雪菊對肝癌和肺癌細胞體外抗腫瘤作用研究

帕爾哈提·買買提依明，令狐晨，朱青梅，阿依吐倫·斯馬義*

(1.阿克蘇地區庫車縣人民醫院，新疆阿克蘇842000;2.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011)

雪菊又名“血菊”，為菊科金雞菊屬(Coreopsis)植物，是目前新疆與雪蓮齊名的野生植物［1］。雪菊具有降血壓、降血脂、抗衰老、抗癌、抗炎等生物活性［2］。國內關于雪菊的體外抗腫瘤并未報道，國外的報道僅限于雪菊的單體對小鼠皮膚腫瘤抑制作用［3］。癌癥儼然成為危害了人類健康的頭號殺手。由于主流的治療癌癥的方法存在諸多缺陷，世界科學家開始把抗腫瘤藥物研究的目光轉移到天然產物上，一些具有抗腫瘤作用的天然活性成分陸續從中草藥中被分離發現［4］。筆者在此體外培養人肝癌細胞(7404)及人非小細胞肺癌細胞(A549)，用不同濃度的雪菊總黃酮純化物、粗提物及總多糖分別對細胞作用后，MTT法檢測細胞生長抑制率，流式細胞儀測細胞的凋亡率，探討雪菊總黃酮和總多糖對人肝癌細胞和人非小細胞肺癌細胞的增殖的抑制作用，為雪菊的藥理活性深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。CO2培養箱(美國Thermo公司);Benchmark PLUS型全波長酶標儀(美國BIORAD公司);流式細胞儀(美國BECKMAN公司);倒置熒光三目顯微鏡(美國Cool-SNAP);ZHJH-1214C型超凈工作臺(中國上海智城有限公司);TP114型電子天平(美國丹佛公司);Br4i型低溫離心機(美國Jouan公司)。

1.1.2 試劑。胚胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號141012);二甲基亞砜(美國MP Biomedicals公司，批號 M5178);培養基(美國 HyClone公司，批號AZG190856);噻唑藍MTT(美國sigma公司，批號M5655);凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，批號3337788);胰酶(美國Gibco公司，批號25200)。

1.1.3 腫瘤細胞。人肝癌細胞(7404)和人非小細胞肺癌細胞(A549)由新疆第一附屬醫院基礎醫學研究所阿爾孜古麗·吐爾遜老師惠贈。

1.1.4 藥材。昆侖雪菊為菊科金雞菊屬(Coreopsis)植物，于2013年6～9月在新疆和田地區昆侖山采集，經新疆醫科大學藥學院天然藥物化學/生藥學教研室帕麗達·阿布力孜教授鑒定為菊科金雞菊品種。

1.1.4.1 昆侖雪菊總黃酮提取物。雪菊于60℃干燥1 h，研磨，過三號篩，備用。稱取雪菊適量，按1∶20投料比加50%乙醇40 ml，浸泡1 h，利用超聲微波協同萃取儀萃取30 min，過濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測定總黃酮含量為22.56%。

1.1.4.2 總黃酮純化物。由雪菊總黃酮粗提物經聚酰胺純化工藝獲得，總黃酮含量為68.04%。

1.1.4.3 昆侖雪菊總多糖。雪菊于60℃干燥1 h研磨，過三號篩，備用。稱取雪菊適量，1∶20投料比，加40 ml蒸餾水，浸泡1 h，利用超聲微波協同萃取儀，超聲30 min，過濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測定總多糖含量為24.74%。

1.2 方法

1.2.1 供試液的制備。精密稱定雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖浸膏各0.1 g，用二甲基亞砜(DMSO)溶解于10 ml容量瓶中，配制成質量濃度為5 g/L的3種供試液，4℃冰箱保存，臨用前用培養液稀釋分別配制成不同濃度的3種供試液，并保證各供試液中 DMSO的體積分數＜0.1%。

1.2.2 MTT法測細胞增殖抑制率。取對數生長期的細胞用胰酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液稀釋細胞，調整7404和A549細胞懸浮液密度為3×104個/ml，將配制好的細胞懸液加入96孔培養板中，每孔200 μl，置37℃，5%CO2培養箱中培養24 h后，觀察其貼壁情況，貼壁狀況良好后，將每孔的培養液輕輕取出，將雪菊總黃酮純化物、粗提物及總多糖3個試驗組分別加入最終濃度為50、100、200、400、600 μg/ml提取物的培養液 200 μl，空白對照組則加入等體積溶劑的培養液，陽性對照組則為濃度為20 μg/ml的順鉑，每組4個孔，置37℃，5%CO2培養箱中培養，分別培養 48、72、96 h，培養結束前 4 h，每孔加 MTT 20 μl繼續培養4 h后，棄去上清液，然后每孔加DMSO 150 μl，振蕩混勻后，用Benchmark PLUS型全波長酶標儀檢測各孔在波長490 nm處的吸光度值，并按公式計算細胞生長抑制率，生長抑制率=(1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%［5］。

