利用玉米芯水解液產蘋果酸的戴爾根霉突變菌株選育及代謝分析

孫 婷，楊 英，王華林，汪海濤，吳學鳳，張 旻，陳小舉，潘麗軍，姜紹通，李興江，*

（1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽建筑大學環境與能源工程學院，安徽 合肥 230601）

利用玉米芯水解液產蘋果酸的戴爾根霉突變菌株選育及代謝分析

孫 婷1，楊 英2，王華林1，汪海濤1，吳學鳳1，張 旻1，陳小舉1，潘麗軍1，姜紹通1，李興江1，*

（1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽建筑大學環境與能源工程學院，安徽 合肥 230601）

誘變篩選發酵玉米芯水解液高產蘋果酸的根霉屬菌株，并對其進行代謝分析，研究其高產蘋果酸的機理。對分離得到的菌株進行ITS序列鑒定，進一步利用軟X射線輻射對菌種進行誘變篩選、對出發菌株和突變菌株的相關酶活力進行測定及代謝通量分析。利用軟X射線輻射結合丙烯醇平板篩選乙醇脫氫酶缺陷型菌株，得到突變株-1，發現其乙醇脫氫酶基因的3 處密碼子突變為“TAA”，阻斷了突變菌株的乙醇代謝途徑。進而利用軟X射線輻射結合氟乙酸平板篩選乙醛酸循環缺陷型菌株，得到復合突變株-2，降低了副產物富馬酸及琥珀酸的產量。復合突變株-2的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶中幾處NADP（H）結合位點發生突變，增加了糖酵解和磷酸戊糖兩種途徑的相互作用，促進了其戊糖代謝。經過兩步分離篩選，得到的復合突變株-2能發酵玉米芯水解液高產蘋果酸，且減少了副產物乙醇、富馬酸、琥珀酸的生成。復合突變株-2的蘋果酸產量占代謝物總產量的比例由出發菌株的71%增加到91%，蘋果酸產量增大1倍，研究成果對工業化利用突變菌株生產蘋果酸具有重要意義。

蘋果酸；玉米芯水解液；代謝通量分析；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶

蘋果酸是一種重要的有機酸，廣泛運用于食品和化學等領域。與檸檬酸相比，蘋果酸酸度大、產熱低，味道柔和、持久且具特殊香味，被譽為“最理想的食品酸味劑”［1］。目前制備蘋果酸的方法主要有2 種［2-3］：一是一步發酵法，利用霉菌直接發酵糖質原料產蘋果酸；二是兩步發酵法，利用2 種不同功能的微生物，將糖質原料先轉化為延胡索酸，再轉化為蘋果酸。其中一步發酵法篩選出高效菌株是關鍵，也是難點所在，兩步發酵法對發酵條件要求很嚴格，且發酵周期長，產酸率較低，蘋果酸對糖的產率一般為60%左右，副產物也較多，不適合工業化生產。而一步發酵法可以避免上述的缺點，且產物安全性高，備受消費者青睞。因此，基于可再生非糧生物質原料一步發酵法制備蘋果酸更有潛力，這也是本實驗的創新所在，分離篩選出的戴爾根霉突變菌株可利用生物質原料一步發酵產蘋果酸，產量高且副產物低。在中國，每年有100萬t的玉米芯廢棄物，利用率低，隨著發酵技術進步，可以利用玉米芯水解液發酵產蘋果酸。這對食品、化學領域都具有重要意義［4］。

國內外有關生物質原料發酵有機酸的報道很多，研究最熱的是米根霉發酵產乳酸，但尚未有關于生物質發酵產蘋果酸的報道。Maas等［5］利用小麥秸稈水解液發酵產乳酸，木糖利用率10.3 g/L，葡萄糖利用率19.2 g/L，最終產乳酸6.8 g/L，乙醇5.7 g/L，產量低且副產物多；Park等［6］用辦公廢紙水解液（包括82.8 g/L葡萄糖、7 g/L木糖、3.4 g/L纖維二糖）發酵產49.1 g/L的乳酸，發酵產量有待進一步提高；Bai Dongmei等［7］利用玉米芯水解液發酵60 h可產乳酸65 g/L，說明玉米芯相對于其他生物質原料更具發酵潛力。以上研究雖然不是發酵產蘋果酸，但是由于發酵菌株的同源性以及五、六碳糖代謝的相似性，故具有很高的借鑒意義［8］。

