具有拮抗膠孢炭疽菌活性酵母菌的分離和篩選

羅姍姍，王潤菡，萬　斌，邵遠志

（海南大學食品學院，海南海口570228）

具有拮抗膠孢炭疽菌活性酵母菌的分離和篩選

羅姍姍，王潤菡，萬斌，邵遠志*

（海南大學食品學院，海南?？?70228）

從芒果果皮、葉片和芒果園土壤中分離篩選得到具有拮抗膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）活性的酵母菌，研究其對芒果中膠孢炭疽菌的抑制作用。采用平板對峙法和活體實驗進行篩選，采用形態學及rDNA-ITS序列分析等方法進行鑒定。通過平板對峙和活體實驗篩選發現，菌株T18對芒果炭疽病病原菌膠孢炭疽菌的拮抗作用明顯。抑菌實驗表明，當T18菌懸液濃度為1×108cfu/mL時，對膠孢炭疽菌的抑菌半徑為14.33mm。活體實驗中，經T18處理的芒果果實炭疽病病斑直徑僅為1.58mm，具有較強抑菌效果。通過菌落和菌體形態、生理生化、ITS序列分析對菌株T18進行鑒定，最終確定為尼泊爾德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis）。

膠孢炭疽菌，酵母菌，篩選，鑒定

芒果（Mangifera indica.L）又稱檬果，是熱帶和亞熱帶地區非常重要的水果。芒果營養豐富，并以其美觀的果形、鮮美的色澤、香甜的果肉、芳香的氣味而聞名于世，素有“熱帶水果之王”的美譽。但芒果果實貯藏較為困難，其中炭疽病是芒果采后貯藏運輸過程中的主要病害，引起的芒果腐爛損失可達20%～30%［1］。長期以來，炭疽病的防治主要依賴使用化學殺菌劑［2］，然而多菌靈、苯來特和甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的長期大量使用，導致炭疽病主要致病菌膠孢炭疽菌對該類殺菌劑產生了抗藥性，使得防效下降。近年來，隨著人們對環境保護和食品安全越來越重視，研發更加安全、環保的芒果炭疽病防治新技術（如生物防治），顯得更加迫切［3-4］。在生防菌中，由于酵母具有抗逆性強、能在營養貧瘠的條件下生長、繁殖快速、不產生抗生素、受殺蟲劑影響較小等優點，逐漸成為研究的熱點［5-7］。以拮抗酵母菌制成的生物制劑取代化學菌劑也將成為果蔬保鮮綠色環保防治措施的必然趨勢。

目前已報道的拮抗酵母菌有10余種，包括季也蒙畢赤酵母［8］、漢遜德巴利酵母、瓦爾維亞假絲酵母［9］等，主要用于防治果蔬貯藏時期的青霉病、綠霉病、灰霉病及其他腐爛病。此外，研究發現，多數拮抗酵母菌分離于健康芒果果皮表面或果實傷口處。為此，本研究從海南不同品種的芒果果皮、葉片以及不同地區芒果園土壤中分離篩選對膠孢炭疽菌具有拮抗作用的酵母菌，為進一步應用酵母菌防治芒果炭疽病奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

芒果果實摘自海南三亞芒果園，品種分別為紅貴妃、雞蛋芒、臺農、象牙芒、澳芒、凱特芒、呂宋芒、金煌芒、紅玉芒、蘋果芒；土壤、葉片均取自海南三亞昌江芒果園；酵母膏、細菌學蛋白胨、細菌學瓊脂粉分析純，廣東環凱微生物科技有限公司；無水葡萄糖分析純，國藥集團化學試劑有限公司；EX Taq酶、dNTP、100 bp DNA Ladder（Dye Plus） TaKaRa；引物（ITS1：5’-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3、ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 上海生工生物工程技術服務有限公司；Marker II（MD102） 天根生化科技（北京）有限公司。

AL-204電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZEALWAYGR60DA高壓滅菌器廈門致微儀器有限公司；LRH-150B生化培養箱廣東省醫療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺蘇州尚田潔凈技術有限公司；BHWV-200變頻搖床寧波海曙賽福實驗儀器廠；Nikon ECLIPSE Ci-s/Ci-L顯微鏡南京衡橋儀器有限公司；101-2型電熱鼓風干燥箱常州市華普達教學儀器有限公司；A200基因擴增儀杭州朗基科學儀器有限公司；TG16KR臺式高速冷凍離心機長沙東旺實驗儀器有限公司；RDY-SP1Z核酸電泳儀北京容陽經典科技有限公司；JY04S-3C凝膠成像系統北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的分離純化為擴大酵母菌種資源，對海南地區不同品種的芒果果實及其葉片、土壤中的菌種進行分離篩選。采用稀釋平板法和平板劃線法多次分離、純化酵母菌和芒果炭疽病原菌，直至獲得純培養物［10-11］。

