黃綠蜜環菌菌種分離及人工培養研究

史強強，黨　軍，苑　祥，岳會蘭，王啟蘭（.中國科學院西北高原生物研究所，中國科學院藏藥研究重點實驗室，青海西寧80008；2.中國科學院大學，北京00049）

黃綠蜜環菌菌種分離及人工培養研究

史強強1，2，黨軍1，苑祥1，2，岳會蘭1，王啟蘭1
（1.中國科學院西北高原生物研究所，中國科學院藏藥研究重點實驗室，青海西寧810008；2.中國科學院大學，北京100049）

采用組織分離法從黃綠蜜環菌子實體的菌蓋與菌柄結合處分離菌種，經多次純化，獲得純化的黃綠蜜環菌菌株。以分離的黃綠蜜環菌母種為材料，通過單因素實驗和正交實驗，以菌落直徑及菌絲體干重為指標，研究不同碳源、氮源、無機鹽、維生素對菌絲體生長的影響。結果表明：黃綠蜜環菌菌絲最優化培養條件為馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB21 mg/L（等比例），在此培養條件下，黃綠蜜環菌菌絲體干重可達6.5 mg/mL。

黃綠蜜環菌，菌種分離，人工培養

黃綠蜜環菌（Armillaria luteo-virens），又名黃蘑菇，黃環菌，屬擔子菌門（Basidiomycota），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），蜜環菌屬（Armillaria）。主要分布于我國青海、四川、甘肅、西藏等地區，是高山草地上的一種名貴的珍稀野生食用菌［1-4］。黃綠蜜環菌目前仍處于野生狀態，資源量非常有限，被青海和西藏區的居民廣泛采食。由于黃綠蜜環菌集食用、藥用和保健功能于一身，深受消費者的青睞，市場需求量逐年增加，目前市場干品價可達1000元/kg，出口價更加昂貴。黃綠蜜環菌被公認為是最有開發利用價值的野生菌類之一。對于黃綠蜜環菌菌絲體培養條件的初步研究［6］、人工培養條件方面的研究［7-8］及深層發酵條件的研究［9］，已有相關文獻的報道。但是人工培養對其有效成分的開發研究尚屬起步階段，對黃綠蜜環菌菌絲體的人工培養也沒有系統的研究。如何經濟有效地進行生物活性組分的提取、利用，已成為黃綠蜜環菌深加工的重要研究內容之一。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黃綠蜜環菌采自青海省海北州、果洛、黃南、玉樹等地的黃綠蜜環菌子實體，除去子實體表面的異物及菌柄基部的泥土，裝入編號的牛皮紙袋內，帶回實驗室備用；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉天津市永大化學試劑有限公司；KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、（NH4）2SO4、FeSO4、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、CaCl2、VB1、VB2、復合VB上?；瘜W試劑總廠；蛋白胨、酵母粉、瓊脂北京雙旋微生物培養基制品廠；馬鈴薯、黃豆芽新鮮市售。

AG204型電子天平METTLER TOLEDO公司；LHS-250SC型恒溫恒濕培養箱上海一恒科技有限公司；HVE-90型高壓滅菌器日本HIRAYAMA公司；BCM-1000型超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司；BHF-T型生物顯微鏡日本OLYMBUS公司；UPI-1-520T型超純水器成都超純科技有限公司；DZF-6050型真空干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；HYG-A型全溫搖瓶柜太倉市實驗設備廠。

1.2實驗方法

1.2.1黃綠蜜環菌菌種分離與純化

1.2.1.1分離純化用培養基配方去皮馬鈴薯浸出汁20%，葡萄糖2%，酵母浸出汁1‰，微量鹽，微量復合VB，瓊脂1.8%，蒸餾水，pH6.5。

1.2.1.2分離純化黃綠蜜環菌菌種采用組織分離法從子實體的菌蓋與菌柄結合處分離菌種。從中選取無污染、生長健壯的菌株，經多次純化，最終獲得純化的黃綠蜜環菌菌株4株，經鑒定為黃綠蜜環菌菌株。分別編號為AM-H（海北）、AM-N（黃南）、AM-G（果洛）、AM-Y（玉樹），接種于試管斜面。從分離純化的菌種中篩選出長勢及適應性較好的菌株，作為人工培養材料。

1.2.2黃綠蜜環菌菌種的培養及其適應性研究以分離的黃綠蜜環菌母種（AM-H）為材料，經過PDA培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基）多次傳代培養，獲得AM-H菌株。

利用平板培養測定菌落生長速度（以培養15 d最大直徑Φ mm為指標）；通過100 mL液體培養基培養測定菌絲體生產量（以培養15 d所獲得的菌絲體干重為指標），研究不同碳源、氮源、無機鹽、維生素對菌絲體生長的影響。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1不同碳、氮源對黃綠蜜環菌菌絲生長的影響

