感染遲緩愛德華氏菌雜交鱧血清指標動態變化

陳言峰

(佛山科學技術學院生命科學學院，廣東佛山528231)

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)隸屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)，是水產動物重要的致病菌之一。目前，遲緩愛德華菌已引起多種魚類的病害［1-5］，給水產養殖業造成了巨大的經濟損失。雜交鱧是采用斑鱧(♀)和烏鱧(♂)雜交所得的子一代，具有生長速度快、養殖周期短、病害少、成活率高、可攝食人工配合飼料等特點［6-7］，且肉質細嫩、營養豐富。近年來，雜交鱧的人工養殖發展迅猛，已成為我國重要的淡水養殖品種［8］。

血液是魚體內的一種重要體液。當魚體受到致病因子的影響時，其產生的病理變化會通過血液學變化反映出來，因此血液指標可用于評價魚類的健康狀況［9］。同時，血液指標的動態變化也反映了魚體病理學變化的過程。然而，目前對魚類感染遲緩愛德華氏菌后血液指標動態變化的研究很少。筆者通過對感染遲緩愛德華氏菌后雜交鱧血清指標的動態變化進行分析，旨在從血液方面探討遲緩愛德華氏菌的致病機理以及患病雜交鱧血液成份的變化規律，并為今后該疾病的診斷和治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 遲緩愛德華氏菌菌株ZS201364-1由佛山科學技術學院生命科學學院實驗室于2013年從患病雜交鱧體內分離并保存［10］。200尾健康的雜交鱧，體質量為(497±23)g，購于佛山市三水區某雜交鱧養殖場。將200尾雜交鱧分2組(感染組和對照組)暫養于養殖池，每組100尾。每天換水1次，投餌2次，水溫25～28℃，暫養2周無異常后開始試驗。

1.2 人工感染 將試驗菌株接種于營養瓊脂培養基，37℃下培養24 d，用無菌生理鹽水洗脫，稀釋至濃度7.5×104cfu/ml備用。將感染組的魚按照0.5 ml/尾的劑量進行腹腔注射，對照組的魚則按照相同的劑量注射無菌生理鹽水。

1.3 血清生化指標的測定 在感染后的第1、2、3、4、5天的同一時間點分別從感染組和對照組各取10條魚，尾靜脈采血，每尾魚采血5 ml，分裝于2 ml離心管中，靜置2 h后離心(3000 r/min離心10 min)分離血清，在-80℃下保存至生化指標測定。

使用全自動生化分析儀檢測血清中總蛋白、球蛋白、尿素氮、總膽紅素、血糖、尿酸、尿素氮、肌酐、鈣離子的濃度以及谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、淀粉酶的活力。酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶活力的測定則根據試劑盒說明書進行。酚氧化酶活力的測定參照文獻［11］中的方法進行，將 200 μl(0.1 mol/L，pH 6.0)磷酸鹽緩沖液與10 μl的0.01 mol/L的L-dopa及10 μl血清于室溫下混勻，振蕩4次，間隔4 min讀取490 nm處的吸光值，酶活力為以試驗條件下每分鐘OD490增加0.001定義為一個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 感染遲緩愛德華菌后雜交鱧總蛋白、球蛋白、總膽紅素和血糖濃度的變化

2.1.1 總蛋白。從圖1A可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后不同時間點的感染組雜交鱧血清總蛋白濃度的平均值逐漸升高，在第4天達到最高值，第5天降低，且第4天的感染組球蛋白濃度顯著高于第1、2、5天(P﹤0.05)。第4天，感染組總蛋白濃度顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.1.2 球蛋白。從圖1B可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后不同時間點的感染組雜交鱧血清球蛋白濃度的平均值逐漸升高，在第4天達到最高值，第5天降低，且第4天的感染組球蛋白濃度顯著高于第1、2、3天(P＜0.05)。但是與對照組相比，每個時間點的感染組球蛋白濃度均無顯著性差異(P＞0.05)。

