CYP17基因多態(tài)性與大同地區(qū)早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)關(guān)系研究

穆雅琴，朱壯彥，王 健，席國萍，齊彩霞，趙富璽

（山西大同大學(xué)免疫學(xué)研究所，山西大同037009）

CYP17基因多態(tài)性與大同地區(qū)早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)關(guān)系研究

穆雅琴，朱壯彥，王 健，席國萍，齊彩霞，趙富璽*

（山西大同大學(xué)免疫學(xué)研究所，山西大同037009）

目的探討CYP17基因多態(tài)性與大同地區(qū)早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系。方法采用PCR-RFLP分別檢測山西大同地區(qū)的不明原因早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（58例）和健康妊娠婦女（73例）的CYP17基因多態(tài)性，分析探討兩者的關(guān)系。結(jié)果早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)組和對(duì)照組之間CYP17 3種基因型分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.817，P=0.020）。A2/A2、A1/A2發(fā)生早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的危險(xiǎn)度分別提高了3.181倍和3.123倍。結(jié)論CYP17等位基因突變可增加發(fā)生早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的危險(xiǎn)性，可能是早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的遺傳易感因素之一。

早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；CYP17基因多態(tài)性；PCR-RFLP

早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent pregnancy loss，RPL)主要指妊娠12周以前連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)[1]。導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生的原因非常復(fù)雜，已有研究表明自然流產(chǎn)的發(fā)生與女性患者的染色體異常、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌異常、免疫因素、感染因素、不良生活習(xí)慣及男性伴侶因素等有關(guān)，但仍有部分病例的發(fā)生機(jī)制仍不明了[2]。

近來有研究表明，復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的發(fā)生與某些基因的多態(tài)性有關(guān)。細(xì)胞色素P450 17（cyto?chrome P45017，CYP17）基因位于10號(hào)染色體長臂24.3區(qū)，主要編碼細(xì)胞色素P450 17α酶，該酶是類固醇激素合成的限速酶之一，在雌激素的合成中發(fā)揮重要作用。CYP17基因5’上游34bp處有對(duì)限制性內(nèi)切酶MSP A1Ⅰ敏感的多態(tài)性位點(diǎn)，該位點(diǎn)的堿基存在T/C多態(tài)性，形成A1/A2兩個(gè)等位基因，不同等位基因的表達(dá)水平在一定程度上影響著體內(nèi)雌激素的水平[3-4]。

鑒于此，本研究擬采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片斷長度多態(tài)性方法（PCR-RFLP），探討CYP17基因MspA1Ⅰ酶切位點(diǎn)基因多態(tài)性與人類早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究對(duì)象選自大同市及其周邊地區(qū)醫(yī)院2008-2013年門診及住院患者，不明原因的早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)58例，健康妊娠婦女73例。正常組健康孕婦中位年齡28.3±2.1歲，平均孕周為8.5±2.6周，B超證實(shí)胎兒發(fā)育正常，既往無自然流產(chǎn)、宮內(nèi)死胎和妊娠期高血壓疾病等不良妊娠史的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)組早期RPL孕婦中位年齡為27.6±3.2，平均孕周為9.2±1.7，已排除染色體、子宮解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌、免疫、感染、男性因素及不良生活習(xí)慣等因素影響。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間年齡、孕周等一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究所有對(duì)象均簽署知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的相應(yīng)要求。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

MSP A1Ⅰ限制性內(nèi)切酶購自加拿大BBI公司，血液基因組DNA抽提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒等購自上海生工生物工程有限公司，微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒來自康為世紀(jì)生物科技有限公司。主要儀器有ABI 9700普通PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）、電泳儀（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心儀器有限公司）、Milli-Qplus超純水裝置（美國Millipore公司）等。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA

取空腹取外周靜脈血3 mL，經(jīng)檸檬酸鈉抗凝后，Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取外周血DNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測A260/A280比值，比值在1.7～1.9之間即所提取DNA的純度符合實(shí)驗(yàn)需求，同時(shí)采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3.2 CYP17基因多態(tài)性檢測

