胰泰復方對慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠Bcl-x和p53表達的影響*

王科軍高麗娟張淼劉華生△

（1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040）

·研究報告·

胰泰復方對慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠Bcl-x和p53表達的影響*

王科軍1高麗娟2張淼1劉華生1△

（1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040）

目的觀察胰泰復方對慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠Bcl-x和p53表達的影響。方法將大鼠分成4組，空白組、模型組、中藥對照組、中藥治療組。空白組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液；其余各組腹腔注射L-精氨酸，制備慢性胰腺炎大鼠模型。造模成功，各組實行相應治療2個月。治療結束后，采用免疫組織化學法檢測各組大鼠胰腺組織的Bcl-x和p53蛋白表達。結果模型組、中藥對照組和中藥治療組中的Bcl-x蛋白表達水平顯著低于空白組；中藥治療組中的Bcl-x蛋白表達水平高于中藥對照組和模型組；模型組、中藥對照組和中藥治療組中的p53蛋白表達水平顯著高于空白組；中藥治療組中的p53蛋白表達水平低于中藥對照組和模型組（均P＜0.05或P＜0.01）。結論胰泰復方可以減緩慢性胰腺炎胰腺纖維化進程，其分子機制可能與Bcl-x蛋白表達上調及p53蛋白表達下調相關。

慢性胰腺炎胰腺纖維化胰泰復方Bcl-xp53

隨著現代人生活飲食方式的轉變，慢性胰腺炎（CP）的發病有呈逐年升高的趨勢，但尚未有明確的流行病學資料。CP是各種致病因素導致胰腺組織及其功能不可逆轉改變的一種慢性炎癥性疾病［1］，胰腺實質的纖維化表現是其主要的病理學特征［2］。細胞凋亡與組織纖維化的發生發展有著密切的關系，很多學者研究亦集中于此。如曹勤等［3］研究發現甘草酸可能通過下調細胞凋亡相關基因p53蛋白表達水平而發揮其抗肝纖維化的作用。本課題組長期從事胰腺纖維化的研究，亦得出CP胰腺纖維化與細胞凋亡具有相關性［4］。基于此，筆者欲通過檢測胰泰復方對慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠Bcl-x和p53表達的影響，進一步探討胰腺纖維化與細胞凋亡的關系及胰泰復方抑制胰腺纖維化的作用機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物SD雄性大鼠40只，體質量（250±20）g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心供給。

1.2藥劑與儀器胰泰復方由柴胡、白術、人參、紅花、桃仁、當歸等組成，于黑龍江中醫藥大學第一附屬醫院購買；清胰利膽顆粒是由吉林省長春銀諾克藥業有限公司生產制造，于哈爾濱哈恒瑞新特藥店購買；L-精氨酸來源于天津博迪化工有限公司；Bcl-x免疫組化染色試劑盒來源于北京中杉金橋生物技術有限公司；p53免疫組化染色試劑盒來源于北京中杉金橋生物技術有限公司。主要儀器有：日本生產的Olympus B×60研究用顯微鏡、德國生產的Thermo HM 340E石蠟切片機、中國廈門麥克奧迪提供的Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統。

1.3模型制備應用0.9%氯化鈉注射液配置成13.3%的L-精氨酸溶液，模型組、中藥對照組及中藥治療組實行左下腹腔注射13.3%L-精氨酸，制備CP大鼠實驗模型。每次給藥時，分2次實行左下腹腔注射，時間間隔為1 h，每次所需L-精氨酸的量按照大鼠每100 g質量需用藥0.2 g進行計算。L-精氨酸給藥總計3次，時間間隔為3 d，共10 d完成。空白組應用0.9%氯化鈉注射液實行左腹腔注射，用量、次數及方法與前相同。

1.4分組與方法40只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥對照組及中藥治療組，共4組，每組各包含10只。造模成功后，于第11日，各組開始行相應藥物灌胃治療，中藥治療組應用胰泰復方水煎劑治療，依照11.25 g/kg標準進行灌胃，中藥對照組給予清胰利膽顆粒沖劑，依照2.7 g/kg標準進行灌胃（以上計算標準應用正常成人與大鼠給藥劑量系數折算得出），模型組、空白組給予相應量的0.9%氯化鈉注射液進行灌胃。以上治療，每日1次，持續給藥2個月。