2.1.3 總膽紅素。從圖1C可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后感染組雜交鱧血清總膽紅素濃度的平均值在1～2 d升高，在第2天達到最高值，隨后逐漸降低至接近對照組的水平，且第2天感染組總膽紅素濃度顯著高于第1、4、5天(P＜0.05)。第2、3天，感染組總膽紅素濃度顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.1.4 血糖。從圖1D可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，第2、3天感染組血糖濃度顯著高于第1天(P＜0.05)，而第4、5天感染組血糖濃度又顯著高于第1、2、3天(P＜0.05)。同一時間點的感染組血糖濃度與對照組相比均存在顯著差異(P＜0.05)。

2.2 感染遲緩愛德華氏菌后雜交鱧血清尿酸、尿素氮、肌酐和鈣離子濃度的變化

2.2.1 尿酸。從圖2A可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，第1、2天感染組雜交鱧血清尿酸濃度基本持平，從第3天開始升高，在第4天達到最高值，第5天有所降低，且第4天感染組尿酸濃度顯著高于第5天(P＜0.05)，而與第1～3天無顯著性差異(P＞0.05)。第4天，感染組尿酸濃度顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.2.2 尿素氮。從圖2B可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，1～5 d盡管感染組雜交鱧血清尿素氮濃度的平均值呈現先升高后降低的趨勢，但不同時間點的感染組之間以及同一時間點的感染組與對照組之間均無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2.3 肌酐。從圖2C可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，感染組雜交鱧血清肌酐濃度的平均值在1～3 d升高，在第3天達到最高值，隨后降低至接近對照組的水平，且第3天感染組總膽紅素濃度顯著高于第1、2、4天(P＜0.05)。第3天，感染組肌酐濃度顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.2.4 鈣離子。從圖2D可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，感染組雜交鱧血清鈣離子濃度的平均值在1～3 d升高，在第3天達到最高值，隨后逐漸降低，且第3天感染組鈣離子濃度顯著高于第1、5天(P＜0.05)。第2、3天，感染組鈣離子濃度顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3 感染遲緩愛德華氏菌后雜交鱧血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、淀粉酶和超氧化物歧化酶活力的變化

2.3.1 谷丙轉氨酶。從圖3A可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，第1、2天的感染組雜交鱧血清谷丙轉氨酶活力基本持平，從第3天開始升高，在第4天時達到最高值，第5天時降低至接近對照組的水平，且第4天感染組谷丙轉氨酶活力顯著高于其他時間點(P＜0.05)。第4天，感染組谷丙轉氨酶活力顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3.2 谷草轉氨酶。從圖3B可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，感染組雜交鱧血清谷草轉氨酶活力的平均值在1～3 d升高，在第3天達到最高值，隨后降低至接近對照組的水平，且第3天感染組谷草轉氨酶活力顯著高于其他時間點(P＜0.05)。第2、3天，感染組谷草轉氨酶活力顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3.3 淀粉酶。從圖3C可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，1～5 d內感染組雜交鱧血清淀粉酶活力的平均值呈現先降低后升高的趨勢。第5天，感染組淀粉酶活力顯著高于其他時間點(P＜0.05)，且此時感染組淀粉酶活力顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3.4 超氧化物歧化酶。從圖3D可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，1～5 d內感染組雜交鱧血清超氧化物歧化酶活力的平均值呈現先升高后降低的趨勢。第5天，感染組超氧化物歧化酶活力顯著低于第2、3、4天(P＜0.05)，且此時感染組淀粉酶活力顯著低于對照組(P＜0.05)。

2.4 感染遲緩愛德華氏菌后雜交鱧血清酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、酚氧化酶活力的變化

2.4.1 酸性磷酸酶。從圖4A可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，感染組雜交鱧血清酸性磷酸酶活力在第2天降至最低值，隨后升高至接近對照組水平。第2天，感染組酸性磷酸酶活力顯著低于其他時間點(P＜0.05)，且此時感染組酸性磷酸酶活力顯著低于對照組(P＜0.05)。

