馬克斯克魯維酵母對發酵乳中糖代謝的影響

范 維，張咚咚，張 彧，姜鐵民，陳歷俊，*

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.北京市乳品工程技術研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京 100076）

馬克斯克魯維酵母對發酵乳中糖代謝的影響

范 維1，2，張咚咚2，張 彧1，姜鐵民2，陳歷俊1，2，*

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.北京市乳品工程技術研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京 100076）

采用高效液相色譜等方法，對乳酸菌單獨發酵和向其中添加馬克斯克魯維酵母這兩種發酵乳中乳糖代謝主要產物及關鍵酶活力的變化情況進行對比分析，以確定添加酵母菌對乳糖無氧代謝產生乳酸途徑的影響。結果表明：添加酵母菌后乳糖降解速率明顯加快（P＜0.05），貯藏期間馬克斯克魯維酵母可以對積累的半乳糖進行利用；發酵過程中，由于酵母菌的添加使β-半乳糖苷酶及乳酸脫氫酶活力有顯著提高（P＜0.05），糖酵解途徑關鍵限速酶--己糖激酶和丙酮酸激酶活力增加（P＜0.05）；含有酵母菌的發酵乳pH值下降（滴定酸度上升）較乳酸菌單菌發酵快（P＜0.05），這與添加酵母菌后發酵乳中乳酸含量顯著增加（P＜0.05）有關；丙酮酸含量變化不顯著（P＞0.05）。該研究揭示了馬克斯克魯維酵母的添加對乳糖酵解具有一定促進作用。

乳糖代謝；馬克斯克魯維酵母；發酵乳；酶活力；代謝產物

一直以來，國內的乳制品主要以乳酸菌（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）發酵為主，關于酵母菌在乳制品中應用的研究很有限，尤其是酵母菌作為一種益生菌發酵劑［1］方面的研究還不夠深入。但東歐、非州、亞洲等很多傳統發酵乳制品（如開菲爾乳、非洲自然發酵乳、馬奶酒等）中，酵母和乳酸菌起著同樣重要的作用［2］。馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）作為一種廣泛存在于傳統發酵乳中的酵母，不僅可以發酵乳糖［3］，更能對半乳糖進行利用［4］，它的介入使得混合菌形成了一個復雜的微生態環境，賦予了產品獨特的風味及營養特性［5-6］。乳糖作為乳粉中唯一的碳源，在微生物發酵過程中起到至關重要的作用，故本實驗從糖代謝角度出發，通過研究添加馬克斯克魯維酵母后乳糖分解代謝過程中主要代謝產物（乳糖、葡萄糖、半乳糖、丙酮酸、乳酸）含量變化以及代謝關鍵酶（β-半乳糖苷酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、乳糖脫氫酶）活力的變化情況，來反映馬克斯克魯維酵母和乳酸菌混菌發酵的具體過程，以期為新型乳制品的研究與開發提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

保加利亞乳桿菌菌粉（Lactobacillus bulgaricus，簡稱LB）、嗜熱鏈球菌菌粉（Streptococcus thermophilus，簡稱ST）YOMIX-611 丹尼斯克公司；馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus） 北京三元食品股份有限公司實驗室保藏。

1.1.2試劑

全脂乳粉 新西蘭西部乳粉廠；乳糖、葡萄糖、半乳糖標準品、鄰硝基苯酚（o-nitrophenol，ONP）、鄰硝基苯β-D-半乳糖吡喃糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）、丙酮酸鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 美國Sigma公司；乳酸、丙酮酸標準品 阿拉丁（中國）試劑公司；AG501-X8（D）混合床樹脂美國Bio-Rad公司；溶菌酶（2 000 U/mg）、己糖激酶（hexokinase，HK）試劑盒、丙酮酸激酶（pyruvate，PK）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設備

XT-120A型分析天平 瑞士普利賽斯公司；Sigma 3K-15型高速冷凍離心機 德國Sigma公司；LC-10Avp型高效液相色譜 日本島津公司；Milli-Q Advantage A10型超純水儀 美國Millipore公司；KQ-500DE型醫用數控超聲器 昆山市超聲儀器有限公司；PB-10型標準型電化學pH計 德國賽多利斯集團；Cintra20型雙光束紫外-可見分光光度計 澳大利亞GBC公司；Polystat K6-1型循環式精密恒溫水浴鍋 德國Huber公司。