1.5標本采集與檢測灌胃治療結束后，處死各組實驗大鼠，行開腹解剖，摘取其相同部位的胰腺組織后，立即浸入10%中性甲醛緩沖液中固定24 h以上。先用梯度酒精脫水、二甲苯透明，然后進行石蠟包埋，切片厚度約為3 μm，最后施行免疫組化檢測。Bcl-x和p53蛋白表達檢測，應用即用型一步法免疫組化測定法，Bcl-x和p53試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，依照說明書進行實驗操作。首先將組織切片脫蠟并水化。然后依據Bcl-x或p53一抗的需要，應用pH為6.0的抗原修復液對組織切片進行預處置。隨后用3%H2O2去離子水孵育切片，持續15 min，用以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗，滴加Bcl-x或p53一抗，4℃孵育留宿；PBS浸洗，滴加IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，37℃孵育30 min，PBS每次沖洗3 min，共5次；使用DAB溶液染色，鏡下控制染色結果。最后依次進行蒸餾水沖洗、蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹脂封片。將切片置在200倍顯微境下觀察并拍攝照片，采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統對各組切片進行分析，得到各組切片的陽性目標面密度，以此來判定Bcl-x和p53蛋白表達結果。Bcl-x表達為細胞漿和細胞膜，p53表達為細胞核，各組切片中陽性表達為棕黃色沉積。

1.6統計學處理使用SPSS17.0統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，運用單因素方差分析的方法對多樣本均數進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

各組大鼠胰腺組織Bcl-x與P53表達水平比較見表1和圖1，圖2。模型組、中藥對照組和中藥治療組中的Bcl-x蛋白表達水平顯著低于空白組（P＜0.01）；中藥治療組中的Bcl-x蛋白表達水平高于中藥對照組（P＜0.05），且顯著高于模型組（P＜0.01）；模型組、中藥對照組和中藥治療組中的p53蛋白表達水平顯著高于空白組（P＜0.01）；中藥治療組中的p53蛋白表達水平低于中藥對照組（P＜0.05），且顯著低于模型組（P＜0.01）。

表1　各組大鼠BCL-x和p53蛋白表達結果比較（±s）

表1　各組大鼠BCL-x和p53蛋白表達結果比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與中藥對照組比較，#P＜0.05。

組別nBCL-xp53空白組100.07763±0.010930.00191±0.00098模型組100.01904±0.00331*0.06026±0.01795*中藥對照組100.03157±0.00576*△0.03932±0.00901*△中藥治療組100.04160±0.00273*△#0.02293±0.00904*△#

3　討論

導致胰腺纖維化的因素較為廣泛，其具體發病機制仍尚未明確［5］，但過多分泌的細胞外基質（ECM）和大量的成纖維細胞增生是其主要的病理學基礎。腺泡逐漸萎縮丟失被纖維增生所替代是CP腺纖維化的前提。胰腺腺泡的壞死及凋亡與與腺泡的萎縮丟失有著密切的關系，而且胰腺腺泡細胞凋亡的現象在人或大鼠CP組織中都有發生。因此，細胞凋亡在胰腺纖維化的發展進程中具有著重要的意義。細胞凋亡是細胞本身主動進行死亡的生物學過程，在多種基因調控下而發生。其中Bcl-2蛋白家族和抑癌基因p53對細胞凋亡有重要的調控作用。Bcl-2基因家族主要由Bcl-2、Bcl-x及Bax等組成。Bcl-x主要由Bcl-xl和Bcl-xs兩型組成，其中以Bcl-xl的作用為主，對線粒體通透性轉換孔（PTP）開放具有抑制的作用，從而起到抑制細胞凋亡的作用［6］。p53可分為野生型p53和突變型p53兩種類型。野生型p53對人體細胞的轉化生長具有較大的調控作用，具有誘導發生細胞凋亡的作用，而突變型p53可以誘導發生多種癌變。本實驗通過對胰腺組織中的Bcl-x及p53蛋白表達的檢測，可推斷胰泰復方可能通過調控與細胞凋亡相關因子Bcl-x和p53的表達而發揮作用，對胰腺纖維化的發展進程具有較大的調控作用，為探討研究中醫藥治療CP纖維化的機制提供了實驗依據。

