太空飛行對大腸桿菌生物學性狀影響的研究

張學林，謝　瓊，劉長庭*（.中國人民解放軍總醫院南樓呼吸科，北京00853；.中國航天員訓練中心醫監醫保研究室，北京00094）

太空飛行對大腸桿菌生物學性狀影響的研究

張學林1，謝瓊2，劉長庭1*
（1.中國人民解放軍總醫院南樓呼吸科，北京100853；2.中國航天員訓練中心醫監醫保研究室，北京100094）

為探討空間環境對大腸桿菌生物學性狀的影響，通過神舟十號飛船將大腸桿菌送至外太空（太空組），地面設立同步溫度對照組，返回后進行菌落計數，觀察太空飛行對細菌繁殖的影響；進行亞胺培南敏感性檢測，了解耐藥性變化；進行生長曲線測定，了解飛行后的生長速率。結果發現太空組細菌量為7.9×1010cfu/mL，對照組為28.5×1010cfu/mL；太空組平均抑菌圈直徑為15.57±1.2 mm；對照組為13.4±1.15 mm；兩組菌的生長曲線沒有明顯差異。研究表明大腸桿菌在太空飛行環境中生長受抑制，且對亞胺培南耐藥性降低。

大腸桿菌；太空飛行；亞胺培南；耐藥；生長

1　引言

隨著現代醫學的發展、各種有創檢查和介入治療手段的增加，以及抗生素的廣泛應用，使得導致臨床病原菌的種類及耐藥性都在發生變化，以往很少引起感染的條件致病菌（也稱機會性致病菌）如大腸埃希氏菌等所致的醫院內感染近年來顯著增加［1-4］。大腸桿菌所致的感染中以泌尿道感染、呼吸道感染、菌血癥等最為常見。近年來，隨著抗生素尤其是第三代頭孢菌素等抗菌藥物的大量使用，大腸桿菌中的產超廣譜β-內酰氨酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）菌株日益增多，并且在此基礎上還進一步出現了多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）菌株、廣泛耐藥（extensively drug-resistant，XDR）菌株和全耐藥（pandrug-resistant，PDR）菌株［4-6］。這些產ESBLs的高耐藥菌株不僅對青霉素類、頭孢菌素類抗生素耐藥，而且對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類抗生素存在嚴重的交叉耐藥。此外，它們還能通過接合等形式在同種或異種細菌間傳播耐藥基因，從而造成醫院嚴重的交叉感染，給臨床感染性疾病的治療帶來極大困難［7-8］。深入探尋這些高度耐藥菌株中新的耐藥機制，對于臨床合理制定針對耐藥菌的抗感染治療方案，以及迅速針對含新耐藥基因的可能引起廣泛傳播的耐藥菌株采取防控措施顯得尤為重要。

在載人航天活動中，一些正常定植的細菌會隨著航天員或航空部件進入太空，并在太空艙內形成微生物群區。據報道［9］，自和平號空間站升空15年來，該空間站內生長了234種微生物。一些機會性致病菌，如大腸桿菌曾在航天員身上或空間站中被檢出。因此載人航天事業對航天醫學與保障提出了重大挑戰。同時空間環境具有地面環境中所不存在的一些特殊環境因素，包括微重力、高真空、極度溫差、弱磁場和粒子輻射等，這些因素可加速誘導空間環境微生物產生基因突變和調控網絡的變化，進而對微生物的生物學性狀和功能產生一系列復雜的影響。2006年在亞特蘭蒂斯號航天器進行的空間實驗發現，用航天器搭載的沙門氏菌感染小鼠，實驗組較地面對照組相比，小鼠的死亡時間提前，死亡率增高，半數致死劑量（LD50）降低［10］。經空間飛行后，肺炎克雷伯菌對磺胺類藥物的耐藥性發生明顯改變［11］，而空間站來源的金黃色葡萄球菌對苯唑西林、紅霉素和氯霉素的最低抑菌濃度有一定的增加［12］。另有研究發現，蠟狀芽孢桿菌在碳源利用上發生了明顯改變［13］。因此，探索空間環境下微生物變異對于載人航天事業的發展具有重要的意義。

本研究借助神舟十號飛船，將一株從肺部感染老年患者痰標本中分離的大腸桿菌送入太空（飛船的升空時間為2013年6月11日，返回地球時間為2013年6月26日），觀察該菌太空飛行前后的耐藥性等表型的變化，探索太空環境對大腸桿菌的影響，為人類如何利用太空環境進行感染性疾病的防控研究提供理論基礎。