在無碳源基礎培養基（硝酸銨0.3%、硫酸鎂0.3‰，氯化鈣0.15‰，磷酸二氫鉀0.3‰，硫酸亞鐵0.05‰，復合VB微量，蒸餾水，pH6.5）中，分別添加2%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、馬鈴薯作為碳源，連續培養15 d，測定菌絲體生長的直徑，然后將菌絲體用蒸餾水清洗干凈，洗去表面粘附的培養基，烘干，稱重，得菌絲體干重，考察不同碳源對菌絲生長的影響。

大學生在日常行為中會直接體現出學生對于社會主義核心價值觀的堅持。所以大學生的日常行為規范是實行核心價值觀的基礎前提。教師要引導學生在日常生活中規范自己的行為，只有這樣才能讓學生做到修身立德。比如學生在日常生活中可以做到與其它同學和睦相處，不要尋釁滋事，這就做到了核心價值中的“和諧”，又比如說教師可以引導學生時刻有一顆“法治”的心，在遇到打架、偷竊或者其它違法事件時要主動報案，讓法律來處理問題，不要選擇避讓無視〔6〕。

在無氮源基礎培養基（葡萄糖1.5%、硫酸鎂0.3‰，氯化鈣0.15‰，磷酸二氫鉀0.3‰，硫酸亞鐵0.05‰，復合VB微量，蒸餾水，pH6.5）中，分別添加0.4%的蛋白胨、10%黃豆芽浸提液、0.3%硝酸銨、0.2%硝酸鉀、0.2%氯化銨作為氮源，連續培養15 d，測定菌絲體生長的直徑，然后將菌絲體用蒸餾水清洗干凈，洗去表面粘附的培養基，烘干，稱重，得菌絲體干重，考察不同氮源對菌絲體生長的影響。

1.2.3.2無機鹽及維生素對黃綠蜜環菌菌絲生長的影響在沒有無機鹽及維生素的馬鈴薯葡萄糖培養基中（葡萄糖1.5%、硝酸銨0.3%、蒸餾水，pH6.5），分別加入0.3‰的硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅，以無礦質元素的馬鈴薯葡萄糖培養基為對照，連續培養15 d，測定菌絲體生長的直徑，然后將菌絲體用蒸餾水清洗干凈，洗去表面粘附的培養基，烘干，稱重，得菌絲體干重，考察無機鹽對菌絲生長的影響。

在培養基中，分別加入1 mg/L的VB1、VB2、VB6、VB1+ VB2（等比例）、復合VB，以不添加維生素為對照，連續培養15 d，測定菌絲體生長的直徑，然后將菌絲體用蒸餾水清洗干凈，洗去表面粘附的培養基，烘干，稱重，得菌絲體干重，考察維生素對菌絲生長的影響。

1.2.4黃綠蜜環菌培養條件優化根據單因素實驗結果，選取馬鈴薯為碳源；黃豆芽為氮源；KH2PO4+ MgSO4為無機鹽；VB1+VB2（等比例）為生長因子。按正交實驗設計，采用正交設計助手設計L9（34）正交表安排實驗，見表1，連續培養15 d，將菌絲體表面的培養基用蒸餾水清洗干凈，烘干，稱重，記錄菌絲體干重。

表1　黃綠蜜環菌培養條件優化因素水平表Table 1　Orthogonal factors and levels table of Armillarialuteo-rivens

1.2.5數據處理數據處理采用正交設計助手軟件。

2　結果與討論

2.1菌種分離與純化

來自不同地方的黃綠蜜環菌，其菌絲體在PDA培養基上生長長勢有顯著的差異，其中以海北分離到的黃綠蜜環菌菌株（AM-H）的長勢最好，黃南（AM-N）和玉樹（AM-Y）的次之，果洛分離的菌株（AM-G）最差，結果見表2。

表2　黃綠蜜環菌菌株形態特征Table 2　The morphological characteristics of Armillarialuteo-rivens strain

2.2.1不同碳、氮源對黃綠蜜環菌菌絲生長的影響黃綠蜜環菌菌絲體對碳源的利用以馬鈴薯最好，其他依次為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，可溶性淀粉最差。菌絲體對氮源的利用以黃豆芽最好，其他依次為硝酸銨、氯化銨、蛋白胨，硝酸鉀最低，結果見圖1、圖2。

2.2.2無機鹽及維生素對黃綠蜜環菌菌絲生長的影響單因素實驗結果表明：菌絲體對磷酸二氫鉀利用最好，其他依次為硫酸銅、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅。菌絲體對維生素的利用以VB1+VB2（等比例）最好，其次VB1、VB2、復合VB，對VB6的利用最差，結果見圖3、圖4。

