食用菌拮抗反應的定量分析

劉 昆 宋小亞 蔣 俊 路新彥

（麗水農業(yè)科學研究院，浙江 麗水 323000）

食用菌拮抗反應的定量分析

劉 昆 宋小亞 蔣 俊 路新彥

（麗水農業(yè)科學研究院，浙江 麗水 323000）

應用Photoshop軟件對拮抗反應中的菌絲生長面積進行量化分析。試驗采用18個香菇菌株，經對各菌株菌絲培養(yǎng)，測量相對生長面積，計算對照菌株L808對其他17個菌株的拮抗系數(shù)。以拮抗系數(shù)為依據(jù)，判別各參試菌株的拮抗能力，拮抗系數(shù)越大，其拮抗能力越強。此可作為食用菌菌種鑒別新的量化指標參數(shù)。

Photoshop；拮抗反應；香菇

擔子菌中的拮抗現(xiàn)象（antagonism）是由多基因控制的異源不親合反應。控制兩個菌株雙核菌絲體不親合性的多個基因位點只要有一處不同，菌絲體相互接觸時不親合反應就會發(fā)生，并會在接觸區(qū)出現(xiàn)色素，菌絲隆起和菌絲稀疏等［1］。因拮抗反應的試驗操作簡單，結果也比較容易辨別，常被用于食用菌的菌種鑒別研究。但以往的研究多關注拮抗線部位的形態(tài)特征，而未對菌絲生長面積的大小做過探討。

隨著科技的進步，數(shù)字化圖像處理和分析技術在多個行業(yè)中被廣泛應用。Photoshop軟件因其圖像處理功能強大常被科研工作者應用。利用軟件中直方圖分析不規(guī)則形狀面積的方法在林業(yè)遙感測量、醫(yī)療中瘢痕計算、植物病斑面積計算等工作中發(fā)揮了重要功能［2～4］。本文在他人的研究基礎上，介紹一種應用Photoshop軟件對拮抗反應中菌絲生長面積進行量化分析的方法。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

18個香菇菌株，分別為L808、L868、L135、L9015、L939、L241-4、慶科20、武香1號、蘇香1號、申香1號、申香2號、申香8號、申香10號、申93、L26、Cr04、Cr66和Cr33，均由麗水市農業(yè)科學研究院大型真菌種質資源庫提供。

Adobe Photoshop CS6 簡體中文試用版由Adobe公司的中文主頁下載而得。

1.2 試驗方法

（1）菌絲的培養(yǎng)。培養(yǎng)基量為每皿20 mL，在培養(yǎng)皿底部（直徑90 mm，下同）平面上，距圓心15 mm處分別作直徑為5 mm的圓，滅菌備用。將供試菌株轉接至PDA試管中，25 ℃黑暗條件下活化培養(yǎng)。試管長滿菌絲后，將菌株接種至PDA平板的中央，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。

當菌絲長至培養(yǎng)皿的2/3面積時，用直徑5 mm的打孔器在菌絲邊緣打孔，取菌絲塊。分別將L808與其他17個菌株的菌絲塊接種到上述備用培養(yǎng)皿圓中，于25 ℃黑暗下對峙培養(yǎng)。當兩菌株菌絲相互接觸后，在光下培養(yǎng)5～7天。培養(yǎng)結束后，對每個培養(yǎng)皿在相同的拍攝參數(shù)上進行正反面拍照。

（2）菌絲相對生長面積的測量。用Photoshop軟件打開培養(yǎng)皿背面的拮抗照片。菜單欄中選擇“圖像—調整—曲線”，打開曲線調整對話框，向下調整曲線中間調（圖1），提高菌絲與背景之間及拮抗線自身的清晰度。工具欄中選取“磁性套索工具”，羽化值設為3，沿拮抗線和培養(yǎng)皿的邊緣選取一個菌株的菌絲覆蓋處。菜單欄中選擇“窗口—直方圖”調出直方圖對話框（圖2），記錄其中的像素數(shù)，記做P1。同樣的方法測量整個培養(yǎng)皿底部的像素數(shù)，記做P2。

圖1 曲線調整對話框

圖2 從直方圖中讀取整個培養(yǎng)皿的像素信息

（3）相對生長面積的計算。試驗原理參照參考文獻［4］，方法略有修改。數(shù)碼照片的分辨率是單位長度上容納像素的數(shù)量。通常所講72像素的分辨率指1英寸長度的位置上包含72個像素，即1平方英寸面積上含有72×72=5 184個像素。因此數(shù)碼照片中的實際面積S可以用其所包含的像素數(shù)P除以分辨率R得到。拮抗反應試驗同一照片（分辨率R相同）中兩不同菌絲覆蓋面積的比值A（以下稱為拮抗系數(shù)）可用下列公式求得：

S1表示測試菌株的菌絲生長面積；S2表示對照菌株的菌絲生長面積；P1表示測試菌株菌絲所覆蓋培養(yǎng)皿的像素數(shù)；P2表示整個培養(yǎng)皿的像素數(shù)，R表示分辨率。