2.4.2 堿性磷酸酶。從圖4B可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，感染組雜交鱧血清堿性磷酸酶活力的平均值在1～3 d逐漸升高，在第3天達到最高值，隨后逐漸降低，且第3天感染組堿性磷酸酶活力顯著高于第1、2、5天(P＜0.05)。第3天，感染組堿性磷酸酶活力顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.4.3 溶菌酶。從圖4C可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，不同時間點的感染組雜交鱧血清溶菌酶活力的平均值逐漸升高，在第4天達到最高值，第5天降低，且第3、4天的感染組溶菌酶活力顯著高于第1、2、5天(P＜0.05)。同一時間點的感染組溶菌酶活力與對照組相比，均存在顯著差異(P＜0.05)。

2.4.4 酚氧化酶。從圖4D可以看出，人工感染遲緩愛德華氏菌后，第1、2天的感染組雜交鱧血清酚氧化酶活力基本持平，在第3天升高，隨后逐漸降低。第3天感染組酚氧化酶活力顯著高于其他時間點(P＜0.05)，且此時感染組酚氧化酶活力顯著高于對照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 遲緩愛德華氏菌引發的魚類組織病理學 Miyazaki等［12］報道感染遲緩愛德華氏菌后鰻鱺的組織病理學可能會存在2種不同的類型:①肝臟型，其病理特征是肝臟為主要病灶，腎臟僅發現輕微的增生浸潤反應;②腎臟型，即腎臟為主要病灶。郭瓊林等［13］在研究鰻鱺感染遲緩愛德華氏菌后的組織病理學時，未發現單純的腎臟型，而是肝臟型和肝腎混合型。秦蕾等［14］則發現遲緩愛德華氏菌感染大菱鲆時，以腎臟病理變化最為明顯，除此以外肝臟、脾臟、腸和鰓等器官組織也發生不同程度的病變。上述結果可能是由于不同菌株的毒力、感染方式和魚的品種不同所導致。

3.2 由魚類器官組織病變引發血清生化指標的異常 魚類的肝臟是合成蛋白質的重要場所，一旦肝臟受損則蛋白質產量將會下降［15］，但該研究中發現感染組總蛋白濃度有升高的趨勢，這與陳寅兒等［16］的研究結果一致，其病理變化的機制有待于進一步研究。另外，盡管感染組的球蛋白濃度在前4 d有逐漸升高的趨勢，但與對照組相比并無顯著性差異，這與徐曉津等［17］的研究結果不一致。據此推測，可能是由于患病后魚體嚴重脫水、血液濃縮所致［18］。這表明雜交鱧感染遲緩愛德華氏菌后對其球蛋白影響較小。

該研究中感染組雜交鱧的血糖水平顯著降低，據此推測遲緩愛德華氏菌對雜交鱧的肝造成了明顯的損害，肝功能下降可導致其糖原分解能力降低，從而引起血糖水平下降。膽紅素大部分來自衰老紅細胞裂解而釋放出的血紅蛋白，當肝細胞有異常時會引起高膽紅素血癥［19］。該研究中感染后第2、3天總膽紅素濃度顯著高于對照組，也從側面反映了雜交鱧肝臟的病變。

谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶是重要的細胞內酶，主要分布于機體的肝臟，是肝臟功能的重要指標，在正常情況下這些酶在血清中活性低且相對恒定，但當肝臟發生損傷時，血清內這2種酶的活性將升高［20］。該研究結果也證實了這一點。該研究還發現堿性磷酸酶活力在感染后第3天也呈現出升高的趨勢，這與張永嘉等［15］報道的患有網箱養殖綜合癥的羅非魚和陳寅兒等［16］報道的患溶藻弧菌病的鱸魚血液中堿性磷酸酶活力升高一致。據此推測，可能是臟細胞受損后其胞膜的通透性發生變化導致堿性磷酸酶漏出，從而引起血清中該酶的濃度升高。