采用PCR-RFLP法對(duì)CYP17基因多態(tài)性進(jìn)行檢測。上游引物為5'-TCC TGA GCC CAG ATAC?CA T-3'；下游引物為：5'-CCG CCC AGA GAA GTC CT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為626bp[5]。反應(yīng)體系包括10 × Taq Buffer with KCl 5 μL，dNTP 1 μL，MgCl24 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 5 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 33.8 μL，共50 μL。熱循環(huán)參數(shù)為 95℃ 5 min，然后94℃ 60s，60℃ 30s，72℃ 30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)觀察并拍照，在626bp處出現(xiàn)條帶即為擴(kuò)增出的CYP17。取PCR產(chǎn)物8 μL、酶切buffer 5 μL、酶 0.2 μL、ddH2O 36.8 μL，共 50 μL 酶切體系，37℃水浴過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min，在化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)觀察酶切圖譜判定基因型并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s或陽性率（%）表示。所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料組間基因型差異的比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)分析，以P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。同時(shí)用比值比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）確定CYP17 基因多態(tài)性對(duì)于早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)度。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA檢測結(jié)果

模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，見圖1。

圖1 CYP17基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 CYP17基因型MspA1Ⅰ酶切位點(diǎn)多態(tài)性分析

擴(kuò)增后DNA片段的長度為626bp，在MspA1Ⅰ酶切位點(diǎn)切割后，選擇3.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并分析結(jié)果。沒有MspA1Ⅰ酶切位點(diǎn)的純合基因型A1/A1（野生型）不能被MspA1Ⅰ酶內(nèi)切，其電泳結(jié)果只有626bp條帶；有MspA1Ⅰ酶切位點(diǎn)的純合基因型A2/A2（突變型）則被切為2條小條帶；雜合基因型A1/A2的雙鏈DNA中只有1條具有Ms?pA1Ⅰ酶酶切位點(diǎn)，故可出現(xiàn)3條條帶，見圖2。

圖2 CYP17基因擴(kuò)增產(chǎn)物MspA1Ⅰ酶切后電泳圖

2.3 CYP17基因型MspA1Ⅰ酶切位點(diǎn)多態(tài)性和早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的相關(guān)性分析

本研究結(jié)果顯示，早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)組和對(duì)照組之間，CYP17基因型A1/A1、A1/A2、A2/A2的分布有差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.817，P=0.020）。與野生基因型A1/A1相比，純合突變基因型A2/A2、雜合基因型A1/A2發(fā)生早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)RPL的危險(xiǎn)度分別提高了3.181倍和3.123倍。等位基因C,T在2組之間的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，突變基因A2使發(fā)生早期自然流產(chǎn)的危險(xiǎn)度升高了1.673（1.022 ～ 2.739）倍。見表1，表2。

表1 早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)組和對(duì)照組CYP17多態(tài)性基因型頻率

表2 早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)組和對(duì)照組CYP17基因多態(tài)性等位基因頻率

3 討論

早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。隨著近年來自然流產(chǎn)發(fā)生率的升高，關(guān)于復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的遺傳易感性越來越受到學(xué)者們的關(guān)注，成為生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。CYP17基因主要編碼細(xì)胞色素P450 17 a酶，該酶具有17a羥化酶和17,20裂解酶的雙重作用，前者可將孕酮羥化為17a羥孕酮，后者可繼續(xù)催化17a羥孕酮為雄烯二酮，繼而轉(zhuǎn)化為雌激素。人類CYP17基因存在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，CYP17等位基因突變可影響其編碼的細(xì)胞色素P450-17a酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，進(jìn)而影響雌激素的產(chǎn)生[6]。

日本學(xué)者Sata[5]的研究證實(shí)攜帶有CYP17基因A2等位基因的女性發(fā)生RSA的風(fēng)險(xiǎn)增加，攜帶有A2/A2純合突變基因型的RSA患者，較攜帶有A1/A1純合野生型者其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加2.37倍。本研究結(jié)果也表明，與野生基因型A1/A1相比，純合突變基因型A2/A2、雜合基因型A1/A2發(fā)生早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的危險(xiǎn)度明顯增高。