圖1　不同碳源對菌絲體生長的影響Fig.1　The impacts of diverse carbon source on mycelium growth

圖2　不同氮源對菌絲體生長的影響Fig.2　The impacts of diverse nitrogen source on mycelium growth

圖3　無機鹽對菌絲體生長的影響Fig.3　The impacts of inorganic salt on mycelium growth

圖4　維生素對菌絲體生長的影響Fig.4　The impacts of vitamin on mycelium growth

2.3黃綠蜜環菌培養條件優化結果

由表3可見，對于黃綠蜜環菌菌絲生長的影響，碳源為A1＞A2＞A3、氮源為B1＞B2＞B3、無機鹽為C1＞C3＞C2、維生素為D1＞D2＞D3。結果表明：碳源對黃綠蜜環菌菌絲生長的影響最大，其他依次為氮源、維生素、無機鹽。黃綠蜜環菌菌絲培養最優化培養條件為A1B1C1D1，即馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L、蒸餾水1000 mL、pH6.5、培養溫度25℃。

表3　黃綠蜜環菌菌絲體培養條件正交實驗結果Table 3　The results of orthogonal experiment of Armillarialuteo-rivens mycelium

2.4驗證實驗

在最優培養條件下即：馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L、蒸餾水1000 mL、pH6.5、培養溫度25℃，培養黃綠蜜環菌，進行三批工藝驗證實驗，結果見表4，菌絲體平均收率為6.5 mg/mL。工藝驗證實驗表明以上工藝為最優化工藝。

表4　驗證實驗Table 4　The test of process validation

3　結論

本實驗在參考以往有關研究的基礎上，對黃綠蜜環菌人工培養所需的碳源、氮源、無機鹽、維生素、pH及培養溫度進行綜合研究，通過單因素實驗和正交實驗得到黃綠蜜環菌菌絲體培養的最優化條件為：馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L。本實驗為解決野生黃綠蜜環菌資源量問題提供了理論依據。但是本文以菌落的直徑大小和菌絲體干重作為考量菌種生長的指標，而對于菌絲體的化學組成及其品質評價未做探討。所以，下一步實驗有必要對黃綠蜜環菌人工培養的菌絲體與野生黃綠蜜環菌的化學成分、營養價值之間的差異進行深入研究。

［1］刁治民.青海草地黃綠蜜環菌生態學特性及營養價值研究［J］.中國食用菌，1997，16（4）：21-22.

［2］刁治民.黃綠蜜環菌生理特性的初步研究［J］.微生物學雜志，1997，17（1）：14-17.

［3］王啟蘭，姜文波，陳波.黃綠蜜環菌蘑菇圈生長對土壤及植物群落的影響［J］.生態學雜志，2005，24（3）：269-272.

［4］李世峰，陳桂琛，畢玉蓉.兩種野生食用菌抗氧化及抗腫瘤活性研究［J］.中國食用菌，2005，24（3）：58-63.

［5］黃年來.黃綠蜜環菌的分類地位和特征特性［J］.食用菌，1995，12（6）：11.

［6］柳煥章，王賀祥，劉慶紅，等.黃綠蜜環菌菌絲體培養條件初探［J］.中國食用菌，2007，26（4）：16-19.

［7］周連玉，朱莉莉，鄧旭武，等.黃蘑菇深層發酵條件研究［J］.湖南農業大學學報，2010，36（1）：110-112.

［8］魏永林.野生黃蘑菇人工栽培實驗初探［J］.青海氣象，2002，（2）：19～24.

［9］李渝珍.青海野生黃綠蜜環菌人工馴化技術途徑的探討［J］.青海師范大學學報，2005（1）：74-76.

Study on the separation and domestication of Armillarialuteo-rivens strain

SHI Qiang-qiang1，2，DANG Jun1，YUAN Xiang1，2，YUE Hui-lan1，WANG Qi-lan1
（1.Northwest Institute of Plateau Biology，CAS，Key Laboratory of Tibetan Medicine Research，CAS，Xining 810008，China；2.University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China）

With tissue-isolate method，the Armillaria luteo-rivens strain was isolated from the juncture between stipe and pileus of its fruit body.The purified strain was obtained after repeated purification.The strain as experimental material，the colony diameter and mycelia yield were taken as indexes to study the influence of mycelia growth by different carbon source，nitrogen source，inorganic salt，vitamin，and were carried out through the single factor test and orthogonal test.The result showed that the optimal culture condition of Armillarialuteorivens was potato 20%，extract of soybean sprouts 10%，KH2PO40.3‰，VB1+VB21 mg/L（proportion）.Under this culture condition，the mycelia yield was up to 6.5 mg/mL.

Armillaria luteo-rivens；strain separation；artificial domestication

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0180-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.029

2014－12－23

史強強（1989-），男，碩士研究生，研究方向：微生物天然產物化學，E-mail：shiqq89@126.com。

王啟蘭（1964-），女，副研究員，研究方向：微生物天然產物化學研究，E-mail：wql@nwipb.cas.cn。

青海省高新技術研究與發展計劃（2012-G-218）。