本實驗分離得到一株能發酵玉米芯水解液產蘋果酸的根霉菌株。但作為生產菌種，其代謝過程伴隨大量副產物生成。本實驗的重點是以其作為出發菌株進行準確的代謝分析，通過胞內代謝通路及關鍵酶基因操作定向選育突變菌株［9］。采用物理輻射誘變結合化學試劑篩選的方法，通過改變代謝酶活性來調控代謝過程，以達到降低副產物形成、提高蘋果酸產量的目的。關鍵酶基因表征分析解釋了關鍵酶活性變化的實質，進一步解釋了突變菌株產物、副產物的代謝流量變化，關鍵酶基因操作對代謝通量改變、代謝途徑變化、代謝網絡建立都具重要意義，也是初級代謝網絡建立的科學聚焦之處。

本實驗在代謝途徑和代謝通量分析的基礎上，圍繞關鍵點定向選育菌株，降低了富馬酸、琥珀酸、乙醇的產量，促進了五碳糖和六碳糖共代謝，增加了蘋果酸產量，為實現產業化打下了基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

原始菌株分離自豐原集團發酵工廠的發酵污染液，后由合肥工業大學農產品加工研究院紹通菌種保藏中心誘變選育及保存。

1.1.2培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L 、瓊脂20 g/L，自然pH值；分離培養基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、 溴甲酚綠0.1 g/L、自然pH值；發酵培養基：玉米芯水解液125 g/L、（NH4）2SO42 g/L、 K2HPO40.8 g/L、MgSO40.3 g/L、ZnSO40.2 g/L、CaCO3調pH值至5.0。

1.1.3玉米芯水解液

玉米芯由豐原集團收集，切碎碾磨成直徑小于1.0 mm的顆粒，進行稀酸酸解和酶解。取原料1 000 g，按照固液比1∶5（m/V）的比例加入質量分數為0.4%的稀酸，攪拌速率100 r/min，高壓罐中160 ℃持續加壓20 s后，減壓蒸汽爆破。經洗滌的固體殘渣在52 ℃條件下酶解，所用酶為纖維素酶（Genencor，Spezyme CP）和真菌的β-葡萄糖苷酶（Novozym 188，Novozymes A/S），攪拌速率120 r/min，持續72 h。1 000 g玉米芯得約450 g總糖（葡萄糖與木糖比例約4∶1），將總糖濃縮成約125 g/L（含葡萄糖100 g/L和木糖25 g/L）用作進一步發酵。

1.2儀器與設備

E2695高效液相色譜儀 沃特斯中國有限公司；Aminex HPX-87糖分析柱 北京京京未來科技發展有限公司；1790氣相色譜儀 北京興延誠博科技有限公司；MicroSpin S-400 HR聚合酶鏈式反應柱 沃特曼公司；721型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；YX280A全自動高壓滅菌鍋 上海三申儀器有限公司；ZC-100B恒溫氣浴搖床 上海申勝生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株分離

從豐原集團20 m3染菌的檸檬酸發酵罐中取100 mL發酵液于250 mL三角瓶中，32 ℃、200 r/min搖瓶培養2 d，搖瓶內壁挑取菌絲通過含有溴甲酚綠的PDA培養基分離。

