韓國泡菜加工過程中微生物區系的研究

甘 奕，李洪軍，付 楊，賀稚非*，倪冬冬

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716）

韓國泡菜加工過程中微生物區系的研究

甘 奕，李洪軍，付 楊，賀稚非*，倪冬冬

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716）

為了解韓國泡菜在制作過程中微生物的區系，分離鑒定其在腌制、發酵過程中的優勢微生物。結果表明：韓國泡菜腌制過程中優勢乳酸菌經鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；優勢酵母菌為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）；韓國泡菜在發酵過程中的優勢乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）；優勢酵母菌為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

韓國泡菜；優勢微生物；分離鑒定

韓國泡菜（kimchi）以新鮮蔬菜為主要原料，佐以姜、蒜、蔥、蘿卜和各種水果以及鹽、辣椒面等調味料，經鹽腌、拌料，在低溫條件下經微生物發酵而成，堪稱韓國“第一菜”［1］；與德國的酸甜甘藍、西歐的酸黃瓜、中國涪陵榨菜并稱世界四大醬腌菜。

韓國泡菜因其熱量低，含有豐富的營養物質，具有維持人體腸道健康［2］、抗菌［3-4］、抗肥胖［5］、抗衰老［6］、抗腫瘤［7］等特點，并因旅游業的發展而受到國內外消費者的喜愛。韓國每年大約消耗145 萬t泡菜，1996年韓國泡菜生產量為29.5 萬t，到2002年為50 萬t［8］；1999年韓國本土的泡菜市場產值大約是2 萬億韓元（約合16.7 億美元）［9］，至今每年銷售收入達到24 億美元以上［10］；其品種已超過190 種［11］，并由原本的家庭作坊生產進入到工業化生產的成熟期［12］。泡菜的英文名“Kimchi”也被尼斯國際商品分類目錄收錄［13］；2008年通過俄羅斯生物醫學研究中心的不懈努力SK（太空泡菜）可以作為太空食品進入太空，并且保質期可以達到30 d［14］。如何高產、高質量地生產出韓國泡菜對韓國泡菜產業的發展十分重要。若能參照制備酸奶發酵劑對韓國泡菜進行直投式發酵，不僅能加快發酵速率、提高泡菜的品質［15-16］，更能較好地推動泡菜產業的發展。而目前的研究主要集中于四川泡菜［17-18］，針對韓國泡菜的研究較少。

研究表明，明串珠菌類（Leuconostoc citreum）、融合乳桿菌（Weissella confusa）、沙克乳桿菌（Lactobacillus saker）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）對泡菜風味口感有著重要的作用［19］。微生物種類隨泡菜品種的不同而不同［20］，并受地域及腌制季節影響［21］。因此，對韓國泡菜生產過程中菌種的分離鑒定及菌種特征等的研究具有一定的經濟效益和社會效益。

本實驗以韓國泡菜為研究對象，分離鑒定其在腌制、發酵過程中的優勢微生物，以期為提高產品質量提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

大白菜、面粉、海鹽、白蘿卜、韭菜、紅蘿卜、姜、蘋果、梨、糖，均購于重慶永輝超市；韓國辣椒粉、魚露購于韓國樂天超市。

1.2儀器與設備

FA2004分析天平 上海精密科學儀器有限公司；SS-325高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；DHP-9272電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 江蘇蘇凈安泰空氣技術有限公司；MJ-160霉菌培養箱 上海躍進醫療器械廠；B203生物顯微鏡重慶奧特光學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1韓國泡菜的制作

將新鮮的整棵白菜豎切分成兩半或四等份，用海鹽均勻涂抹在每層白菜葉表面，室溫腌制8～10 h后清水清洗并將水排盡；將紅蘿卜、白蘿卜、韭菜切成細絲；蘋果、梨、姜制成泥狀；取少量面粉，煮成熟面粉；調料配制：向熟面粉里加入適量韓國辣椒面、魚露、白糖、鹽、（蘋果、梨、姜）泥，攪拌后加入蘿卜絲、韭菜絲；將配好的調料由白菜芯開始均勻地抹于每一片白菜葉，直至外層的葉子抹完；用最外層葉子將白菜包住，將辣白菜整齊地放進容器里；放有泡菜的容器放入0～4 ℃冰箱。

1.3.2微生物區系的分離鑒定

選擇腌制第6小時、發酵第15天的泡菜樣品的計數平板分離純化進行微生物的鑒定。

1.3.2.1劃線分離

分別從泡菜腌制階段和發酵階段的MRS培養基、PDA培養基計數平板的表面以及內部挑取外觀形態不一樣的菌落，分別在MRS培養基、PDA培養基采取交叉劃線法，劃線3～4 次，直至培養得出純菌落。

1.3.2.2菌種保存

將分離得到的微生物純菌落接種于相應的斜面培養基，編號、記錄，適宜環境中充分生長后，放置于4 ℃冰箱內貯藏。

1.3.2.3菌種活化

微生物鑒定實驗前，將貯藏于冰箱內的菌種進行活化。無菌操作，用接種環挑取斜面培養基所保藏的菌種，在相應培養基上劃線分離并培養。

1.3.2.4微生物的鑒定

乳酸菌的鑒定方法：參照《伯杰細菌鑒定手冊》［22］。

菌落形態觀察：菌落的大小和形狀、邊緣、表面、透明度、隆起形狀、菌落及培養基的顏色等。

細胞形態的觀察：挑取純單菌落進行革蘭氏染色并用顯微鏡油鏡觀察細胞形狀和排列方式。

生理生化特征的鑒定：主要包括生長NaCl耐受性實驗、接觸酶實驗、精氨酸產氨實驗、硝酸鹽還原實驗、生長溫度耐受性實驗、生長pH值耐受性實驗、M.R.實驗、糖醇發酵實驗、V.P.實驗等。具體操作及培養基的配制均參照《伯杰細菌鑒定手冊》。