1.2.2病原菌的鑒定及致病性檢測參照《真菌鑒定手冊》，同時采用rDNA-ITS序列分析（引物ITS1：5’-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3’、引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對芒果炭疽病原菌進行鑒定，確定病原菌種類。

1.2.3離體防效實驗在平板上對分離純化的酵母菌和芒果炭疽菌進行對峙培養［12］。測量抑菌帶寬，每個測量重復4次，計算平均值。

1.2.4活體防效實驗參考Lima等［13］的方法：用接種針在果實腰部制造一個4mm（深）×3mm（寬）的傷口，室溫下干燥1h，分別接種離體復篩抑菌效果較好、濃度為1×108cfu/mL的酵母懸浮液20μL，4h后接種20μL濃度為1×106個/mL的炭疽菌孢子懸浮液。設無菌水（只加入40μL無菌水）和CK（20μL無菌水+ 20μL C.gloeosporioides菌液）兩種對照，室溫曬干后，于28℃高濕條件下培養。分別于接種第6d和12d觀察各處理果實的病斑直徑及其發病率，每個測量重復4次，計算平均值，篩選出拮抗效果最好且穩定的酵母菌。

1.2.5酵母菌的鑒定菌體形態特征觀察參照沈萍等［14］的方法，采用美蘭浸片染色法，生理生化特征按照《酵母菌的特征與鑒定手冊》進行［15］。同時采用rDNA-ITS序列分析（引物ITS1：5’-TCCGATGGTGAA CCTGCGG-3’、引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’）對酵母菌進行分子生物學鑒定。

1.2.6數據分析實驗中所有數據采用SPSS Statistics 19.0統計分析軟件進行處理，采用ANOVA進行Duncan多重差異分析。

2　結果與分析

2.1酵母菌的分離、篩選

本研究從不同品種芒果表皮分離純化酵母菌192株，土壤分離97株，葉片分離70株，共分離359株（圖1），其中從芒果果皮病健交界處分離到的菌株最多，占總分離酵母數的33.70%。不同品種的芒果分離結果也有所差異，其中從呂宋芒、象牙芒、凱特芒處分離的酵母最多，分別為74、55、29株，占總分離酵母菌數的20.61%、15.32%、8.07%。所有酵母菌接種于試管斜面，4℃保藏。

圖1　酵母菌菌株培養形態Fig.1　The colony morphology of yeasts

2.2炭疽病原菌的鑒定及致病性檢測結果

2.2.1炭疽病原菌的形態特征觀察結果菌落近圓形，邊緣整齊。氣生菌絲白色至灰白色，漸變為深灰色，絮狀或絨狀（圖2A）。分生孢子圓筒形或長橢圓形，有些一端稍尖，單胞無色，有油球（圖2B）。在PDA培養基上，多數菌株在后期能產生橘紅色或黑色的分生孢子堆，分生孢子梗短小，單枝，分生孢子圓柱形、橢圓形或卵圓形，單孢，近中部有一油球。

圖2　膠孢炭疽菌菌落形態（A）和菌體形態（B）Fig.2　Photographs of colonies（A）and cells（B）of the C.gloeosporioides

2.2.2病原菌的致病性檢測依據柯赫氏法則，從病果的病健交界處分離的芒果炭疽病原菌，在PDA培養基上分離純化，獲得炭疽病原菌純培養；再將純培養菌株接種到健康的芒果果實上，出現了相同癥狀的病害；從接種發病的芒果果實上再分離得到的純培養，性狀與接種物相同。

2.2.3炭疽病原菌的rDNA-ITS序列分析結果由圖3并結合rDNA-ITS序列分析結果可知，該病原菌的ITS序列全長為576bp，在GenBank數據庫中進行Blast同源性分析，結果表明菌株與Colletotrichum gloeosporioides的同源性為100%（EU149938）。綜合以上各項實驗結果，可以鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌。

圖3　病原菌的rDNA-ITS電泳圖譜Fig.3　PCR amplification of rDNA-ITS sequence of the pathogen

2.3平板對峙法拮抗酵母菌篩選結果

通過平板對峙法初篩，共篩選出對膠孢炭疽菌有拮抗作用的酵母菌67株，占總分離酵母菌株的18.66%。再經過平板對峙法復篩，從67株拮抗膠孢炭疽菌的酵母菌中共篩選出21株抑菌圈較明顯的酵母菌，菌種名稱及其抑菌帶寬見表1。其中從呂宋芒果果皮分離到的拮抗膠孢炭疽菌的酵母菌最多，為7株，占21株酵母菌的33.33%，從象牙芒、紅貴妃、表金煌芒和凱特芒果皮表面分離得到有效拮抗酵母菌株數依次為6、5、2、1，分別占其總數的28.57%、23.81%、9.52%和4.77%。再次復篩得到4株酵母菌，由表1可知，F1-3、T18、T21、LA-4這4株酵母菌對膠孢炭疽菌的拮抗作用較明顯，抑菌帶寬分別為14.90、14.33、12.45、12.45mm（圖4）。