2　材料和方法

2.1菌株與培養

大腸桿菌為肺部感染老年患者痰標本的分離培養菌，并經解放軍總醫院微生物科采用bioMérieux-Vitek系統鑒定。細菌置于腦心浸液半固體培養基中培養，其配方為腦心浸液肉湯（BHI）+0.6%低熔點瓊脂糖（Invitrogen）。細菌分為以下兩組：太空組，細菌隨神舟十號飛船進入太空飛行15天（樣品裝載飛船約2天后發射升空），艙內溫度為21℃；地面對照組，細菌置于21℃孵箱中靜止培養15天。抗生素敏感試驗以及生長曲線測定等培養溫度為37℃。

2.2抗生素敏感實驗

將菌株接種至MH肉湯培養基，37℃，180～200 rpm振蕩培養7～8 h后，調整菌懸液濃度至0.5麥氏單位，此時相當于細菌濃度達到108CFU/mL，將菌液用棉簽均勻涂布至MH固體平板表面；室溫放置3～5min，將藥敏紙片貼至平板上，37℃靜止培養16 h，游標卡尺量取抑菌環直徑大小。

2.3細菌菌落總數檢測

菌株從太空返回地面后，立即對實驗組和對照組樣本進行梯度稀釋（101，102，103，104，105，106，107，108，109倍）并涂布平板，培養16 h后，挑取平板菌落數在30～300之間的平板進行平板克隆計數，比較兩組菌的菌落數。該實驗重復3次。

2.4生長曲線測定

細菌置于含500 mL腦心浸液肉湯的三角燒瓶中，37℃振蕩培養，培養0.5 h，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，14 h，16 h后，分別取1 m l混懸液用分光光度計（Thermo，USA）測定波長在600 nm處的吸光度值，并以純腦心浸液肉湯調零，實驗重復3次。

2.5統計分析

采用SPSS17.0軟件進行數據處理，計量數據以x±s表示，兩組獨立樣本采用t檢驗，當P＜0.05時認為差異具有統計學意義。

3　結果

3.1太空飛行前后大腸桿菌耐藥性檢測

細菌從患者痰液中分離培養后，首先進行身份鑒定及耐藥性檢測，藥物敏感試驗結果按照美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標準進行判讀［14］，發現該菌對抗生素亞胺培南耐藥，如圖1所示。太空組細菌返回地面后，將太空飛行組和地面靜止培養組各隨機挑取100個克隆，分別進行抗生素敏感試驗，測量亞胺培南對大腸桿菌的抑菌圈直徑，如表1所示，地面對照組的平均抑菌圈直徑為13.4±1.15 mm；太空飛行組的平均抑菌圈直徑為15.57±1.2mm，較對照組增加了2.17mm（p＜0.05）。說明太空飛行后大腸桿菌對亞胺培南呈現變敏感的趨勢。

圖1　亞胺培南對分離的大腸桿菌抑菌效果Fig.1 Inhibition zone of Im ipenem in disc diffusion test for Escherichia coli

注：大腸桿菌臨床分離純化后進行藥物敏感性試驗，亞胺培南的抑菌環直徑點13.5 mm；根據2013年CLSI標準，含10 mg亞胺培南的藥物制片對大腸桿菌的抑菌圈直徑d＜19 mm可判定為該菌對亞胺培南耐藥。

表1　亞胺培南對地面組和太空組大腸桿菌的抑菌環直徑統計結果Table 1 Inhibition diameters of Im ipenem in disc diffusion test for two groups of Escherichia coli

3.2太空飛行后大腸桿菌菌落數降低

為了解太空環境對大腸桿菌生長的影響，在太空組細菌返回地面后，立即進行梯度稀釋并平板計數，結果顯示該菌地面組的菌落數為（28.5±4.3）×1010cfu/mL；太空組的菌落數為（7.9±2.5）×1010cfu/mL（如圖2所示）。太空環境下大腸桿菌的菌落總數為地面組的27.7%。說明太空飛行環境中大腸桿菌生長繁殖變緩慢。

圖2　太空飛行后大腸桿菌菌落數和地面對照組的比較Fig.2 Escherichia coli after space flight and that of the ground control

3.3太空飛行前后細菌生長速率比較

為更進一步說明太空因素對大腸桿菌生長的影響，我們將地面組和太空組大腸桿菌取等量樣本用于生長曲線測定，在細菌培養0.5 h，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，14 h，16 h這10個時間點，對菌懸液進行OD600值檢測，并繪制生長曲線，我們發現兩組大腸桿菌的生長速率無明顯改變（圖3）。

圖3　地面組和天上組大腸桿菌生長曲線比較Fig.3 Escherichia coli in space fligh t and ground control groups