1.3.2菌株誘變與篩選

菌株培養3 d（1.3.1節得到的菌株），挑取孢子在軟X射線下輻射2 min（物理射線技術支持由中國科學技術大學提供）。將孢子稀釋并涂布到含有丙烯醇的培養基平板上（15 g/L瓊脂、2～10 mL/L丙烯醇），篩選存活細胞菌落用于進一步的研究；將上一步軟X射線輻射誘變得到的菌株涂布于氟乙酸平板上（15 g/L瓊脂，5～30 g/L氟乙酸），30 ℃培養30 h，篩選出生長旺盛的突變菌株。

1.3.3發酵罐發酵培養

發酵采用15 L發酵罐，裝液量10 L，接種量1 L（孢子懸液體積分數10%），發酵溫度30 ℃，通氣量0.4 L/（L·min），攪拌速率500 r/min。

1.3.4ITS序列分析

從凍干的細胞中提取DNA，進行ITS序列（18S rDNA和5.8S rDNA間的ITS1，5.8S rDNA和28S rDNA間的ITS2）分析，測序采用引物參考相關文獻［10］，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR產物純化用MicroSpin S-400 HR柱。ITS序列測序由寶生物工程（大連）有限公司完成，并通過GenBank中BLAST程序進行相似性分析。

1.3.5系統發育樹構建

構建系統發育樹前將樣本序列保存為txt文本文件，序列只包含序列字母（ATCG或氨基酸簡寫字母），然后將需要構建系統樹的序列導入MEGA軟件，DNA序列進行比對后選擇NJ法進行構建，選擇Kimura 2-parameter模型，Bootstrap次數為1 000，最終生成系統發育樹圖。

1.3.6代謝通量分析

代謝通量分析用于計算形成的胞內代謝物：ATF=r，式中：r為網絡中形成的代謝產物速率/（mmol/（g·h））；F為內部反應速率/（mmol/（g·h））；A為所有反應物和生成物的總化學計量矩陣；T為系統運算符號。代謝通量的計算可以利用Excel 2007中的MMULT和MINVERSE函數或者Matlab軟件。

1.3.7細胞生物量測定

發酵液過濾得殘渣，用0.01 mol/L的HCl溶液充分洗滌，除去過量CaCO3，再用蒸餾水洗滌，得殘留菌體，于80 ℃烘干至恒質量，得到菌體細胞生物量。

1.3.8殘糖及有機酸含量測定

利用Aminex HPX-87H柱進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。洗脫劑：5 mmol/L H2SO4，流速：0.5 mL/min，溫 度：65 ℃。配制0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/L殘糖及有機酸標準溶液，經HPLC分析后繪制標準曲線，由此計算發酵液中殘糖及有機酸含量。

1.3.9乙醇含量測定

采用1790氣相色譜儀，色譜柱采用DB-WAX毛細管柱，N2為載氣，流速為15 mL/min，進樣器溫度240 ℃，柱溫220 ℃，檢測溫度250 ℃，進樣量1 μL，分流比1∶100，外標法定量。

1.3.10蛋白質含量測定

［11］，采用布拉德福德法測定發酵液蛋白質含量。

1.3.11酶活力檢測

木糖還原酶（xylose reductase，XR）活力測定參考文獻［12］，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）活力測定參考文獻［13］，異檸檬酸裂解酶活力測定參考文獻［14］，蘋果酸脫氫酶活力測定參考文獻［15］，丙酮酸羧化酶活力測定參考文獻［16］，琥珀酸脫氫酶活力測定參考文獻［17］，富馬酸水合酶活力測定參考文獻［18］。檸檬酸合成酶、烏頭水合酶（aconitate hydratase，ACO）、蘋果酸酶、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、α-酮戊二酸脫氫酶、磷酸果糖激酶、蘋果酸合成酶活力均利用試劑盒測定。

