有機溶劑輔助封閉式電噴霧離子源的設計及其在痕量蛋白質組樣品分析中的應用

朱旭東等

摘 要 將康達效應應用于電噴霧離子源，設計了氣氛可調康達效應電噴霧離子源（Coanda effect electrospray ionization source， CEESI）。考察了不同飽和蒸氣壓、不同極性的有機溶劑對標準肽段在質譜上信號響應的影響。結果表明，輔助氣中添加乙醇后，標準肽段質譜信號提高約1000倍，而且對于1 ng BSA酶解產物，蛋白序列覆蓋率提高約10%。在最佳條件下，采用nano-HPLC-CEESI-LTQ XL MS系統，實現了6， 10， 20和50 ng HeLa細胞全提蛋白質酶解產物的定性分析，與常用的開放式nano-ESI相比，肽段和蛋白質的可鑒定數目分別提高20%～360%和20%～200%。本研究表明，采用CEESI源有利于痕量蛋白質組樣品的高靈敏度分析。

關鍵詞 康達效應； 電噴霧離子源； 蛋白質組； 痕量分析

1 引 言

高效液相色譜-電噴霧離子化質譜（HPLC-ESI MS）技術已被廣泛應用于蛋白質組樣品分析[1，2]。由于蛋白質組樣品具有組成復雜、蛋白含量動態范圍寬、物理化學性質各異等特點，因此對分析方法的靈敏度提出了越來越高的要求。提高ESI過程的離子化效率、降低離子間相互抑制作用已成為一種有效途徑[3]。眾所周知，當HPLC的流速降低至納升級時，電噴霧可產生更小的霧滴，離子化效率得到明顯改善[4]，同時離子抑制和基質效應也會被顯著抑制[5，6]。因此，納噴離子源已被廣泛應用于蛋白質組學樣品分析[1，2]。

在改善檢測靈敏度的前提下，提高ESI源的噴霧穩定性也至關重要。目前，最常用的開放式納噴離子源容易受到外界環境的影響，會出現噴霧不穩定的情況[7]。然而，封閉式電噴霧離子源[8]在噴針和質譜采樣錐之間的空腔形成低壓，可獲得穩定噴霧； 同時通過增加輔助氣，如空氣或氮氣，可改善離子傳輸效率。根據文獻報道[9～12]，輔助氣中添加氣化的有機溶劑可以顯著改變肽段電荷分布，并提高肽段離子化效率。Li等[9]在輔助氣中添加醇類或羧酸類蒸汽，可將肽段的MS信號增強3～4倍，鑒定的大腸桿菌蛋白質數目增加14%。Asperger等[12]發現，輔助氣中添加乙腈可提高糖肽電荷數，使其在電子轉移解離（Electrontransfer dissociation，ETD）中獲得更高的碎裂效率。此外，有機溶劑添加的輔助氣還可以降低基質干擾。de Muth等[13]發現，有機溶劑添加的輔助氣，尤其是乙腈，可以有效降低金屬離子干擾。上述研究表明，氣氛輔助封閉式納噴離子源在獲得穩定噴霧、高效離子化的同時，還可以提高質譜響應，因此有望用于痕量蛋白質組樣品的高靈敏度分析。

康達效應亦稱附壁作用，即流體（水流或氣流）有離開本來的流動方向，改為隨著凸出物體流動的傾向。結合康達效應，本研究設計了新型CEESI源，評價了不同輔助氣氣氛對標準肽段的質譜信號強度的影響； 在最佳輔助氣類型和分壓條件下，實現了痕量HeLa細胞蛋白質組的定性分析。同時與開放式nano-ESI源進行了比較，結果表明，采用新型CEESI可將肽段和蛋白質鑒定數目分別提高20%～360%和20%～200%。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

毛細管高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱質譜儀（美國Thermo Fisher公司）； 康達效應電噴霧離子源（浙江好創生物技術有限公司）； Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）。

磷酸化標準肽段（序列：STSSDQPSpYSLE，上海強耀生物科技有限公司）； 甲酸（FA）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）、碘代乙酰胺（Iodoacetamide，IAA）、牛血清白蛋白（BSA）、尿素、NH4HCO3（美國Sigma公司）； 乙腈（ACN，德國Merck公司）； 乙醇、甲醇、乙酸、二甲基亞砜（DMSO）、異丙醇、丙酮、乙二醇、乙二胺、乙酸乙酯和環己烷等（天津科密歐公司）； 蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司）； C18反相填料（10 孔徑，5 μm粒徑， 天津博納艾杰爾科技有限公司）； 石英毛細管（美國Polymicro Technologies公司）。實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm）

2.2 樣品制備

2.2.1 HeLa細胞培養及蛋白質提取 在37℃、5% CO2條件下，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養HeLa細胞。當細胞的融合度達到90%時，收集并用冷的PBS洗滌3次。將HeLa細胞沉淀分散于裂解液（1%蛋白酶抑制劑的8 mol/L尿素溶液），在冰浴中超聲破碎240 s（超聲10 s，間歇10 s），在4℃， 20000 r/min高速離心10 min， 去除細胞碎片，收集上清液。最后用基于BCA法的試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）測定蛋白質濃度。