圖1　各組BCL-x表達（HE，×20）

圖2　各組p53表達（HE，×20）

CP典型的癥狀表現為發作性上腹部疼痛，后期可逐漸出現食欲降低、食少、納呆、便溏及消瘦。因此癥狀上來看，多與中醫學的腹痛和泄瀉等疾病相關。中醫之脾為后天之本，主運化，是氣血產生的源頭；西醫之胰為消化腺，具有分泌含有豐富消化液的胰液的作用。因此，從中醫之病位上來分析，多與脾胃相關，從中醫之病機上來分析，多為虛實夾雜，以脾虛為本，氣滯血瘀為標。因此，中醫在治療CP時，應標本兼治，以治療脾虛為中心，兼以疏肝行氣，活血化瘀。胰泰復方就是建立在這樣的治療原則基礎上而形成的，在臨床中應用效果顯著。針對CP的中醫脾虛病機本質，方中選用具有健脾益氣功效的人參、白術和茯苓為君藥，主要用來恢復脾的正常生理功能；針對氣滯血瘀的實性病機，選用具有疏肝活血止痛功效的柴胡、桃仁和當歸為臣藥，以達行氣活血而止疼痛的目的；最后，使以甘草，以達補氣而調和諸藥的目的。縱觀全方，可知胰泰復方是由四君子湯與復元活血湯化裁而成，具有健脾益氣、行氣活血的功用。

［1］中華醫學會外科學分會胰腺外科學組.慢性胰腺炎診治指南（2014）［J］.臨床肝膽病雜志，2015，31（3）：322.

［2］Stevens T，Conwell DL，Zuccaro G.Pathogenesis of chronic pancreatitis：an evidence-based review of past theories and recent developments［J］.Am J Gastroenterol，2004，99（11）：2256-2270.

［3］曹勤，蔡瑜，郭曉玲，等.甘草酸對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化肝組織p53蛋白表達的影響［J］.中華消化病與影像雜志：電子版，2014，4（6）：10-13.

［4］劉華生，劉爽，周景華.胰泰復方對慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響［J］.中國中醫急癥，2008，17（5）：662-663.

［5］Braganza JM，Lee SH，McCloy RF，et al.Chronic pancreatitis［J］.Lancet，2011，377（9712）：1184-1197.

［6］施勤，劉繼明，張學光.細胞凋亡的線粒體調控與BCL-2基因家族［J］.上海免疫學雜志，2000，20（1）：60-61.

Effects of Yintai Compounded Medication on the Expression of Bcl-x and P53 in the Chronic Pancreatitis Rats with Pancreatic Fibrosis

WANG Kejun，GAO Lijuan，ZHANG Miao，et al.

Department of TCM diagnostics in basic medical college of Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang，Harbin 150040，China

Objective：To research the effects of Yintai Compounded Medication on the expression of Bcl-x and P53 in the chronic pancreatitis rats with pancreatic fibrosis and discuss its mechanism of the effects.Methods：40 SD rats were divided into 4 groups：the normal group，the model group（treated with normal saline），Chinese Medicine control group（treated with Qingyilidan Granula）and Chinese Medicine treatment group（treated with Yintai Compounded Medication）.The normal group received celiac injection of normal saline，while the other groups were treated with celiac injection of 13.3%L-arginine for establishing chronic pancreatitis rat models.And then the four groups were given corresponding treatment.After 2-month treatment，we used immunohistochemical method to detect the expression of Bcl-x and P53.Results：The expression levels of Bcl-x in the model group，Chinese Medicine control group and Chinese Medicine treatment group were significantly lower than that of the normal group（P＜0.01）；the expression level of Bcl-x in Chinese Medicine treatment group was higher than that of Chinese Medicine control group（P＜0.05），and significantly higher than that of the model group（P＜0.01）.The expression levels of P53 in the model group，Chinese Medicine control group and Chinese Medicine treatment group were significantly higher than that of the normal group（P＜0.01）；the expression level of P53 in Chinese Medicine treatment group was lower than that of Chinese Medicine control group（P＜0.05），and significantly lower than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Yintai Compounded Medication can slow down the process of pancreatic fibrosis，which is possibly related with the up-regulation of Bcl-x and the down-regulation of P53.

Chronic pancreatitis；Pancreatic fibrosis；Yintai Compounded Medication；Bcl-x；P53

R285.5

A

1004-745X（2015）10-1705-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.005

2015-06-21）

黑龍江省自然科學基金資助項目（D2005-37）；教育部“春暉計劃”合作科研資助項目（404S809）；黑龍江中醫藥大學校科研基金資助項目（2014bs08）

（電子郵箱：741835240@qq.com）