1.3.12相關酶基因檢測

基因組DNA是從冷凍干燥的細胞中提取并進行擴增和測序。引物序列如下：ADH引物分別為A1和A2（A1：5'-ATGTCTGAAGAAAC-3'，A2：5'-TTAGTTCATGACGAG-3'）；ACO引物分別為K1和K2（K1：5'-ATGATCTCTGCTTAT'，K2：5'-TCACACATGGTTAAT-3'）；G6PDH引物分別為P1和P2（P1：5'-ATGTCGCATGAAAGTTAC-3'，P2：5'-TTAAAGCTTGTTGGAAGA-3'）；XR引物分別為X1和X2（X1：5'-ATGGAAGAATATGCGC-3'，X2：5'-TTATTTACTCAAATCATG-3'）。

2　結果與分析

2.1出發菌株Rhizopus delemar HF-119的分離及代謝分析

2.1.1出發菌株的分離鑒定

從豐原集團20 m3染菌的檸檬酸發酵罐中取100 mL發酵液于250 mL搖瓶培養2 d，搖瓶內壁挑取菌絲通過含有溴甲酚綠的PDA培養基分離，挑取生長旺盛的菌株進一步分離，篩選得到產生大的黃色透明圓圈的菌株，如圖1所示。

圖1　分離得到出發菌株Fig.1 Isolated colonies of the parent strain

圖2　出發菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the parent strain

如圖2所示，將出發菌株的ITS區域序列結果提交到GenBank進行分析，結果顯示出發菌株與已有根霉屬幾種菌有99%的高度同源性，分析發現出發菌株代謝過程涉及的相關酶也較為相近，尤其與戴爾根霉菌較相近，故命名為根霉屬中的戴爾根霉菌Rhizopus delemar HF-119（后統稱出發菌株），將其序列與相近菌株序列進行比對，運用MEGA軟件采用NJ法構建系統發育樹。

2.1.2出發菌株的基本碳源利用情況

以下面4 種碳源進行發酵產酸：玉米芯水解液125 g/L、葡萄糖+木糖（葡萄糖100 g/L、木糖25 g/L）、葡萄糖（分析級）100 g/L、木糖（分析級）25 g/L。發酵結果如圖3、4所示。

圖3　以生物質糖源與分析級糖源為碳源的蘋果酸產量（A）、菌體生物量（B）和碳源殘余量（C）的比較Fig.3 Malate output （A）， BM synthesis （B） and consumption of carbon source （C） from corn cob hydrolysate and analytical-grade sugars

圖4　4 種碳源的消耗情況比較Fig.4 Comparison of consumption of four carbon sources

由圖3、4可知，葡萄糖100 g/L、木糖25 g/L的混合糖源與玉米芯水解液相比，蘋果酸產量、產酸率略高、菌體生物量略低，碳源的消耗速率大體相同，二者差異并不顯著，故以混合的葡萄糖+木糖作為發酵原料代替玉米芯水解液進行代謝流量分析，減少玉米芯水解液中未知成分對于代謝流量所造成的影響。圖4顯示發酵進行60 h后，25 g/L的木糖還剩下16.5 g/L，且蘋果酸產量與細胞生物都很低，說明分離的出發菌株可以利用木糖發酵，但發酵效率還需通過誘變篩選進一步增強。

2.1.3出發菌株的發酵進程研究

在出發菌株發酵的過程中，檢測葡萄糖、木糖消耗量，蘋果酸、富馬酸、乙醇產量及菌體生物量，結果如圖5所示。出發菌株主要代謝產物為蘋果酸，發酵60 h時蘋果酸質量濃度達到60.5 g/L，但同時也伴隨大量富馬酸、乙醇等副產物生成。木糖被消耗證明該菌株的磷酸戊糖途徑（hexose monophophate pathway，HMP）被激活，后續誘變篩選可圍繞增強HMP途徑開展。