4　討論

太空環境存在著極端的物理條件，通常，這些影響都不利于微生物的生存和生長［15-16］。有研究顯示，飛船內的微生物較地面生長緩慢［17］。說明太空環境對細菌的生存和生長是一個嚴峻的考驗。本研究中發現經太空飛行后，大腸桿菌的繁殖量僅為地面的27.7%，考慮是太空環境因素下大腸桿菌產生過多的次級代謝產物抑制細菌生長繁殖。但是兩組菌的生長曲線沒有明顯差異，一方面是由于細菌菌落計數反應的是樣本在飛行剛剛結束時的繁殖狀態，而生長曲線反應的是大腸桿菌返回后經地面培養的狀態，細菌在地面經加入大量培養基培養，太空中所產生的次級代謝產物被稀釋，大大減弱了其抑制生長繁殖的作用；另一方面考慮是由于本次飛行任務時間較短，細菌產生的變異遺傳穩定性差，以至大腸桿菌脫離太空環境后迅速發生突變回復，也說明了短暫的太空飛行對生命體產生的影響具有可回復性。

當面對惡劣的環境，細菌通過不斷改變自身形式來適應環境的變化，在此過程中，細菌的變異過程會加速，變異類型也會更豐富。多項研究表明微重力環境可影響大腸桿菌的耐藥性。通過對禮炮7空間站上法國航天員Chrien JL的共生菌叢中分離出的大腸桿菌的研究發現，與地面對照菌相比，空間站來源的大腸桿菌對多粘菌素E和卡那霉素的最低抑菌濃度顯著增加（從4 mg/L到＞16 mg/L），即該菌的耐藥性增加［18］。另有研究發現，從聯盟-7號飛船飛行員中分離出的大腸桿菌出現了四環素耐藥性［19］。而本研究的結果為大腸桿菌對亞胺培南耐藥性降低，與前述報道的太空環境對細菌耐藥性的影響并不一致，說明太空環境對細菌產生的耐藥性變異具有多樣性，并非所有的細菌在微重力條件下對抗生素敏感性的變化都是一致的，如研究發現鮑曼不動桿菌在低剪切力模擬微重力的環境中對多種抗生素的最低抑菌濃度沒有明顯的升高［20］。

在本研究中，太空飛行后的大腸桿菌對亞胺培南仍處于耐藥性狀態，但是相對地面培養的大腸桿菌，其對亞胺培南的耐藥性具有降低的趨勢。通過進一步探索其影響耐藥性的機理，有望為解決地面難以控制的感染問題提供理論基礎。同時在人體中大腸桿菌主要定植在腸道內，屬于腸道微生物的一部分，該菌能產生具有殺菌作用的大腸桿菌素，還能合成維生素B和K，在正常情況下其代謝活動對人體有益。本研究發現在太空環境中大腸桿菌生長繁殖受到抑制，這種改變對人體的影響目前還不清楚，在未來的研究中，探索太空飛行對腸道微生物的影響，以及腸道微生物的變化將如何影響航天員健康將是一個重要的課題。

5　結論

1）太空飛行過程中大腸桿菌生長較地面緩慢，說明太空飛行環境不利于大腸桿菌生長；

2）太空飛行后，大腸桿菌對亞胺培南的耐藥性降低。

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Effects of Space Flight on Biological Characteristics of Escherichia Coli

ZHANG Xuelin1，XIE Qiong2，LIU Changting1*
（1.Nanlou respiratory disease department，The 301 hospital，Beijing 100853，China；2.Department ofmedicalmonitoring and medical support，China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094，China）

Tomanifest the effect of space flight on biological characteristic in Escherichia coli，the strain was carried to space by Shenzhou-10 spaceship.The colony forming units（CFU）in both the space flight and ground cultured E.coliwere assessed by plate clone count respectively to calculate the survival rate of space flight E.colisample.Antibiotics sensitivity for space flightand ground cultured E.coliwas analyzed to compare the sensitivity to imipenem.Then the growth curves of the two strains weremeasured.The results show that，after space flight，the CFU of E.coliwas 7.9×1010cfu/mL，while itwas28.5×1010cfu/mL in ground cultured E.coli.The average inhibition zone of imipenem for ground cultured E.coliwas13.4±1.15 mm in diameter，while that of the space flight gruop was 15.57±1.2 mm in diameter.However，the growth curves of the two strains had no significant difference.All data revealed that the growth of E.coliwas inhibited in space flightenvironment，and it could become less resistant to imipenem after space flight.

Escherichia coli；space flight；imipenem；resistant；growth

R856

A

1674-5825（2015）02-0200-04

2014-09-23；

2015-03-05

國家重點基礎研究發展計劃資助（973計劃）（2014CB744400）；全軍醫學科研“十二五”課題重點項目（BWS12J046）；科技部重大專項項目（空間新藥重大創制）（2015ZX09J15102-003）；北京市科技新星項目（z121107002512128）

張學林（1982-），男，博士，主治醫師，研究方向為細菌耐藥及空間微生物學。E-mail：zhangxl20015@163.com

并列第一作者：謝瓊（1971-），女，博士，研究員，研究方向為航天實施醫學。E-mail：xieqio@sina.com

劉長庭（1954-），男，碩士，教授，研究方向為空間生命科學。E-mail：changtingliu@sohu.com