酵母菌的鑒定方法：參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》［23］。

菌落形態觀察：菌落大小、表面形狀、凸起、邊緣、表面光澤、菌落質地、透明度、氣味等。

細胞形態的觀察：取菌落于載玻片上，直接用顯微鏡觀察細胞形態和排列方式。

生理生化特征的鑒定：主要包括碳源同化實驗、氮源同化實驗、產類淀粉化合物實驗、耐高滲透壓實驗，觀察擲孢子、假菌絲、子囊孢子等。具體操作方法參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》。

2　結果與分析

2.1韓國泡菜中優勢乳酸菌的分離鑒定結果

表1　韓國泡菜腌制和發酵過程中乳酸菌分離結果Table 1 Lactic acid bacteria isolated from kimchi during pickling and fermentationation

從腌制6 h韓國泡菜的各乳酸菌計數平板上總共挑取6 株形態不同的菌落，經分離純化及形態學初步鑒定，篩選出3 株形態與細胞形態各不相同的乳酸菌進行鑒定，編號A-1、A-2、A-3；從發酵15 d韓國泡菜的各乳酸菌計數平板上總共挑取15 株形態不同的菌落，經分離純化及形態學的初步鑒定，篩選出9 株菌落形態及細胞形態各不相同的乳酸菌進行鑒定，分別編號為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6、B-7、B-8、B-9。乳酸菌分離結果見表1及圖1。

圖1　韓國泡菜腌制和發酵過程中乳酸菌菌落形態與細胞形態（10×1000）Fig.1 Colonial morphology and micro-morphology of lactic acid bacteria （10 × 100）

根據表2實驗結果，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》初步鑒定出：A-1、A-2、B-6、B-7、B-8為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）；A-3、B-1、B-2、B-3為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；B-4、B-5為彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）；B-9為腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）。即腌制過程中主要的細菌是短乳桿菌、植物乳桿菌；發酵過程中主要的細菌除短乳桿菌、植物乳桿菌外；還有彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）；腸膜明串珠菌腸膜亞種。這主要因為韓國泡菜為低溫低鹽制得，以異型發酵為主，使得泡菜產品的酸味較淡、風味柔和飽滿。

表2　乳酸菌的鑒定結果Table 2 Results of lactic acid bacterial identification

2.2韓國泡菜中優勢酵母菌的分離鑒定結果

表3　韓國泡菜腌制和發酵過程中酵母菌分離結果Table 3 Yeasts isolated from kimchi during pickling and fermentation

從腌制6 h韓國泡菜的各虎紅瓊脂計數平板上總共挑取5 株形態不同的菌落，經分離純化及形態學初步鑒定，篩選出3 株形態與細胞形態各不相同的酵母進行鑒定，編號L-1、L-2、L-3；從發酵15 d韓國泡菜的各虎紅瓊脂計數平板上總共挑取8 株形態不同的菌落，經分離純化及形態學的初步鑒定，篩選出5 株菌落形態及細胞形態各不相同的乳酸菌進行鑒定，分別編號為N-1、N-2、N-3、N-4、N-5。酵母菌分離結果見表3與圖2。

圖2　酵母菌菌落形態與細胞形態（10×400）Fig.2 Colonial morphology and micro-morphology of yeasts （10 × 40）

表4　酵母菌的鑒定結果Table 4 Results of yeasts identification

根據表4碳源同化實驗、氮源同化實驗及其他生化反應結果，對照《酵母菌的特征與鑒定手冊》初步鑒定出：L-1、L-2、N-1、N-2為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）；L-3、N-3、N-4為粗狀假絲酵母（Candida valida）；N-5為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。即腌制的過程中主要的酵母菌是近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）；發酵過程中除這兩種酵母外，還有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。由于韓國泡菜屬于部分需氧、部分厭氧發酵，其揮發性風味物質中主要包括乙酸等物質［24］，因此與四川泡菜相比，韓國泡菜成熟后略帶酒精的風味。

3　結 論

本實驗結果表明，在韓國泡菜的不同制作階段，其優勢微生物種類不同。在腌制過程中的優勢乳酸菌為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；腌制過程中優勢酵母菌為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）。韓國泡菜在發酵過程中的優勢乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）；優勢酵母菌為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

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Microflora of Kimchi during Production

GAN Yi， LI Hongjun， FU Yang， HE Zhifei*， NI Dongdong
（Special Food Engineering and Technology Research Center of Chongqing， College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400716， China）

In order to explore the microflora of kimchi during the production process， the predominant microorganisms were isolated and identified. The results showed that during the pickling process of kimchi， the dominant lactic acid bacteria were Lactobacillus brevis and Lactobacillus plantarum； the dominant yeasts were Candida parapsilosis and Candida valida. The dominant lactic acid bacteria in kimchi during fermentation were Lactobacillus plantarum， Lactobacillus curvatus，Lactobacillus brevis and Lactobacillus mesenteroides subsp. mesenteroides； the dominant yeasts during fermentation were Candida parapsilosis， Candida valida， and Saccharomyces cerevisiae.

kimchi； dominant microorganisms； isolation and identification

TS255.54

A

1002-6630（2015）15-0118-05

10.7506/spkx1002-6630-201515022

2014-09-19

公益性行業（農業）科研專項（200903012）

甘奕（1989—），女，博士研究生，研究方向為食品質量與安全控制。E-mail：Lizzie_ganyi@hotmail.com

賀稚非（1960—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：2628576386@qq.com