2 結果與分析

2.1 圖片的選用

拮抗反應試驗中L808與大部分菌株均有明顯的拮抗反應，培養(yǎng)皿中不同的菌株以拮抗線為分界線形成了2個區(qū)域，界限明顯，方便軟件進行測量。但也有部分菌株，從培養(yǎng)皿正面觀察不易分清兩者菌絲的生長邊界，而培養(yǎng)皿背面則非常容易將兩者區(qū)分開（圖3）。同時因拮抗時所用的菌株菌絲一般均為同一顏色，而且某些菌株因其特性會形成色素、菌絲球和菌落不均勻等現(xiàn)象，會干擾軟件的測量。因此測量數(shù)據(jù)時，以培養(yǎng)皿背面的圖片為好。

圖3 L808與L135的拮抗反應試驗正面（左）與背面（右）

圖4 L808對其他菌株的拮抗系數(shù)曲線

試驗中的數(shù)據(jù)以照片中的像素數(shù)為基礎，因此在拍照時，圖片的參數(shù)要統(tǒng)一標準。

2.2 拮抗能力分析

根據(jù)L808對其他17個菌株拮抗系數(shù)的分析結果（圖4），拮抗系數(shù)曲線呈明顯的上升趨勢。隨著拮抗系數(shù)的增加，L808對其他菌株的拮抗能力依次增強，其中對L868的拮抗能力最弱，對L135的拮抗能力最強。

根據(jù)統(tǒng)計分析結果（表1），按照顯著性差異大小，可將17個試驗菌株分成7組：L868、Cr04、L26、申香1號4個菌株為第1組；申香8號、Cr33、武香1號、L939、蘇香1號、申香2號、申93共7個菌株為第2組；申香10號、Cr66為第3組；L241-4、L9015、慶科20、L135分別單獨成為第4、第5、第6、第7組。

L808與第一組菌株之間的拮抗系數(shù)小于1，說明其菌絲對組中菌株的拮抗能力較弱；L808與第2組菌株間的拮抗系數(shù)接近于1，說明其菌絲對組中菌株的拮抗能力相當；L808與第3組的拮抗系數(shù)均超過了1但小于1.3，說明其菌絲對被測菌株的拮抗能力較強；L808與第4、第5、第6、第7組的拮抗系數(shù)均超過了1.3，甚至接近2，說明其菌絲對被測菌株的拮抗能力非常強。由此可見，拮抗系數(shù)可有效地分析出L808對不同菌株拮抗能力的大小。

表1 L808對不同菌株的拮抗系數(shù)

3 討 論

在藥物的抑菌試驗中，常通過抑菌圈的大小來判斷藥物的抑菌效應。其操作是將供試菌涂布于整個培養(yǎng)皿中，在其上接種待測藥物。抑菌圈一般是規(guī)則的圓形，只需要測定圓的直徑便可測量出抑菌能力大小。而食用菌的拮抗反應試驗一般是兩個菌株或多個菌株近距離的對峙培養(yǎng)，其菌絲生長速度快，在出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象時，菌絲已經布滿培養(yǎng)皿，形成兩個或多個不規(guī)則的扇形區(qū)，手工不易準確測量其面積的大小。本文結合藥物抑菌實驗的原理，應用Photoshop軟件的直方圖像素信息，實現(xiàn)對食用菌拮抗反應中菌絲相對生長面積的測量。

以往利用拮抗反應鑒別菌種過程中，會出現(xiàn)因拮抗反應現(xiàn)象不明顯、試驗操作不規(guī)范和各人觀察角度不同，導致試驗結論有誤差，影響鑒別結果的準確性。本研究通過用電腦軟件測量菌絲生長面積的方法，實現(xiàn)對不同菌株間的拮抗能力鑒別，輔助拮抗反應最終結果的判定，增加拮抗試驗的準確性。當兩菌株之間無明顯的拮抗反應，而拮抗系數(shù)明顯小于或大于1時，則表示兩菌株有差異的概率明顯提高。

通過比較新品種與對照菌種的拮抗系數(shù)，可實現(xiàn)對其生長勢的判斷。測量新品種與對照菌之間拮抗系數(shù)的大小，還可判斷其抑菌能力。因此，拮抗系數(shù)可在食用菌育種試驗中作為一種新的量化指標應用。

［1］ 沈學香， 尚曉冬， 汪虹， 等. 十株香菇菌株間的營養(yǎng)體不親合性［J］. 食用菌學報， 2008， 13（2）: 1-5.

［2］ 王新， 楊書濤. Photoshop在林業(yè)工作中計算面積的方法和應用［J］. 林業(yè)科學， 2012， 11: 60.

［3］ 周洲， 張軍鋒， 陳建， 等. Photohshop軟件在免疫組化圖像分析中的應用［J］. 安徽農業(yè)科學， 2012， 40（24）: 11963-11965.

［4］ 崔華威， 楊艷麗， 黎敬濤， 等. 一種基于Photoshop的葉片相對病斑面積快速測定方法［J］. 安徽農業(yè)科學， 2009，37（22）: 10760-10762， 10805.

S646

A

2095-0934（2015）06-364-03

麗水市科技計劃項目（2012JYZB26）

劉昆（1984—），男，助理研究員，碩士研究生，主要從事食用菌菌種質量檢測工作。E-mail：tjliukun@126.com