1.3方法

1.3.1樣品采集

準備兩份12 g/100 mL的全脂乳培養基，分別命名A、B。A培養基中按106CFU/mL接菌量接種活化好的乳酸菌（LB與ST活菌數比1∶1），按乳酸菌與酵母菌活菌數為30∶1的比例接種馬克斯克魯維酵母；B培養基按以上接種量只接入LB和ST。將接種好的兩份培養基于35 ℃條件下進行恒溫發酵，分別于發酵3、4、4.5、5、5.5、6 h取一次樣，6 h時約為凝乳終點。后將兩份培養基轉至4 ℃條件下進行貯藏，分別于第1、3、5、7、10、14、21天進行取樣。

將馬克斯克魯維酵母按上述接種比例單獨接入12 g/100 mL全脂乳培養基中，在28 ℃、180 r/min條件下進行培養，分別于6、24 h和48 h進行取樣，測定其β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶活力。

1.3.2pH值及總酸度的測定

pH值采用PB-10型酸度計進行測定。

總酸度測定：根據國家標準GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》［7］，用0.1 mol/L的NaOH溶液進行電位滴定法測定總酸度值。

1.3.3糖類代謝產物測定

1.3.3.1高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）條件

色譜柱：Aminex HPX-87C分離柱（300 mm× 7.8 mm，9 μm）；保護柱：Aminex hydrogen-form（30 mm×4.6 mm）；流動相：超純水；流速：0.3 mL/min；柱溫：75 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3.2標準曲線的繪制

配制5 組混標溶液，使乳糖質量濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL；葡萄糖質量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL；半乳糖質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL。配好后進行色譜測定，以峰面積（Y）對其質量濃度（X，mg/mL）繪制工作曲線，獲得回歸方程、相關系數、檢出限見表1。

表1　HPLC法檢測發酵乳中各種糖的回歸方程和相關系數及檢出限Table 1 Regression equations， correlation coefficients and limits of detection for lactose， glucose and galactose

1.3.3.3樣品前處理［8-9］

準確稱取3.000 g樣品，加入15 g雙蒸水溶解。加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1 mL。充分混勻，超聲20 min。在4 ℃條件下，10 000 r/min離心10 min。收集的上清液用1 mol/L NaOH調節pH值為6～7，并定容到25 mL。取出5 mL上清液，加入0.25 g的AG501-XB（D）樹脂，振蕩1 h。再用0.22 μm濾膜進行過濾。

1.3.4關鍵酶活力測定

1.3.4.1酶液提取

采用溶菌酶破壁法，參照Greenberg等［10］的方法，略作改動。準確稱取3.000 g樣品于50 mL離心管中，向其中加入1 g/100 mL的EDTA 100 μL，于4 ℃條件下，11 000 r/min離心10 min，保留沉淀；將沉淀用pH值為7.0的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液洗2 次，離心棄上清后將沉淀懸浮于10 mL磷酸鉀緩沖溶液中；向溶液中加入0.2 g/100 mL的溶菌酶2 mL，于37 ℃水浴1 h后加入4 mol/L NaCl溶液2 mL，充分混勻后得到粗酶液。

1.3.4.2β-半乳糖苷酶活力測定

參照郭清泉等［11］的方法，以ONPG為酶的底物，生成黃色產物ONP，通過比色法測定β-半乳糖苷酶活力。以吸光度（420 nm）作為縱坐標，ONP質量濃度作為橫坐繪制標準曲線，獲得回歸方程Y=0.006 5X－0.019，相關系數為0.997 9。一個酶活力單位（U）定義為在37 ℃條件下，每分鐘釋放1 μmol ONP所需的酶量［10］。

1.3.4.3乳酸脫氫酶活力測定

參考李琦等［12］的方法略作改動。將混合反應液即0.03 mol/L丙酮酸鈉0.1 mL、0.006 mol/L NADH 0.1 mL、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）2.7 mL在25 ℃條件下預熱5 min，于340 nm波長處測定初始吸光度，加入0.1 mL酶液啟動反應，立即計時，每間隔1 min測定一次吸光度，連續測定5 min。根據每分鐘吸光度降低值（ΔA340nm）可以計算出酶活力。空白樣為3 mL磷酸鉀緩沖溶液。一個酶活力單位（U）定義為在25 ℃條件下，每分鐘氧化1 μmol NADH所需酶量［13］。酶活力按下式計算。