2.1.4出發菌株的代謝酶活力分析

表1　關鍵酶活力分析Table 1 Key enzyme activity analysis of the parent strain

檢測出發菌株相關酶活力，結果如表1所示。分析表中酶活力可知，出發菌株蘋果酸生成來自以下三部分：1）由草酰乙酸轉化得到，因為PC和MDH活性較高；2）由丙酮酸合成，因ME活性較高；3）由乙醛酸循環中ISOC催化得到，因為無KDH活性，三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）受阻，檢測到CS、ACO、ISOC、MS活性，說明存在乙醛酸循環。同時產生副產物富馬酸和琥珀酸是由于缺少α-KDH和FUMH，只能通過乙醛酸循環中ISOC催化得到。XR、XDH、XK是木糖轉化為5-磷酸木酮糖的關鍵酶，也是HMP途徑的重要部分，說明該出發菌株可進行木糖代謝。

2.1.5出發菌株的代謝途徑分析及代謝網絡構建

在出發菌株關鍵酶活力分析基礎上，結合研究已經較為透徹的蘋果酸代謝途徑分析。首先，菌株代謝潛力明顯，即菌株代謝入口具備五、六碳糖共代謝特征，這為廣譜的生物質轉化提供了可能。其次，菌株蘋果酸合成來源多樣化，尤其上游的丙酮酸羧化途徑及蘋果酸酶合成途徑均是典型的CO2固定化途徑，使得菌株具備較高的碳得率的優勢，進一步構建代謝網絡（圖6）。

圖6　出發菌株的代謝網絡［199--2211］Fig.6 Metabolic network for the parent strain［19-21］

在生物反應方程式與主要產物分析的基礎上繪制出發菌株的基本代謝途徑，通過關鍵酶分析建立代謝網絡模型。圖6中清晰顯示蘋果酸主要來自3 條途徑，分別對應蘋果酸1、蘋果酸2、蘋果酸3，副產物富馬酸、檸檬酸、琥珀酸、乙醇對應的代謝途徑是主要改造對象，尤其是糖酵解與HMP途徑相偶聯的NADPH生成途徑，為菌株能量平衡帶來了重要的調控突破點。

2.1.6出發菌株的代謝通量分析

根據生物反應式及建立的代謝網絡列出代謝通量方程式，如表2所示。

表2　代謝通量方程式Table 2 Metabolic flux equations

表2列出60 個流量方程式及其流量值。其中41 個方程式（（1）～（41））從基礎質量平衡的生物反應式中獲得，另外11 個方程系數參考文獻［19-21］獲得。其他方程式（包括底物攝入（53）、（54），產物輸出（55）～（59），檢測生物量（60））都是直接測得的。本實驗計算這部分的數據通過用代謝物凈變化量趨于穩定的量除以該穩定階段的時間獲得。細胞生物量幾乎在40～50 h時固定，特別選擇此時期進行代謝通量分析。整個體系通量數據有60 個相對應的反應式，通過矩陣計算這些通量如表3所示。

表3　代謝通量數據Table 3 Original metabolic flux data（mmol/（g·h））

出發菌株的通量數據如表3第一列所示，代謝通量最多的是蘋果酸，主要通過以下3 條途徑得到，其中75%的蘋果酸來自草酰乙酸，18%來自乙醛酸，7%來自丙酮酸。副產物乙醇和富馬酸代謝通量高，需進一步消弱。木糖的代謝通量為0.059 5 mmol/（g·h），與葡萄糖相比消耗量低，說明HMP途徑需進一步加強。

2.2突變株-1的選育及代謝分析

2.2.1突變株-1的選育

軟X射線誘變出發菌株 ，選取丙烯醇含量為2、4、6、8、10 mL/L的平板進行菌株篩選，結果表明丙烯醇含量過低抑制效果不明顯，丙烯醇含量在6 mL/L時，出發菌株即被顯著抑制，基本不生長，少數缺陷型突變株生長，因而選擇6 mL/L丙烯醇進行誘變篩選。