2.2.2 BSA及HeLa蛋白質樣品處理 蛋白質酶解：取1 mg蛋白質（HeLa細胞提取蛋白或BSA）溶于100 μL 8 mol/L尿素中，加入8 μL 100 mmol/L DTT，56℃反應2 h； 冷卻至室溫，加入8 μL 200 mmol/L IAA，避光反應40 min； 用50 mmol/L NH4HCO3將溶液稀釋10倍后，加入胰蛋白酶（酶與底物的質量比為1∶25）； 37℃酶解24 h，加入甲酸終止反應。

除鹽：使用HPLC的流動相A（98% H2O + 2% ACN + 0.1% FA）將酶解液上樣至C18反相色譜柱（10 mm×4.6 mm），沖洗5 min后，用80% 的流動相B（98% ACN+2% H2O + 0.1% FA）進行洗脫。收集洗脫液，冷凍干燥后，保存于-80℃待用。

2.3 質譜及電噴霧離子源分析條件

2.3.1 考察不同溶劑、輔助氣對標準肽段質譜響應信號的影響 負離子模式下，使用進樣針直接進樣（1 μg/mL）。改變標準肽段溶劑、輔助氣中有機添加劑的種類及比例，每種條件均直接采集1 min，對比不同條件下標準肽段離子峰強度。

2.3.2 BSA及HeLa蛋白酶解產物的分離和鑒定 采用nano-HPLC-ESI-MS/MS分離分析酶解產物，色譜柱： C18反相色譜柱（50 μm×15 cm），末端為拉制噴針，可直接插入封閉式電噴霧離子源，如圖1所示。液相色譜分離采用梯度洗脫方式，BSA酶解產物：0～5 min，2%～6% B； 5～35 min，6%～35% B； HeLa細胞蛋白質酶解產物：0～75 min，5%～25% B； 75～90 min，25%～80% B。流速均為120 nL/min。

分別考察空氣和乙醇兩種氣氛下的質譜鑒定信號。質譜掃描范圍為m/z 300～1800，正離子模式采集，歸一化碰撞能量為35%。質譜采集產生的原始文件通過pXtract[14]轉換為.mgf文件后，使用Mascot（2.4.0版本，英國MatrixScience）搜索引擎對Swiss-Prot數據庫中序列進行檢索。參數設置為：母離子質量容差2 Da； 碎片離子質量容差1 Da； 蛋白水解酶：Trypsin； 最多允許2個漏切位點； 固定修飾： carbamidomethyl （C）； 可變修飾：oxidation （M）和acetyl （protein N-term）。

3 結果與討論

3.1 離子源設計

結合康達效應，設計了CEESI源（圖1）。特殊設計的離子傳輸管的內表面具有康達效應功能，氣流會沿著管壁旋轉向質譜方向流動，旋轉的氣流將帶電液滴在離子傳輸管的中心流向質譜儀，降低了液滴與管壁的碰撞幾率，從而提高離子傳輸效率。

輔助氣流進入低壓空腔后，繞軸線旋轉，形成以發射針為軸的三維軸對稱回轉體。此結構可以簡化為二維流動進行模擬（圖2）。在回轉體內可形成氣流穩定均勻的區域，即流場駐點。

將色譜柱末端的噴針直接插入電噴霧離子源內的駐點位置，在電場驅動下，即可形成特別穩定泰勒錐，進而獲得穩定噴霧。此外，由于質譜內的高真空，噴針與質譜采樣錐之間的空腔處于低壓，流動的輔助氣可帶走泰勒錐形成的霧滴，清潔噴針表面，有效防止結碳，有助于延長噴針使用壽命。霧滴在密閉腔內不斷蒸發，當達到瑞利極限時，即發生庫侖爆炸。分析物基于荷電殘余模型、離子蒸發模型及鏈彈射模型等機理[15]實現離子化。進入腔體的輔助氣，即被有機溶劑飽和的空氣，可有效避免空氣中污染物的進入，降低干擾離子的信號。在輔助氣和霧滴的作用下，分析物離子化效率顯著提高，有助于實現肽段的高靈敏度檢測。

3.2 輔助氣氣氛對標準肽段質譜檢測信號的影響

輔助氣作為CEESI源的重要組成部分，可以促進噴霧穩定性、改善離子傳輸效率，而且輔助氣中添加氣化的有機溶劑可以顯著改變肽段電荷分布，提高肽段離子化效率[9，10]。因而首先考察了不同輔助氣對肽段的質譜信號強度及電荷分布的影響（圖3）。