式中：V總為反應體系總體積/mL；V樣為樣品體積/mL。

1.3.4.4糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑限速酶活力測定

己糖激酶和丙酮酸激酶活力測定方法遵照試劑盒說明書進行，實驗中每個樣品測定3 次，取平均值。蛋白質含量采用考馬斯亮藍法進行測定。

1.3.5丙酮酸含量的測定

1.3.5.1標準曲線繪制

采用2，4-二硝基苯肼比色法［14］對發酵乳中丙酮酸含量進行測定。以吸光度（520 nm）為縱坐標，丙酮酸質量濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，獲得回歸方程Y=0.022 3X－0.032 3，相關系數為0.998 6。

1.3.5.2樣品測定

準確稱取樣品3.000 g，加入10 g/100 mL三氯乙酸2 mL，超聲15 min，10 000 r/min離心10 min，獲得上清液定容到10 mL，從中取出1 mL按標準曲線測定方法操作，記錄吸光度，測定3 次取平均值，計算丙酮酸含量。1.3.6 乳酸含量的測定

1.3.6.1標準曲線繪制

采用對羥基聯苯比色法［15］對發酵乳中乳酸含量進行測定。以吸光度（565 nm）作為縱坐標，乳酸質量濃度（μg/mL）作為橫坐標，繪制標準曲線，獲得回歸方程為Y=0.011 5X+0.118 3，相關系數為0.998 3。

1.3.6.2樣品測定

準確稱取樣品1.000 g，用15 mL雙蒸水進行稀釋，再加入10 g/100 mL三氯乙酸2 mL，超聲15 min后10 000 r/min離心10 min，獲得上清液定容到100 mL，從中取出1 mL按標準曲線測定方法操作，記錄吸光度，測定3 次取平均值，計算乳酸含量。

1.4數據分析

運用SPSS 17.0軟件進行數據統計分析。數據之間的比較采用t檢驗，檢驗水平α=0.05，以P＜0.05為有統計學意義。

2　結果與分析

2.1pH值及總酸度測定結果

按規定的時間點進行取樣，分別測定添加酵母菌和不添加酵母菌兩種發酵乳的pH值和總酸度隨時間的變化。結果如圖1所示，兩種發酵乳pH值均呈下降趨勢，而滴定酸度呈上升趨勢，這符合發酵乳應有的特性。從圖中還能看出，含有酵母菌的發酵乳酸度較高（P＜0.05），存在兩種可能的原因，其一是酵母菌促進乳酸菌生長，加速了乳酸菌產酸［6］，其二是酵母菌本身發酵乳糖產酸、產CO2所致。

圖1　不同發酵時間發酵乳中酸度及pH值變化Fig.1 Changes in acidity and pH in fermented milk at different fermentation times

2.2糖類代謝產物測定結果

圖2　標準品（a）和樣品（b）糖類的HPLLCC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed sugar standards （a） and sugars in fermented milk （b）

按1.3.3節方法對糖類代謝產物進行檢測，獲得混合標準品和樣品HPLC圖見圖2。由圖2a可知，乳糖、葡萄糖、半乳糖的出峰時間分別為17.528、20.636、23.008 min。由圖2b可以看出樣品分離效果較好。

2.2.1發酵期間各糖含量變化

圖3　發酵期間乳糖（A）和半乳糖（B）含量變化Fig.3 Changes in lactose （A） and galactose （B） contents during fermentation

按樣品前處理方法對各采樣點采集的樣品進行處理，通過HPLC法對樣品中乳糖、葡萄糖、半乳糖含量進行測定，結果如圖3所示。如圖3A所示，接種后隨著發酵時間的延長乳糖含量呈不斷下降趨勢（P＜0.05），含有酵母菌的發酵乳中乳糖從42.081 mg/mL下降到28.549 mg/mL，下降了32.4%，而乳酸菌單獨發酵乳糖下降25.8%，說明含有酵母菌的發酵乳中乳糖代謝速率明顯快于乳酸菌單獨發酵（P＜0.05），這是由于酵母菌自身可以利用乳糖所致［16］。