高尿酸癥是一種代謝性疾病，是由于嘌呤代謝紊亂產生過多尿酸或尿酸排泄減少，并在體內蓄積所致。推測細菌侵入腎臟后引起損傷，導致腎功能紊亂。血液中尿素氮的水平反映了肝臟和腎臟的功能［21］。尿素主要是在肝臟內合成，由腎臟排泄。血液尿素氮可以比較準確反映動物體內蛋白質的代謝情況，蛋白質代謝良好時，血液尿素氮濃度較低［22］。感染組尿素氮與對照組相比無顯著性差異，表明遲緩愛德華氏菌感染對雜交鱧血清的尿素氮水平影響不大。

關于魚類感染病原菌后其血清淀粉酶活力的變化，目前國內外尚未見到相關報道。于美芝等［23］曾報道十二指腸憩室、腸梗阻、潰瘍引起血液淀粉酶活力升高的病例。據此推測，可能是遲緩愛德華氏菌感染后對腸產生了一定的損傷，導致腸功能紊亂，從而引起淀粉酶活力升高。

Ozaki［18］認為肌酐是肌酸的代謝產物，若肌酐在血清中含量明顯增加，則表明肌肉組織受損嚴重。該研究中第3天感染組肌酐濃度顯著高于對照組，推測魚體的肌肉組織發生了代謝障礙，產生病變。

鈣的主要生理功能之一是激活各類酶的活性。感染組鈣離子濃度在第2、3天高于對照組，這與徐曉津等［17］的研究結果具有一定的一致性。據此推測，可能是由病原菌感染引起魚體免疫反應增加，需要激活更多有關免酶活性造成的。

超氧化物歧化酶是魚體清除體內自由基的主要酶類，也是機體防御過氧化損傷系統的關鍵酶之一［24］。當感染遲緩愛德華氏菌后，在病原菌的誘導下產生了部分自由基，超氧化物歧化酶活力伴隨著自由基的增多也隨之升高，以清除過量的自由基，因此在感染后出現了該酶的活力略升高的現象，而雜交鱧在清除病原菌過程中又會產生部分自由基，當清除自由基對酶的消耗超過了雜交鱧的生產能力時，酶活力將會下降。

酸性磷酸酶是一類在酸性條件下催化水解磷酸單酯的水解酶，是溶酶體的標志酶，酸性磷酸酶與溶酶體生理功能的正常發揮密切相關［25］。溶酶體的基本功能是對生物大分子的強烈消化作用，以維持細胞的正常代謝活動［26］。某些宿主可以識別并吞噬入侵的病毒或細菌，在溶酶體作用下將其殺死并進一步降解。此時，包括酸性磷酸酶在內的溶酶體中的各種水解酶活力和含量都會明顯改變［27］。該研究中感染組雜交鱧的酸性磷酸酶活力在第2天顯著低于對照組，據此推測血細胞釋放的酸性磷酸酶參與了病原菌的清除，導致其活力降低。

溶菌酶是魚類體液免疫因子之一，它產生于嗜中性粒細胞和巨噬細胞，并被分泌到血液及粘液中發揮溶菌效應［28］。酚氧化酶是甲殼動物防御系統的重要組成部分，在識別異物、促進血細胞吞噬、產生殺滅和排除異物等免疫功能方面發揮重要的作用［29-30］。該研究中溶菌酶與酚氧化酶活力的變化也證實了這一點。

3.3 遲緩愛德華氏菌感染后雜交鱧血清指標的總體變化 魚類感染病原菌后血清指標的變化，可能與不同菌株的毒力、注射的菌液濃度、不同魚的品種對該菌的抵抗能力、同種魚不同個體的差異、養殖水體的主要理化因子如水溫等有關。在該研究的試驗條件下，遲緩愛德華氏菌進入雜交鱧體內后，對其器官組織產生一定的損傷，此時血清指標發生異常的變化，然而伴隨著魚體不斷分泌抗菌物質，逐漸消除體內的病原菌，最終血清指標又恢復至對照組水平。

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