在負離子模式下，酸可明顯抑制負離子生成。蒸氣壓較低的有機試劑（如DMSO、乙二醇）由于進入離子化室較少，對信號強度基本無影響。而飽和蒸氣壓較大的乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等極性分子可明顯提高多肽離子化效率。此結果與冷卻焓理論一致[16，17]，即高濃度的極性分子冷凝在霧滴表面的同時，釋放一定的能量； 此能量被霧滴表面的分析物分子吸收，最終激發分析物離子化[15]。但在研究的輔助氣氣氛中，乙醇、丙酮、乙酸乙酯及乙二胺等都能顯著提高標準肽段的信號強度； 與空氣為輔助氣相比，信號強度可以提高1000倍。相比之下，乙醇可更明顯提高多價離子響應，有利于多肽質譜鑒定，因此，采用乙醇作為輔助氣進行后續實驗。

3.3 痕量BSA酶解產物分析

基于nano-RPLC-ESI-MS/MS系統，對1 ng BSA酶解產物進行分離分析。輔助氣中添加乙醇后，在CEESI空腔內，乙醇與霧滴在離子傳輸管內相互作用，肽段譜圖匹配（PSM）、肽段數目、序列覆蓋率均提高約10%（表1）。比較肽段的峰面積發現，添加乙醇的輔助氣提高了大部分肽段的質譜響應，與文獻＼[16＼]結果相似。但是并未觀察到標準肽段信號的改善，這可能是因為高濃度乙醇輔助氣會抑制流動相揮發。

由于高濃度乙醇氣氛會抑制霧滴中有機溶劑揮發，不同樣品溶劑對標準肽段靈敏度有較大的影響。在相同的乙醇分壓下，純水為溶劑時信號改善效果最顯著（圖4）； 溶劑中僅加入乙腈時，隨著溶劑中乙腈加入量增大，信號改善效果變差，甚至降低肽段的質譜響應； 加入0.1% FA，獲得更顯著的改善效果。然而，隨著有機相比例增大，會抑制乙醇對標肽質譜響應的改善效果。以上結果說明，乙醇分壓太高會抑制有機溶劑的揮發，不利于樣品離子化，因而實際應用時，應選擇輔助氣中的有機添加劑的最佳分壓。

采用LC-ESI-MS/MS分析痕量BSA酶解產物時，多肽的色譜峰主要分布于有機相為10%～35%的條件下，即僅在有機相濃度較低時，出峰的肽段信號得到改善，進一步證實了高濃度乙醇氣氛會抑制霧滴溶劑揮發。當乙醇分壓下降時，抑制效果減弱，質譜響應顯著增強。

3.4 痕量HeLa細胞提取蛋白酶解產物分析

在最佳分壓的乙醇氣氛中，肽段和蛋白鑒定數目明顯增多。當HeLa酶解產物的上樣量為6 ng和10 ng時，乙醇氣氛下肽段和蛋白鑒定數目較空氣氣氛約提高了20%； 當上樣量為20 ng時，多肽和蛋白鑒定數目分別提高360%和200%（圖5）。此結果進一步證實乙醇氣氛可以提高分析物離子化效率，促進多肽質譜響應。當進樣量增大到50 ng時，乙醇氣氛下肽段和蛋白鑒定數目較空氣氣氛分別提高280%和158%； 相對20 ng進樣量的鑒定結果提高較少。因而，氣氛輔助CEESI源更適于痕量蛋白質組樣品的分析。

與開放式離子源比較， CEESI特殊設計的離子傳輸管的內表面具有康達效應功能，可改善離子傳輸效率。同時，結合輔助氣添加劑與噴霧的相互作用，促進肽段離子化。在考察的上樣量范圍內，采用CEESI源可將鑒定的肽段和蛋白數目分別提高58%～320%和50%～180%。

采用空氣作為輔助氣，當樣品量較小（小于20ng）時，CEESI鑒定的肽段和蛋白數目較開放式nano-ESI分別提高30%和12%。但是隨著樣品量增加，采用開放式nano-ESI可以獲得更多的肽段和蛋白鑒定數目。這可能是因為上樣量較小時，空氣氣氛下的封閉式離子源具有更高的離子傳輸效率，因而可以比開放源鑒定更多的肽段和蛋白數目。當樣品量增大時，高效離子化產生更多的離子，但是受離子傳輸管離子傳輸效率的限制，進入質量分析器的肽段離子受限，因此開放源具有更顯著的優勢。

乙醇氣氛不僅改善離子傳輸效率、促進多肽離子化，而且可以改善噴霧穩定性。以上樣量20 ng為例（圖5C），空氣氣氛封閉式離子源、乙醇氣氛封閉式離子源和開放式離子源三針共同鑒定到的蛋白質比例分別是25.0%， 30.6%和19.5%，證實CEESI源比開放納噴源具有更好的噴霧穩定性。

4 結 論

針對開放式電噴霧離子源噴霧穩定性差、離子化效率低及噴針壽命短等問題，設計了氣氛可調CEESI源。通過考察具有不同飽和蒸氣壓的有機小分子作為輔助氣對電噴霧效果的影響，發現乙醇能夠顯著提高標準肽段信號強度。在最佳的乙醇分壓下，不僅HeLa細胞提取蛋白質酶解產物的肽段和蛋白鑒定數目顯著提高，而且噴霧穩定性得到了改善。上述結果初步說明，CEESI源在痕量蛋白質組樣品分析方面具有很大的應用潛力。

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