由圖3B可知，半乳糖含量在發酵期間呈不斷上升趨勢（P＜0.05）。單獨乳酸菌發酵不會對半乳糖進行利用，因為在乳酸菌體內半乳糖激酶含量極低，不足以使半乳糖通過Leloir途徑發生代謝，半乳糖最終在乳糖透膜酶的作用下排放到胞外［17］。而混菌發酵中，雖然馬克斯克魯維酵母可以利用半乳糖，但其含量并沒有減少，可能是由于葡萄糖的生成量足以滿足酵母菌的生長，半乳糖沒有被利用或半乳糖的合成代謝大于分解代謝，這與Gonzalez-Andrada等［17］的研究相似。

發酵過程中葡萄糖未被檢出是由于葡萄糖在乳糖代謝產生時通過EMP途徑瞬間轉化而不會排放到胞外，因此含量極低未達到HPLC檢出限，這與Samona等［18］的研究結果相似。

2.2.2貯藏期間各糖含量變化

對貯藏期間各糖含量進行測定，結果如圖4所示，貯藏過程中乳糖的含量隨貯藏天數的增加仍在減少（P＜0.05），但趨 勢逐漸變緩，21 d內含有酵母菌和不含酵母菌的發酵乳中乳糖分別下降了36.8%和22.2%。如圖4B所示，兩種發酵乳中半乳糖含量變化趨勢有明顯不同，由于乳酸菌不能利用半乳糖，因此乳酸菌單獨發酵乳中半乳糖含量在逐漸升高；而混菌發酵中半乳糖的含量呈先上升后下降的趨勢，這是由于貯藏期間，各微生物對乳糖的代謝逐漸減慢，導致生成的葡萄糖不足以維持酵母菌的生存，因此酵母菌開始對之前積累的半乳糖進行利用。在貯藏過程中仍然未檢測出有葡萄糖的存在，Richmond等［19］研究表明發酵貯藏直到第50天才可檢測到葡萄糖且是痕量。

圖4　貯藏期間乳糖（A）和半乳糖（B）含量變化Fig.4 Changes in lactose （A） and galactose （B） contents during storage

2.3β-半乳糖苷酶活力測定結果

采用ONPG比色法測定乳糖酶活力。通過單獨測定馬克斯克魯維酵母發酵乳中酶活力可知：馬克斯克魯維酵母自身可以產生β-半乳糖苷酶，隨培養時間從6 h延長至48 h，β-半乳糖苷酶活力從0.249 U/mL上升到0.543 U/mL，說明其可以自身利用乳糖，進一步驗證了2.2.1節中的結論。由圖5可知，兩種發酵乳中β-半乳糖苷酶活力隨發酵時間延長均呈上升趨勢，凝乳時兩種發酵乳中酶活力分別達到0.966 U/mL和1.677 U/mL，這是由于微生物不斷生長繁殖，活菌數的增多導致其產酶量的增加，而酵母菌參與的發酵乳從發酵4 h開始，其β-半乳糖苷酶酶活力高于乳酸菌單獨發酵（P＜0.05），分析可能原因有兩方面：一是酵母菌本身可以產生β-半乳糖苷酶；二是酵母菌促進乳酸菌生長代謝產酶［6］。

圖5　不同發酵時間發酵乳中β-半乳糖苷酶酶活力的變化Fig.5 Change in β-galactosidase activity in fermented milk at different fermentation times

2.4EMP途徑限速酶活力測定結果

2.4.1HK活力測定結果

HK在糖代謝途徑中，起著十分重要的作用，是糖代謝開始的啟動因子，它催化葡萄糖磷酸化成為6-磷酸葡萄糖，它是整個糖代謝的限速酶，因此分析了酵母菌的加入對HK的影響，結果如圖6所示。隨發酵時間延長，兩種發酵乳中HK活力都隨之升高（P＜0.05），是微生物不斷生長產酶所致。當發酵4 h后，含有酵母菌的發酵乳中HK活力顯著高于單獨乳酸菌發酵（P＜0.05），由于HK是EMP途徑限速酶，因此說明酵母菌的加入對糖酵解進程有一定的促進作用。

圖6　發酵期間己糖激酶活力變化Fig.6 Change in hexokinase activity in fermented milk at different fermentation times

2.4.2PK活力測定結果

PK是糖酵解途徑中第三個限速酶，它的作用是催化磷酸烯醇式丙酮酸轉化成丙酮酸，同時生成一個ATP。PK活性的提高有利于糖酵解途徑的順利進行。它在細胞內含量的多少直接反映了細胞內流經糖酵解過程的通量的大小。因此分析酵母菌加入對PK活力的影響，結果如圖7所示。隨著發酵時間的延長，兩種發酵乳中PK活力大體呈上升趨勢，發酵4.5 h后含有酵母菌的發酵乳中PK活力明顯高于乳酸菌單獨發酵（P＜0.05），說明酵母菌的加入對PK活性有一定促進作用，也側面反映了馬克思克魯維酵母可以加快EMP進程。

圖7　發酵期間丙酮酸激酶活力變化Fig.7 Change in pyruvate kinase activity in fermented milk at different fermentation times

2.5丙酮酸含量的變化

對丙酮酸含量變化進行測定，對比兩種發酵乳中丙酮酸含量，結果如圖8所示，隨著發酵的進行，兩種發酵乳中丙酮酸含量均呈現先增加后降低的趨勢，可能是因為發酵前5.5 h丙酮酸的合成代謝大于其分解代謝，之后由于快接近發酵終點，較多的丙酮酸轉變成乳酸，導致其含量降低。含有酵母菌的發酵乳其丙酮酸含量較高（P＞0.05），可能是由于含有酵母菌的發酵乳中PK活力較高或酵母菌自身可以通過EMP途徑產生丙酮酸，導致較多的丙酮酸生成。

圖8　發酵期間丙酮酸含量變化Fig.8 Change in pyruvic acid content during fermentation

2.6乳酸脫氫酶活力測定結果

乳酸脫氫酶可以在無氧條件下催化丙酮酸生成乳酸，因此研究酵母菌對乳酸脫氫酶活力的影響有助于進一步分析其對乳酸生成的作用。結果如圖9所示，由于乳酸菌的不斷生長繁殖，導致兩種發酵乳中乳酸脫氫酶活力均隨發酵的進行而增加（P＜0.05），凝乳時兩種發酵乳中乳酸脫氫酶活力分別達到1.031 U/mL和0.707 U/mL；含有酵母菌的發酵乳中乳酸脫氫酶活力高于單獨乳酸菌發酵，從4.5 h后差異具有顯著性（P＜0.05），由于馬克斯克魯維酵母自身無法產生乳酸脫氫酶或酶的生成量沒有達到方法檢出限，因此產生這種現象的原因可能有兩點：一是酵母菌可以促進乳酸菌生長，加速乳酸菌產酶；二是果糖-1，6-二磷酸為別構激活劑，可大幅度提高乳酸脫氫酶活力，酵母菌的加入可以促進EMP途徑的進行，導致其中果糖-1，6-二磷酸產物的增多，進而提高乳酸脫氫酶活力［20］。

圖9　發酵期間乳酸脫氫酶活力變化Fig.9 Change in lactate dehydrogenase activity in fermented milk at different fermentation times

2.7乳酸含量測定結果

乳酸作為乳糖發酵終產物不僅可以改善酸乳風味，還決定了乳品保藏過程中后酸化的程度，對發酵乳中乳酸含量的測定可以有利的監控乳品質量，因此對樣品中乳酸含量進行測定，結果如圖10所示，含有酵母菌的發酵乳中乳酸含量從1.16 mg/mL上升到6.48 mg/mL，乳酸菌單菌發酵乳中乳酸則從1.17 mg/mL上升到5.76 mg/mL，兩種發酵乳中乳酸含量均隨發酵的進行而增加；從發酵3 h開始，含有酵母菌的發酵乳中乳酸含量顯著高于乳酸菌單獨發酵（P＜0.05），這對之前兩組發酵乳pH值測定具有差異性進行了說明，產生這種現象的原因可能是：含有酵母菌的發酵乳中乳酸脫氫酶活力較高，導致產生了較多的乳酸。

圖10　發酵期間乳酸含量變化Fig.10 Change in lactate content during fermentation

3　結 論

發酵乳中的糖代謝主要是指微生物代謝乳糖生成乳酸的過程。在乳糖作為唯一碳源的12 g/100 mL全脂乳培養基中，乳糖首先被β-半乳糖苷酶分解為葡萄糖和半乳糖；葡萄糖直接進入EMP途徑生成丙酮酸，EMP途徑的關鍵限速酶有己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激等；由于乳酸菌體內沒有足夠的半乳糖激酶，使得半乳糖不能被利用，但馬克斯克魯維酵母可以彌補這一不足，將半乳糖進行轉化，以6-磷酸葡萄糖的形式進入EMP途徑，生成丙酮酸；生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下最終生成乳酸，完成發酵。

本實驗確定了馬克斯克魯維酵母加入后，整個微生物代謝糖過程中關鍵代謝產物及酶活力變化規律。1）糖類代謝產物變化規律：發酵期間，酵母菌的加入促進乳糖的分解代謝（P＜0.05），由于葡萄糖進入EMP途徑被快速轉化，因此未檢測出其含量，而兩種發酵乳中半乳糖均處于積累狀態。貯藏期間，兩種發酵乳中乳糖降解緩慢，生成的葡萄糖量不足以維持微生物生長，因此酵母菌開始利用積累的半乳糖。2）關鍵酶活性變化規律：含有馬克斯克魯維酵母的發酵乳中β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸激酶活性均增強（P＜0.05），導致乳糖利用率增加，糖酵解進程加快，發酵乳產酸較多。3）有機酸類代謝產物變化規律：馬克斯克魯維酵母的加入可使發酵乳中乳酸含量升高（P＜0.05），提前達到凝乳點，縮短工業生產時間。而丙酮酸含量的增加，說明馬克斯克魯維酵母增加糖耗量可能還有其他途徑。綜上所述，馬克斯克魯維酵母的加入對發酵乳中乳糖代謝起到促進作用。對于酵母菌促進糖代謝的機理還需要更深入的研究，隨著各種研究方法的相互借鑒和新的研究手段的出現，有望在不遠的將來能更加明確酵母參與糖代謝的整個機理。

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Effect of Kluyveromyces marxianus on Lactose Metabolism in Traditional Fermented Milk

FAN Wei1，2， ZHANG Dongdong2， ZHANG Yu1， JIANG Tiemin2， CHEN Lijun1，2，*
（1. School of Food Science and Technology， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China；2. Beijing Dairy Engineering Technology Research Center， Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd.， Beijing 100076， China）

In order to ascertain the effect of co-fermentation with Kluyveromyces marxianus on the biosynthesis pathway of lactic acid by anaerobic metabolism of lactose， the contents of main lactose metabolites in fermented milks with lactic acid bacteria alone and in combination with Kluyveromyces marxianus were analyzed and compared by HPLC， accompanied by comparative measurement of related key enzymes activities. The results showed that lactose was degraded at a markedly accelerated rate during co-fermentation with Kluyveromyces marxianus and lactic acid bacteria （P ＜ 0.05）. Kluyveromyces marxianus could utilize the produced galactose during subsequent storage. Moreover， the presence of the yeast resulted in significantly enhanced activities of β-galactosidase， lactate dehydrogenase， pyruvate kinase and hexokinase during the fermentation process （P ＜ 0.05）. As a result， hexokinase and pyruvate kinase， the key rate-limiting enzymes in the Embden-Meyerhof-Parnas （EMP） pathway， were significantly activated （P ＜ 0.05）. pH declined faster （P ＜ 0.05） during co-fermentation with Kluyveromyces marxianus than fermentation with single starter culture， which was associated with significantly enhanced production of lactic acid （P ＜ 0.05）. However， no significant difference in pyruvic acid content was found between the two fermented milks （P ＞ 0.05）. This study reveals that Kluyveromyces marxianus plays an important role in promoting lactose glycolysis.

lactose metabolism； Kluyveromyces marxianus； fermented milk； enzymatic activity； metabolites

TS252.1

A

1002-6630（2015）15-0128-07

10.7506/spkx1002-6630-201515024

2014-09-24

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B04）；2012年度國家星火計劃項目（2012GA600001）

范維（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：fw837093515@163.com

陳歷俊（1967—），男，高級工程師，博士，研究方向為乳品加工。E-mail：chlj@263.net