2.2.2突變株-1的發酵進程分析

軟X射線輻射結合丙烯醇誘變出發菌株得到突變株-1，繪制突變株-1的發酵進程曲線并和出發菌株進行基礎發酵參數比較，結果如圖7所示。

圖7　突變株-1的發酵進程Fig.7 Time course of fermentation by mutant strain-1

與出發菌株相比，突變株-1在發酵時間、菌體生物量、殘糖含量等發酵參數上基本沒有變化，但蘋果酸產量顯著增加，副產物乙醇質量濃度明顯減少。結合表3的代謝通量數據可知，蘋果酸通量由出發菌株的1.056 5 mmol/（g·h）增加到1.388 5 mmol/（g·h）（F3），主要由于來自草酰乙酸這部分的通量從0.785 7 mmol/（g·h）增加到1.086 3 mmol/（g·h）（F41）。

2.2.3突變株-1的相關酶活力分析

為了解釋代謝通量機制，測定突變株-1的相關酶活力并與出發菌株酶活力進行比較，結果如圖8所示。

圖8　出發菌株與突變株-1的相關酶參數Fig.8 Key enzyme activities involved from the parent strain and mutant strain-1

與出發菌株相比，突變株-1的乙醇脫氫酶（ADH）活力從259.4 U/mg減少至0，引起乙醇急劇減少，丙酮酸羧化酶（PC）活力從265.6 U/mg增加到304.6 U/mg，蘋果酸脫氫酶（MDH）活力從623.0 U/mg增加為666.3 U/mg。這些關鍵酶活力的改變對應引起代謝通量和代謝物產量的變化。

2.2.4突變株-1的突變基因表征

乙醇脫氫酶可以將丙烯醇轉化為對細胞有致死毒性的丙烯醛，常采用此方法進行乙醇阻斷選育，篩選到能在丙烯醇平板上良好生長的突變株，往往其乙醇脫氫酶發生了不可逆的致死性突變。對乙醇脫氫酶的基因進一步研究，分析比較出發菌株和突變株-1的乙醇脫氫酶基因序列，NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）登錄號分別為KF060237和KF060238。對比發現在突變株-1的乙醇脫氫酶基因中有3 處密碼子（GAA、GAA、CAA）突變成了“TAA”，導致了乙醇脫氫酶活力的改變。

2.3復合突變株-2的選育及代謝分析

2.3.1復合突變株-2的選育

采用軟X射線誘變突變株-1，選取氟乙酸質量濃度為5、7、10、12、15 g/L的平板進行菌株篩選，結果表明氟乙酸質量濃度過低時其抑制作用不明顯，當氟乙酸質量濃度為7 g/L時，出發菌株出現被顯著抑制，基本不生長的現象，因而選擇7 g/L氟乙酸進行誘變篩選，挑取那些在此條件下能夠生長的缺陷型突變株。

2.3.2復合突變株-2的發酵進程分析

軟X射線輻射結合氟乙酸誘變突變株-1得到復合突變株-2，繪制復合突變株-2的發酵進程曲線并和出發菌株、突變株-1進行基礎發酵參數比較，如圖9、10所示。

圖9　復合突變株-2的發酵進程Fig.9 Time course of fermentation by mutatnt strain-2

圖10　出發菌株、突變株-1及復合突變株-2的基礎發酵參數比較Fig.10 Basic fermentation parameters from the parent strain， mutant strain-1 and mutant strain-2

經過誘變篩選得到復合突變株-2，將其與出發菌株、突變株-1進行基礎發酵參數的比較，發現復合突變株-2在發酵時間、菌體生物量、殘糖含量方面基本沒有變化，但蘋果酸產量由60.5 g/L增加到122 g/L，副產物乙醇、富馬酸產量明顯減少，木糖代謝途徑得到增強，此外還具有一定量的檸檬酸生成。

2.3.3復合突變株-2的代謝通量分析

復合突變株-2代謝通量如表3所示，復合突變株-2的蘋果酸通量由1.388 5 mmol/（g·h）增加到2.162 7 mmol/（g·h）（F3），其中從丙酮酸轉化成蘋果酸的通量由0.0 7 2 1 m m o l/（g·h）增 加到0.422 3 mmol/（g·h）（F34），從草酰乙酸轉化成蘋果酸的通量由1.086 3 mmol/（g·h）增加到1.711 8 mmol/（g·h）（F41），從乙醛酸轉化成蘋果酸的通量從0.230 1 mmol/（g·h）減少到0.028 7 mmol/（g·h）（F48），這一系列變化有效地減少了副產物生成，增強了木糖代謝途徑。