1.2.3 檢測細胞凋亡。取7404和A549的對數生長期細胞，以每孔2×105個細胞的密度接種于6孔培養板，培養24 h后，觀察其貼壁狀況，狀態良好時，分別加入100、200、400 μg/ml不同濃度的雪菊總黃酮純化物，并設立細胞對照組(不加藥物)，再置于37℃，5%CO2的培養箱中分別培養72 h后終止培養，把各孔的細胞培養液分別吸到15 ml離心管中，PBS洗滌貼壁細胞，用胰酶將細胞消化下來，加完全培養液終止后，收集并放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 ml PBS輕輕重懸細胞并計數，取含有2×105個細胞懸浮液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入100 μl緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC 和 PI，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，再加入400 μl的緩沖液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 統計分析 試驗數據均采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 MTT法檢測雪菊不同提取物對細胞增殖的抑制作用 用濃度分別為 50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于人肝癌細胞7404，72 h后，觀察不同濃度的樣品對7404細胞增殖的影響，結果(表1)發現，雪菊總黃酮粗提取物、純化物及雪菊總多糖對7404細胞增殖均有抑制作用，其IC50分別為 261.58、52.27、531.21 μg/ml，且抑制率均隨樣品濃度的增大而增大，呈現出劑量效應關系，各濃度組與對照組比較，有顯著性差異(P＜0.01)。通過各提取物的IC50比較，得出雪菊總黃酮純化物比雪菊黃酮粗提取物及其總多糖對細胞的抑制作用強。

表1 雪菊物不同濃度提取物對7404細胞生長的抑制作用

用濃度分別為 50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于人非小細胞肺癌細胞A549，觀察不同濃度的樣品對A549細胞增殖的影響，結果(表2)發現，雪菊總黃酮粗提取物、總黃酮純化物及總多糖對A549細胞增殖均有抑制作用，其IC50分別為 230.45、93.62、454.29 μg/ml，且抑制率均隨樣品濃度的增大而增大，呈現出劑量效應關系，各濃度組與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。通過各提取物的IC50比較，得出雪菊總黃酮純化物比黃酮粗提取物及其總多糖對細胞的抑制作用強。

表2 雪菊物不同濃度提取物對A549細胞生長的抑制作用

2.2 MTT法檢測相同濃度下雪菊不同提取物對細胞作用時間與抑制率的關系 從雪菊不同提取物濃度為200 μg/ml時不同提取物對人肝癌細胞(7404)和人非小細胞肺癌細胞(A549)隨時間增長的關系圖(圖1)可以看出，樣品濃度固定時，隨著樣品作用時間的增加，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖對各腫瘤細胞增殖的抑制作用增強，呈現時間依賴性。

2.3 流式細胞儀檢測雪菊總黃酮純化物對細胞凋亡率的影響 流式細胞儀Annexin V-PI雙標法進行凋亡率的測定，結果(表3)發現，100、200、400 μg/ml的雪菊總黃酮純化物作用7404、A549細胞72 h后，隨樣品濃度加大，活細胞比例逐漸減少，細胞凋亡發生率明顯增高。

圖1 雪菊不同提取物對7404(a)和A549(b)細胞作用時間與抑制率的關系

表3 雪菊總黃酮純化物對細胞凋亡率的影響

3 結論

惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一。在惡性腫瘤的三大療法中，藥物治療占有重要的地位。合成的化學類抗腫瘤藥物中絕大多數都是以天然抗腫瘤活性成分為先導化合物的。我國有豐富的天然藥用動物、植物和礦物資源，自20世紀60年代以來，我國的醫藥專家根據各民族運用天然抗腫瘤藥物的經驗，從民族醫藥中研究和開發出了一批療效確切、價格合理的天然抗腫瘤藥物。黃酮類化合物是一大類天然產物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分，具有抗菌抗病毒活性、抗炎、抗腫瘤活性等。因此該試驗所研究的雪菊總黃酮的抗腫瘤活性為雪菊藥理活性的研究奠定基礎。

MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，靈敏度高、簡便快速，最常用于體外抗腫瘤藥物篩選的方法。該試驗采用MTT法對雪菊總黃酮粗提取物、總黃酮純化物及總多糖進行體外抗腫瘤活性進行初步研究，結果表明，雪菊總黃酮粗提物、總黃酮純化物及總多糖對人肝癌細胞(7404)、人非小細胞肺癌細胞(A549)有一定的抑制作用，其中雪菊總黃酮純化物對2種腫瘤細胞的抑制作用最強，從而進行雪菊總黃酮純化物誘導細胞凋亡試驗，流式細胞儀Annexin V-PI雙標法測定凋亡率表明，隨樣品濃度加大，活細胞比例逐漸減少，細胞凋亡發生率明顯增高。

綜上所述，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖能抑制7404、A549細胞的增殖，呈劑量與時間依賴性，總黃酮純化物抑制作用尤為明顯，其抑制細胞增殖的機制可能與其誘導細胞的凋亡有關。但雪菊總黃酮純化物作為一種天然提取物，其成分復雜，對于是否還存在其他途徑，有待進一步的探討。

［1］張彥麗，王艷，李新霞，等.高效液相色譜法測定昆侖雪菊中綠原酸和黃芩苷的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(4):107-109.

［2］李冬明.昆侖雪菊的藥學研究進展［J］.浙江中醫雜志，2012，47(10):776-777.

［3］YASUKAWA K，AKIHISA T，KASAHARA Y，et al.Inhibitory effect of heliantriol C:a component of edible Chrysanthemum，on tumor promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin［J］.Phytomedicine，1998，5(3):215-218.

［4］杜崇民，劉春宇.黃酮類化合物抗腫瘤研究進展［J］.中國野生植物資源，2007，26(3):3-5.

［5］王天山，陸躍鳴，馬國祥，等.鼓槌石斛中化學成分對K562腫瘤細胞株生長抑制作用體外實驗［J］.天然產物研究與開發，1997，9(2):1-3.