表1　拮抗膠孢炭疽菌的酵母菌離體復篩結果Table 1　Results of in vitro inhibition of C.gloeosporioides by yeasts

圖4　拮抗酵母菌在PDA平板上對膠孢炭疽菌的抑菌效果Fig.4　Antagonistic action of yeast strains on C.gloeosporioides in PDA medium

2.4拮抗酵母菌活體篩選結果

將復篩得到的21株酵母菌與膠孢炭疽菌（各20μL）共同接種到芒果果實傷口處，于28℃高濕條件下培養后發現，經菌株T18處理的芒果果實炭疽病病斑直徑為1.58mm，顯著（p＜0.05）低于CK的13.11mm。菌株F1-3、LA-4、T21接種到果實上基本沒有表現出抑菌效果，其果實病斑直徑分別為11.31、10.97和12.91mm，與CK的差異不顯著（p≥0.05）。

圖5　酵母菌T18、T21、LA-4、F1-3的活體篩選結果Fig.5　Results of in vivo test of T18、T21、LA-4 and F1-3

2.5拮抗膠孢炭疽菌酵母菌的形態特征觀察結果

平板菌落奶白色，不透明，表面光滑且粘稠，邊緣光滑，反光，有發酵的香氣（圖6A）。麥芽汁液體培養基中25℃培養三天，菌體呈橢圓形，芽殖，未觀察到假菌絲（圖6B）。

圖6　酵母菌T18菌落形態（A）和細胞形態（B）Fig.6　Photographs of colonies（A）and cells（B）of T18

2.6拮抗酵母菌的生理生化特征

對菌株T18進行了生理生化實驗，包括糖類發酵實驗、碳源同化實驗、氮源同化實驗，結果如表2所示。

表2　酵母菌T18的生理生化鑒定結果Table 2　Result of biochemical and physiological identification of T18

2.7拮抗膠孢炭疽菌酵母菌的ITS序列分析結果

PCR擴增結果顯示（圖7），擴增得到的序列大小約647bp。將擴增得到的產物進行測序，所測得序列經過與GenBank數據庫中的已有序列進行Blast分析后發現，菌株T18與GenBank中Debaryomyces nepalensis的rDNA-ITS序列相似性為99%（JN942654）。根據同源性比較結果，可以初步確定菌株T18為尼泊爾德巴利酵母（D.nepalensis）。

綜合形態學觀察、生理生化測定和ITS序列分析結果，酵母菌T18被鑒定為尼泊爾德巴利酵母（D. nepalensis）。

圖7　酵母菌T18的rDNA-ITS電泳圖譜Fig.7　PCR amplification of rDNA-ITS sequence of T18

3　結論

本研究從土壤中分離篩選出的T18菌株在離體防效實驗和活體防效實驗對芒果膠孢炭疽菌都具有明顯的拮抗效果。通過形態學、生理生化實驗和分子生物學相結合的方法對該菌株進行鑒定，鑒定為尼泊爾德巴利酵母。目前尚無從芒果果實、葉片和芒果園土壤中分離出尼泊爾德巴利酵母和關于該菌應用于芒果采后炭疽病防治的報道。有研究已從不同來源的酵母菌中分離到揮發性產物、病程蛋白、抗菌肽等多種不同的抗菌物質，今后的研究可以集中在探索尼泊爾德巴利酵母的拮抗機理和增加拮抗效力的方法上。本研究首次證明尼泊爾德巴利酵母對芒果采后炭疽病具有生防效果，擴大了拮抗酵母菌的來源，為以后開展芒果采后炭疽病的生物防治具有重大的指導意義。

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Isolation and screening of antagonism yeast against mango Colletotrichum gloeosporioides

LUO Shan-shan，WANG Run-han，WAN Bin，SHAO Yuan-zhi*
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China）

Isolation and screening of antagonism yeast against Colletotrichum gloeosporioides from peel，leaf and soil of mango fruits，and investigation of antagonistic effect of isolated yeast against C.gloeosporioides. Yeast was screened out through confront culture method and in vivo test，and identified by phenotypic and genotypic characteristics.The yeast strain T18 showed highest and most stable antagonistic effect.Results showed that inhibition zone diameter of T18 was 14.33mm at concentration of 1.0×108cfu/mL，with strong in vivo antagonistic effect of lesion diameter of 1.58mm.The strain T18 isolated from soil was identified by colony and cell morphology，biological and biochemical characteristics，and ITS sequence，and was identified as Debaryomyces nepalensis.

Colletotrichum gloeosporioides；yeast；screening；identification

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0216-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.036

2014-10-31

羅姍姍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：果蔬保鮮與貯藏。

邵遠志（1969-），男，本科，副教授，研究方向：果蔬保鮮與貯藏。

農業部南亞熱作項目（14RZNJ-59）；海南省重大科技專項（ZDZX-2013011）。