綜合分析兩次誘變結果，第一次輻射結合烯丙醇平板篩選得到突變株-1，與出發菌株相比，蘋果酸代謝通量從1.056 5 mmol/（g·h）增加到1.388 5 mmol/（g·h）（F3），增加了31.42%，乙醇代謝通量從0.403 5 mmol/（g·h）減少為0（F43），這說明突變株的乙醇代謝途徑被阻斷；琥珀酸由0.039 7 mmol/（g·h）減少至0.015 9 mmol/（g·h）（F50），減少了59.95%，富馬酸由0.158 6 mmol/（g·h）增加到0.214 1 mmol/（g·h）（F58、F59），增加了35.06%，副產物富馬酸的增加可能是由于乙醇代謝途徑阻斷而使得其他代謝途徑增強所致。對于突變株-1進一步進行軟X射線輻射結合氟乙酸篩選得到復合突變株-2，蘋果酸代謝通量增加了55.76%，富馬酸代謝通量減少了88.52%，琥珀酸通量減少了74.84%，乙醇代謝通量依然是0。 由此說明第二次誘變不僅保證了第一次突變誘變菌株的優良性狀，而且進一步提高了蘋果酸產量，降低了富馬酸、琥珀酸產量。整體來說，兩次誘變蘋果酸代謝通量增加了1.106 2 mmol/（g·h），其中第一次誘變貢獻了30.01%，第二次誘變貢獻了69.99%。

2.3.4復合突變株-2的關鍵酶酶活力表征與分析

測定復合突變株-2相關酶活力，與出發菌株及突變株-1進行比較，結果如圖11所示。

圖11　出發菌株、突變株-1及復合突變株-2涉及的關鍵酶活力分析Fig.11 Key enzyme activities involved from the parent strain， mutant strain-1 and mutant strain-2

復合突變株-2的ACO活力由88.6 U/mg減少至4.4 U/mg，阻斷了乙醛酸循環，有效地減少了富馬酸和琥珀酸的生成，ISOC的活力減少進一步加強了阻斷效果。PFK的活力從150.5 U/mg減少至120.5 U/mg，降低糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP）途徑的代謝通量，抑制檸檬酸積累。

復合突變株-2的蘋果酸流量合成主途徑主要來自丙酮酸的羧化及草酰乙酸的氫化，但綜合分析發現細胞的總體還原力（能量） 處于平衡，并沒有結余，則細胞生長、活動及代謝所需能量必須有其他結余能量途徑來彌補，對突變株的發酵過程及代謝通量深入分析發現木糖代謝得到有效加速以及HMP途徑流速得到顯著提升，其EMP/HMP流量穿梭提升的背后肯定與突變株在此步驟中的代謝關鍵酶有關聯，進一步的酶活力分析表明，突變株的G6PDH（此步驟的關鍵酶）活力顯著提升。此關鍵酶具有提供2 倍的還原性H（NADPH）的能力，以此來彌補突變株-1在乙醛循環中丟失的還原性H（NAD和FADH），且增加戊糖磷酸途徑的代謝通量。G6PDH能提供木糖還原酶、ME催化過程中需要的關鍵輔助因子NADPH，所以某種意義上通過活化G6PDH能增強木糖與ME代謝。通過酶基因及酶蛋白數據庫（http：//enzyme. expasy.org）分析表明，該酶蛋白常在90～100的氨基酸序列范圍與NADPH（NADP+）具有較活躍的結合位點，而通過對比復合突變株-2與出發菌株的G6PDH關鍵酶基因序列及氨基酸序列發現，復合突變株-2在第88、92、100、102位發生了多處突變，這也進一步說明突變株中該關鍵酶基因的多處突變與其酶活力改變（包括與NADPH/NADP+的結合能力）及細胞能力供給系統的平衡可能是相關的，從而改變相關代謝通量。