其可能的原因是由于CYP17基因rs743572（T→C）多態(tài)性位點(diǎn)中T→C等位基因的突變，增強(qiáng)了CYP17基因的轉(zhuǎn)錄效率，產(chǎn)生大量雌激素的同時(shí)卻使孕酮的表達(dá)水平降低。而孕酮在妊娠的過程中對(duì)于胚胎的發(fā)育起著非常重要的作用，特別是早期妊娠的維持需要足夠量的孕酮，已有研究表明，妊娠期孕酮量水平低下時(shí)會(huì)引發(fā)先兆流產(chǎn)或難免流產(chǎn)[7]。與此同時(shí)，高劑量的雌激素通過與雌激素受體結(jié)合，可介導(dǎo)細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)胚胎及子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，增加胚胎DNA突變的可能性[8]。故CYP17基因等位突變可通過激素水平的變化影響早期胚胎的發(fā)育，導(dǎo)致早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的發(fā)生。本研究組認(rèn)為CYP17突變基因型可能是RPL患者的危險(xiǎn)因素之一，攜帶有CYP17A2等位基因的人群發(fā)生早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的幾率明顯升高。故在臨床治療中可針對(duì)易感人群采用激素替代療法，糾正其體內(nèi)的孕酮水平，從而降低早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的發(fā)生率。

[1]Smith M L，Schust D J.Endocrinology and recurrent early pregnancyloss[J].Semin Reprod Med,2011,29(6):482-490.

[2]Rai R,Regan L.Recurrent miscarriage[J].Lancet，2006,368(9535):601-611.

[3]Ohnishi T,Ogawa Y,Saibara T,et al.CYP17 polymorphism as a risk factor of tamoxifen-induced hepatic steatosis in breast Cancer?patients[J].Oncol Rep,2005,13(3):485-489.

[4]張麗娜,錢碧云,陳可欣，等.CYP17基因多態(tài)性與天津漢族女性散發(fā)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究[J].中國腫瘤臨床,2008,35(9):530-533.

[5]Sata F,Yamada H,Yamada A,et al.A polymorphism in the CYP17 gene relates to the risk of recurrent pregnancy loss[J].Mol Hum Reprod,2003,9(11):725-728.

[6]Auchus R J,Lee T C,Miller W L.Cytochrome b 5 augments the 17,20-lyase activity of human P450c17without direct electron transfer[J].J Biol Chem,1998,273(6):3158-3165.

[7]龍鳳宜,范江濤,李建華，等.血清孕酮,IL-8,TNF-α在先兆流產(chǎn)中的意義[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2006，22(2):92-94.

[8]Setiawan V W,Schumacher F R,Haiman C A,et al.CYP17 genetic variation and risk of breast and prostate cancer from the Nation?al Cancer Institute Breast and Prostate Cancer Cohort Consortium(BPC3)[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(11):2237-2246.

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

Study on the Relationship between Polymorphisms of Genes CYP17 and Early Recurrent Pregnancy Loss in Datong Region

MU Ya-qin,ZHU Zhuang-yan,WANG Jian,XI Guo-ping,QI Cai-xia,ZHAO Fu-xi*
(Institute of Immunology，Shanxi Datong University，Datong Shanxi,037009)

Objective To investigate the relationship between polymorphisms of CYP17 involved in early recurrent pregnancy loss.Methods PCR-RFLP was used to detect the MspA1Ⅰpolymorphism of CYP17 in a case-control study including 58 cases of RPL and 73 cases as controls.Results There was a significant difference in the frequencies of genotypes A1/A1，A1/A2，A2/A2 in CYP17 MspA1Ⅰbetween two groups（χ2=7.817，P=0.020）.Compared with wild-type A1/A1，the susceptibility of RPL with muta?tional genotypes of A2/A2 and A1/A2 was increased by3.181 and 3.123 respectively.Conclusion The gene polymorphism of CYP17 MspA1Ⅰhas correlation with early RPL risk from Datong population.Mutational CYP17 genotypes may increase the risk of recurrent abortion，and might be one factor of the genetic susceptibility of early RPL.

early RPL；CYP17 gene polymorphism；PCR-RFLP

R714.21

A

1674-0874(2015)03-0040-03

2015-01-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目[81170621/H0425]；山西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目[2010021036-4]；國家人口計(jì)生委項(xiàng)目[C-73]

穆雅琴（1980-），女，山西原平人，碩士，講師，研究方向：生殖免疫；*趙富璽，男，博士，教授，通信作者。