水解作用也有些微的降低。因此，對Q299E突變體轉化蔗糖的反應條件進行進一步的優化，提高轉化效率，為大規模高效生產異麥芽酮糖提供可能。

表2　異構酶轉化產物中糖組分的分析Table 2Sugar compositions of reaction mixtures of the enzymes

2.4突變菌株R-M1合成異麥芽酮糖的轉化條件研究

2.4.1細胞濃度對異麥芽酮糖產量的影響

考察細胞濃度對異麥芽酮糖產量的影響見圖4。

圖4　細胞用量對異麥芽酮糖產量的影響Fig.4Effects of the amount of cells on isomaltulose production

由圖4可見：誘導結束后，將培養基離心獲得菌體細胞，緩沖液洗滌3次，以不同的菌體濃度（1×109、2×109、4×109、6×109、8×109、1×1010cfu/mL）添加到轉化液中，細胞濃度高異麥芽酮糖生成速率快，但細胞濃度高于8×109cfu/mL時，異麥芽酮糖生成速率變化不大，均能在120 min內轉化完全，最終異麥芽酮糖的濃度達到557 mg/mL。因此選擇濃度為8×109cfu/mL的細胞用于轉化10 mL濃度為60%的蔗糖溶液。

2.4.2溫度對異麥芽酮糖產量的影響

溫度對異麥芽酮糖產量的影響見圖5。

由圖5可見：在溫度為30、35、40℃時，異麥芽酮糖的生成曲線很相似，反應120 min后，異麥芽酮糖產量均不再升高，其中在30℃條件下，異麥芽酮糖的生成速率相對略快，120 min后達到555 mg/mL，而轉化溫度為25℃時，反應120min后異麥芽酮糖僅能達到465 mg/mL。因此選30℃作為最佳轉化溫度。

圖5　轉化溫度對異麥芽酮糖產量的影響Fig.5Effects of the temperature on isomaltulose production

2.4.3蔗糖質量分數對異麥芽酮糖產量的影響

蔗糖質量分數對異麥芽酮糖產量的影響見圖6。

圖6　底物濃度對異麥芽酮糖產量的影響Fig.6Effects of substrate concentration on isomaltulose production

由圖6可見：底物質量分數越小，完全轉化所需的時間越短。當蔗糖質量分數分別為40%和50%時，90 min內均能完全轉化，異麥芽酮糖濃度達到370 mg/mL和460 mg/mL，隨著底物濃度的增大，糖溶液黏度也增大，轉化速率降低，當蔗糖質量分數增加至60%或70%時，120 min時轉化仍沒有實現完全轉化，此時異麥芽酮糖濃度分別達到496 mg/mL和521 mg/mL。實驗操作過程中發現，底物濃度越大，糖溶液黏度增大不利于產物的提取分離。綜合考慮，盡可能在較短的時間內使底物轉化完全及產物后期提取的可操作性，選擇50%蔗糖溶液作為催化底物。

3結論

1）本文通過定點突變法對已構建的重組菌R-W的蔗糖異構酶基因進行分子改造，獲得突變菌株RM1，R-M2，R-M3。其中R-M1與原始基因表達菌株相比產物特異性發生明顯變化，異麥芽酮糖的比例從90.28%升至93.16%，海藻酮糖比例從3.09%降低到1.79%。

2）確定了R-M1的最適轉化條件為：30℃條件下，投入細胞濃度為8×109cfu/mL的細胞到蔗糖濃度為50%的10 mL溶液中，反應90 min，可實現蔗糖99%以上的最大程度的轉化，獲得異麥芽酮糖產物濃度達到460 mg/mL。

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Engineering of Mutant Sucrose Isomerase Producing Strain and Its Application

TENG Fei，XIAO Hua，WANG Ning-he，LI Yu，LU Fu-ping
（The College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Sucrose isomerase was a major member in the glucoside hydrolase family 13.In addition to catalyzing the isomerization of sucrose to isomaltulose，it also produced trehaltulose and small amounts of fructose and glucose.Sim derived from Pantoea dispersa had been subject to site-directed mutagenesis；3 mutants（RM1（Q299E），R-M2（Q299D），R-M3（Q299N））were obtained.Q299E exhibited increased isomaltulose content（from 90.28%to 93.16%）and reduced percentage of trehalulose（from 3.09%to 1.79%）.The optimal conditions for sucrose conversion of mutant R-M1 was determined as follows：the culture（substrate concentration was 8×109cfu/mL）was centrifuged and then resuspended in 10 mL of citrate/phosphate-buffered 50%sucrose solutionand incubated for 90 min at 30℃.Sucrose was completely converted under the above conditions and the concentrations of isomaltulose reached up to 460 mg/mL.

sucrose isomerase；Pantoea dispersa；isomaltulose；whole-cell biotransformation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.036

2014-05-20

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目“糖醇合成與功能性糖醇的研制”（2012AA021502）；教育部長江學者和創新團隊發展計劃項目“食品安全與營養關鍵控制技術研究”（IRT1166）

滕菲（1989—），女（漢），碩士，研究方向：微生物與分子生物學。