出發菌株與復合突變株-2 ACO基因序列的NCBI登錄號分別是KF060239和KF060240，G6PDH基因的NCBI登錄號分別是KF041003和KF041003。綜上所述，ACO基因序列有幾處突變位點引起酶活力的降低，解釋了其下游富馬酸及琥珀酸代謝通量顯著降低的原因；G6PDH基因序列中位于NADP（H）結合區域的部分序列發生突變，增強了其與NADP+的結合，提高了其催化能力。

3　結 論

以一步發酵法產蘋果酸為基礎，通過誘變篩選得高產蘋果酸且副產物減少的復合突變菌株-2，該菌株由于乙醇脫氫酶突變缺陷降低了乙醇產量，乙醛酸循環突變缺陷降低了富馬酸和琥珀酸產量，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶NADP（H）活動位點突變增加EMP和HMP相互作用，促進了戊糖途徑。經過兩步選育，復合突變株-2的蘋果酸產量占代謝物總產量的比例由出發菌株的71%增加到91%，蘋果酸產量由出發菌株的60.5 g/L增加1 倍，大幅度提高了蘋果酸產量。代謝途徑分析證明復合突變株-2菌株能利用玉米芯水解液進行五、六碳糖共代謝，這對于農業廢棄物利用具有重要意義。復合突變株-2產酸量高、副產物低，復合突變株-2的獲得及代謝選育研究為工業化生產蘋果酸提供了一定的理論依據與應用價值。

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Mutation and Metabolism Analysis for a Malic Acid-Producing Rhizopus delemar Strain Utilizing Corn Cob Hydrolysate

SUN Ting1， YANG Ying2， WANG Hualin1， WANG Haitao1， WU Xuefeng1， ZHANG Min1， CHEN Xiaoju1， PAN Lijun1，JIANG Shaotong1， LI Xingjiang1，*
（1. School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China；2. School of Environment and Energy Engineering， Anhui Jianzhu University， Hefei 230601， China）

High-level production of malic acid by fermentation of corn cob hydrolysate with an isolated Rhizopus delemar strain was expected. Then metabolic analysis and research of the underlying mechanism were carried out. Phylogenetic analysis based on ITS region sequences was carried out for the identifi cation of X-ray-induced mutant strains， and the key enzyme activities and metabolic fl ux were also analyzed. The results showed 3 “TAA” codons in the alcohol dehydrogenase gene of the anti-allyl mutant strain， which interrupt the pathway of ethanol metabolism. The breeding for the antifl uoroacetate mutant strain succeeded to decrease the fl ux of fumaric and succinic acid. Some NADP （H）-binding loci were mutated in the G6PDH gene of the mutant， probably leading to increased interaction of Embden-Meyerhof-Parnas pathway with Hexose-Monophophate pathway and improved pentose metabolism. After two-step breeding and regulation for this isolated strain， the production of malic acid was enhanced markedly； the formation of ethanol， fumaric acid and succinic acid were decreased simultaneously. Compared with the parent strain， the proportion of malic acid in mutant strain-2 increased to 91% from 71% and the yield of malic acid was increased markedly， which is of signifi cance for deep industrial development.

malate； corn cob hydrolysate； metabolic fl ux analysis； glucose-6-phosphate dehydrogenase

TS201.3

A

1002-6630（2015）15-0090-08

10.7506/spkx1002-6630-201515018

2014-09-27

國家自然科學基金面上項目（31470002；31371859）

孫婷（1990—），女，碩士研究生，研究方向為工業微生物。E-mail：sunting@mail.hfut.edu.cn

李興江（1978—），男，副教授，博士，研究方向為發酵工程代謝調控。E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn