草蓯蓉提取物對HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用

尹學哲，王玉嬌，尹基峰，金梅花，金 明，全吉淑，*

（1.延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002）

草蓯蓉提取物對HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用

尹學哲1，王玉嬌2，尹基峰1，金梅花2，金 明2，全吉淑2，*

（1.延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002）

目的：研究草蓯蓉乙醇提取物（Boschniakia rossica ethanol extract，BREE）對H2O2誘導的HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用。方法：用H2O2誘導HepG2細胞氧化應激損傷，采用噻唑藍（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）比色法檢測BREE對HepG2細胞氧化損傷的保護作用；比色法測定培養液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的釋放率，以及細胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）及丙二醛（malondialdelyde，MDA）水平；蛋白印跡法測定細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）總蛋白及其磷酸化形式的表達水平以及核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的核內轉移。結果：BREE單獨處理時，在所測質量濃度范圍內對HepG2細胞增殖無顯著影響。與模型組相比，BREE能顯著提高氧化損傷細胞的存活率；降低氧化損傷細胞培養液中LDH、ALT和AST的釋放；降低細胞MDA水平，增高細胞SOD活性和GSH含量。氧化損傷發生的不同時期，ERK、JNK、p38 MAPK和NF-κB蛋白均有激活，而BREE在氧化損傷發生1 h時減少ERK激活和NF-κB核轉移，氧化損傷發生12 h時減少JNK蛋白激活。結論：BREE對H2O2所致HepG2細胞氧化應激損傷具有保護作用，此作用可能與其抑制ERK、JNK的活化和NF-κB的核內轉移有關。

草蓯蓉；H2O2；氧化損傷；HepG2細胞

細胞內氧化與抗氧化之間的平衡對細胞生存至關重要，氧化應激水平的提高能夠損傷細胞甚至導致細胞死亡［1］。因此，自由基與多種疾病的關系已越來越引起人們的重視，自由基生物醫學的發展使得探尋高效低毒的天然抗氧化劑成為生物化學和醫藥學科領域的研究熱點［2］。草蓯蓉（Boschniakia rossica Fedtsch. et Flerov）又名不老草，為列當科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，是國家二類保護植物。草蓯蓉性味甘、酸、濕，全草入藥。具有補腎壯陽、滋補強身、潤腸止血、延年益壽的功效；用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、膀胱炎、功能性子宮出血、腎炎以及腎臟和膀胱出血等疾病［3］。研究發現，草蓯蓉具有抗脂質過氧化、增強免疫、抗炎及抗腫瘤等作用［3-5］，這與草蓯蓉醛、草蓯蓉酸、草蓯蓉堿、草蓯蓉內酯、草蓯蓉納拉苷和多糖等多種活性成分有關［3-6］。本實驗利用H2O2誘導人HepG2細胞氧化應激損傷模型，檢測草蓯蓉提取物（Boschniakia rossica ethanol extract，BREE）對HepG2細胞的保護作用，以期為草蓯蓉的開發利用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

草蓯蓉采自吉林省長白山，經延邊大學藥學院劉勇鎮教授鑒定為草蓯蓉（Boschniakia rossica Fedtsch. et Flerov）。

人肝癌細胞HepG2 南京凱基生物有限公司；DMEM培養基、小牛血清 美國Gibco公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；小鼠細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）多克隆抗體、兔p-ERK多克隆抗體、兔c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）多克隆抗體、兔p-JNK多克隆抗體、兔p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）多克隆抗體、兔p-p38 MAPK多克隆抗體、兔核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）多克隆抗體 美國Abcam公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）及蛋白質試劑盒 南京建成科技有限公司。

3-30K型離心機 美國Sigma公司；D 1320型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀北京六一儀器廠；Trans-Blot轉印槽 美國Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀 美國UVP公司；RT-2100型酶標儀深圳雷杜公司；S22PC型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2方法

草蓯蓉用90%乙醇提取后，依次經等體積石油醚、氯仿、乙酰乙酯和正丁醇萃取，減壓蒸餾即得BREE，得率約為13%［5］。主要成分有草蓯蓉多糖（質量分數13%）、草蓯蓉環烯醚萜（質量分數47%）和草蓯蓉苯丙烯醇苷（質量分數32%）。

1.2.2細胞培養［7］

HepG2細胞用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下靜置培養，細胞鋪滿瓶底80%以上，取對數生長期增殖活躍的細胞進行分組。

1.2.3MTT法檢測BREE對HepG2細胞增殖的影響［8］

取對數生長期的HepG2細胞以5×104個/mL的細胞濃度接種于96 孔培養板中，每孔加入100 μL。24 h后，加入BREE溶液100 μL，使其終質量濃度分別為400、200、100、50、25、12.5 mg/L。繼續培養24 h。吸凈培養液，加入5 g/L MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，再加入200 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。振蕩10 min使甲臜結晶充分溶解后，在570 nm波長處檢測光密度（OD）值。實驗重復3 次。另設空白孔，排除藥物干擾。

1.2.4MTT法檢測BREE對氧化損傷HepG2細胞存活率的影響

取對數生長期的HepG2細胞接種于96 孔細胞培養板中，24 h后用于實驗。實驗分為5 組：對照組、模型組及BREE高、中、低劑量組（質量濃度分別為50、25、12.5 mg/L）。對照組換入正常培養液；模型組加入H2O2使其濃度為300 μmol/L；給藥組中加入BREE使其質量濃度達到相應值，2 h后再加入300 μmol/L H2O2建立細胞氧化損傷模型。損傷12 h后，每孔加入5 g/L MTT，4 h后終止培養，吸凈培養液，再加200 μL DMSO，振蕩10 min后，在570 nm波長處檢測OD值，重復3 次。另設空白孔（只加BREE）以排除藥物干擾。

1.2.5氧化損傷細胞培養液中LDH、ALT、AST的釋放［9］

頂層設計，統籌謀劃，必須準確領會其內容要點。水利改革發展頂層設計，明確了以建立防洪抗旱減災體系、水資源合理配置和高效利用體系、水資源保護和河湖健康保障體系、有利于水利科學發展的制度體系等四大體系為目標，以水利規劃、法律法規、政策措施為支撐的總體框架。這個框架科學確定水利改革發展系統的長遠目標、建設任務、投資規模，有計劃、有步驟、分階段、分層次推進，讓水利改革發展這張宏偉藍圖付諸實踐時更加科學、規范，更具有可操作性。

對數生長期的HepG2細胞按以上方法分組，用H2O2損傷細胞1、4、12 h。收集上清液，按試劑盒說明書步驟測定上清液中LDH、ALT、AST活性。

1.2.6氧化損傷細胞內SOD、GSH、MDA水平以及ERK、JNK、p38 MAPK和NF-κB蛋白活化的測定

細胞處理在6 孔板內進行，用H2O2損傷細胞1、4、12 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集1×107個細胞用冷磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）清洗，破碎細胞，離心取上清液，按試劑盒說明書步驟測定細胞內SOD、GSH、MDA水平［9］。提取蛋白質，上10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）后轉膜，再用二抗體偶聯物進行免疫檢測，發光底物顯跡法顯跡，于UVP凝膠成像分析儀中采集圖像并進行分析［10-11］。

1.3統計學處理

2　結果與分析

2.1BREE對HepG2細胞增殖的影響

圖1　BREE對HepG2細胞增殖的影響Fig.1 Effect of BREE on the proliferation of HepG2 cells

MTT實驗是檢測活細胞數量的常用方法。由圖1可知，HepG2細胞在不同質量濃度BREE作用下，細胞增殖稍有變化。質量濃度高時，BREE具有一定的細胞毒作用，但質量濃度在12.5～50 mg/L范圍時，其細胞活力與對照組（BREE質量濃度為0 mg/L）相比沒有顯著性差異。說明質量濃度小于50 mg/L時，BREE對HepG2細胞增殖沒有影響，不顯示細胞毒作用。

2.2BREE對氧化損傷HepG2細胞存活率的影響

圖2　BREE對氧化損傷HepG2細胞存活率的影響Fig.2 Effect of BREE on cell viability of HepG2 with H2O2-induced damage

H2O2能夠促進自由基的生成，引發生物膜的脂質過氧化反應，從而導致細胞的損傷、壞死和凋亡。如圖2所示，與對照組比較，模型組的細胞存活率明顯降低（P＜0.05），經不同劑量BREE保護后細胞存活率由54%分別增加到71%、77%和81%（P＜0.05）。

2.3BREE對氧化損傷HepG2細胞ALT、AST、LDH釋放的影響

圖3　BREE對氧化損傷HepG2細胞ALT（a）、AST（b）、LDH（cc）釋放的影響Fig.3 Effect of BREE on hepatic ALT （a）， AST （b） and LDH （c） release in HepG2 cells with H2O2-induced oxidative damage

細胞在氧化損傷過程中會將細胞內的ALT、AST、LDH等胞內酶釋放到培養基中，所以培養上清中ALT、AST、LDH活性大小可反映細胞的死亡或損傷程度。對照組、模型組和給藥組培養液中ALT、AST、LDH活性檢測結果如圖3所示。對照組培養液中ALT、AST、LDH活性較低，而模型組培養液ALT、AST、LDH活性與對照組比較顯著升高（P＜0.05）；BREE組培養液ALT、AST、LDH活性與模型組比較降低（P＜0.05），表明BREE可有效降低H2O2對HepG2細胞造成的氧化應激損傷。

2.4BREE對氧化損傷HepG2細胞中SOD、GSH、MDA水平的影響

圖4　BREE對氧化損傷HepG2細胞SOD（a）、GSH（b）、MDA（cc）水平的影響Fig.4 Effect of BREE on SOD （a）， GSH （b） and MDA （c） in HepG2 cells with H2O2-induced oxidative damage

為對抗氧化應激引起的各種損傷，有氧生物在進化過程中發展了多種抗氧化防御機制，包括各種抗氧化酶，如SOD等，可與GSH等內源性抗氧化劑一起能有效清除體內脂質過氧化物，使機體免受自由基的損害［12］。而MDA是細胞膜脂質過氧化反應的終產物，細胞中MDA含量多少可反映細胞脂質過氧化損傷程度［2，13］。如圖4所示，與對照組比較，模型組細胞MDA水平均顯著升高（P＜0.05），GSH水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組中的MDA水平均明顯降低（P＜0.05），給藥組中的GSH水平均明顯升高（P＜0.05）。氧化損傷4、12 h時，模型組中的SOD活性與對照組比較顯著降低（P＜0.05）；給藥組中的SOD活性與模型組比較顯著升高（P＜0.05）。但氧化損傷時間只為1 h時，模型組SOD水平略有升高趨勢，這可能與細胞氧化損傷初期時氧化應激增高引起的SOD活力的代償性升高相關。

2.5BREE對氧化損傷HepG2細胞中MAPK和NF-κB蛋白激活的影響

圖5　BREE對氧化損傷HepG2細胞中MAPK和NNFF--κB蛋白激活的影響Fig.5 Effect of BREE on the activation of MAPK and NF-κB in HepG2 cells with H2O2-induced oxidative damage

如圖5所示，氧化損傷1 h時，與對照組比較，模型組中的ERK蛋白活化水平增高（P＜0.05）；與模型組比較，50 mg/L BREE組ERK蛋白活化水平降低（P＜0.05）。氧化損傷12 h時，與對照組比較，模型組中的JNK和p38 MAPK蛋白活化水平增高（P＜0.05）；而50 mg/L BREE降低JNK活化水平（P＜0.05），但不改變p38 MAPK蛋白活化水平。氧化損傷時，與對照組比較，模型組肝細胞核中NF-κB蛋白水平均增高（P＜0.05）；氧化損傷1 h和4 h時，50 mg/L BREE組肝細胞核中NF-κB蛋白水平降低（P＜0.05），而氧化損傷至12 h時，50 mg/L BREE組肝細胞核中NF-κB蛋白水平升高（P＜0.05）。

3　討 論

H2O2誘導的肝細胞氧化損傷，氧化應激是其重要損傷機制。細胞受到損傷后，細胞內生成大量活性自由基，引發細胞膜上脂質過氧化反應，生成終產物MDA；受損的細胞膜通透性增強，胞內酶（ALT、AST、LDH等）大量外釋；脂質過氧化生成的自由基又與氧接觸，進而引起一系列的自由基鏈反應。為平衡氧化還原狀態，大量損耗了細胞內源性抗氧化劑（如GSH等），最終導致細胞死亡［13-15］。因此，當肝細胞受到H2O2損傷時，細胞活力（存活率）、轉氨酶和LDH釋放率、MDA生成量、GSH含量、SOD活性變化顯著。本研究結果表明，草蓯蓉提取物能顯著提高損傷肝細胞活力；降低損傷細胞培養液中LDH、ALT和AST的釋放；降低損傷細胞中MDA水平，增高細胞中SOD活性和GSH含量。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要有ERK、JNK及p38 MAPK激酶途徑［16］。人們普遍認為，ERK為“細胞生存”通路，而JNK和p38 MAPK則為“細胞死亡（壞死和凋亡）”通路［17-18］。胞外刺激，如激素、細胞因子等都能引起肝細胞MAPK通路的激活，并磷酸化其下游的相關蛋白，從而完成細胞對胞外刺激的反應與反饋調節［19］。而JNK和p38 MAPK通路選擇性地對環境中各種理化及炎性因子所致的應激起反應。JNK信號通路是由多條調控細胞增殖和誘導細胞凋亡的途徑構成的一個復雜網絡，存在協同和拮抗的現象［20-21］。p38 MAPK信號通路目前關注最多的是調控炎癥反應，調節NF-κB的活化表達，在炎癥性疾病中起著關鍵作用［22］。NF-κB信號轉導通路則是炎癥反應中被激活最頻繁的通路之一，調控大部分炎癥因子的生成及釋放［23-25］。本實驗結果表明，氧化損傷發生時，ERK、JNK、p38 MAPK和NF-κB蛋白均有不同程度的激活，而BREE在損傷發生的不同時期減少ERK、JNK的激活和NF-κB的核轉移。此結果與以往報道類似［10-11，26］。但文獻報道JNK和p38 MAPK激活也是H2O2刺激后發生的細胞內早期事件之一［10-11］，其中H2O2誘導的HEK293T細胞中p38 MAPK磷酸化表現為雙階段反應，15 min達到高峰并持續120 min左右［10］。由此可見，MAPK激活在不同細胞氧化應激反應中表現不盡相同。此外，李國平等［27］報道，氧化應激作用于HepG2細胞后12 h開始發生細胞凋亡。本研究在氧化損傷12 h時觀察到BREE降低JNK磷酸化同時增高NF-κB p65的核轉移，這可能與其抗細胞凋亡作用有關。研究表明，NF-κB從胞質轉移到胞核，然后在細胞凋亡抑制蛋白、Bcl-2家族、TRAF1、TRAF-2、c-FLIP等作用下發揮抗細胞凋亡作用［26］。發生氧化應激損傷時NF-κB和JNK之間的關聯、以及細胞凋亡之間的關系需進一步研究。

綜上所述，草蓯蓉提取物對H2O2誘導細胞氧化損傷具有保護作用，此作用可能與其抑制ERK、JNK的活化和NF-κB的核內轉移有關。

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Protective Effect of Boschniakia rossica Extract on Oxidative Damage in HepG2 Cells

YIN Xuezhe1， WANG Yujiao2， YIN Jifeng1， JIN Meihua2， JIN Ming2， QUAN Jishu2，*
（1. Yanbian University Hospital， Yanji 133000， China； 2. Medical College， Yanbian University， Yanji 133002， China）

Objective： The protective role of ethanol extract of Boschniakia rossica （BREE） against cellular oxidative injury induced by hydrogen peroxide （H2O2） in HepG2 cell line was investigated. Methods： MTT assay was used to e valuate the cell proliferation of HepG2 cells. The activities of lactate dehydrogenase （LDH）， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， malondialdelyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD） and reduced glutathione （GSH） were measured by the spectrophotometric method. The total protein expression and the phospharylation of extracellular signalregulated kinase （ERK）， c-Jun N-terminal kinase （JNK）， p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK）， and nuclear translocation of nuclear factor-κB （NF-κB） were determined by the Western blotting method. Results： BREE had no toxic effect on cultured HepG2 cells at the tested concen trations. In HepG2 cells with H2O2-induced oxidative damage， BREE increased cell viability， reduce LDH， ALT and AST leakage， inhibited MDA formation， and increased SOD and GSH levels. At the different stages of oxidative damage， ERK， JNK， p38 MAPK and NF-κB proteins were activated； however， the administration of BREE suppressed the ERK activation and NF-κB nuclear translocation at 1 h， and JNK activation at 12 h. Conclusion： BREE can function as an antioxidant to prevent cellular injury induced by H2O2in cultured HepG2 cells， maybe via the suppression of ERK and JNK activation and NF-κB nuclear translocation.

Boschniakia rossica； hydrogen peroxide （H2O2）； oxidative damage； HepG2 cell

S565.1；Q593.1

A

1002-6630（2015）15-0173-06

10.7506/spkx1002-6630-201515032

2014-09-30

國家自然科學基金地區科學基金項目（81160539）

尹學哲（1962—），男，教授，博士，研究方向為中藥藥理學。E-mail：yinxz@ybu.edu.cn

全吉淑（1968—），女，教授，博士，研究方向為中藥藥理學。E-mail：quanjs@ybu.edu.cn