蛹蟲草原生質體60CO輻射誘變選育高產多糖菌株的實驗

石小峰沈福良張 強于園園張作法呂國英*

（1. 嘉興市潛福食品有限公司，浙江 嘉興314050；2. 嘉興市潛鑫食品有限公司，浙江 嘉興314050；3. 浙江省農業科學院園藝研究所，杭州 310021）

蛹蟲草原生質體60CO輻射誘變選育高產多糖菌株的實驗

石小峰1沈福良1張 強2于園園2張作法3呂國英3*

（1. 嘉興市潛福食品有限公司，浙江 嘉興314050；2. 嘉興市潛鑫食品有限公司，浙江 嘉興314050；3. 浙江省農業科學院園藝研究所，杭州 310021）

蛹蟲草；原生質體；輻射誘變；多糖

蛹蟲草Codyceps militaris （L.） Link，又稱北冬蟲夏草，是蟲草的模式菌種。蛹蟲草的功效成分和藥效，與野生冬蟲夏草相似［1，2］，可以作為野生冬蟲夏草的有效替代品。蛹蟲草含有多種活性物質，具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗感染等多種藥理活性。蟲草多糖是一類高分子復合物，為蟲草的主要活性成分之一，是蟲草中含量最高的藥理活性物質［3］。蟲草多糖主要存在于菌絲體中，研究提高菌絲體中多糖含量具有重要意義。

原生質體技術是通過制備具有生物全能性的原生質體，并結合誘變、雜交、轉基因等技術培育變異新類型的生物技術［4］。輻射育種有著常規育種和雜交育種不可替代的特殊效應，通過輻射誘發突變不僅可以改良品種，而且可以創造新的種質資源。原生質體60Co輻射誘變技術以其周期短、操作簡便的優點被廣泛采用。

我們通過對蛹蟲草的原生質的60Co輻射誘變，選育出多糖含量高的優質菌株。進一步開發利用蛹蟲草創造條件。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為蛹蟲草M，由浙江省農業科學院園藝研究所食用菌實驗室保存。溶壁酶，購自廣東省微生物研究所。蝸牛消化腺干粉，由嘉興市潛福食品有限公司提供。葡萄糖、苯酚、硫酸、硫酸鎂等均為分析純試劑。

1.2 培養基

PDA培養基（g/L）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%；液體培養基（g/L）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%；再生培養基（g/L）：在PDA培養基中添加蝸牛消化腺干粉20 g，MgSO4·7H2O 147.9 g。

1.3 方法

（1）菌絲培養。菌株的活化及擴大培養，將冷藏的PDA斜面菌種轉接到平板中，放置于25 ℃培養箱中培養6～8天，然后轉接至液體培養基培養5～6天，再連同培養基一起轉移至勻漿器中，并加入一定量的液體培養基，勻漿后分裝至預先裝有液體培養基的三角瓶中，25 ℃靜置培養3 d備用。

（2）原生質體制備與再生。0.2 g 溶壁酶溶于10 mL 0.6 mol/L的硫酸鎂溶液中，經0.2 μm細菌過濾器過濾，制成酶液。過濾并收集液體培養的菌絲，用無菌水沖洗后再用無菌吸水紙吸干菌絲水分，將菌絲轉移到酶液中，輕微振蕩使其均勻分散，置于30 ℃、60 r/min 搖床中酶解3 h。用G-2 砂芯漏斗過濾除去酶解液中的殘留菌絲，將收集的濾液在4 ℃、3 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清，沉淀，用0.6 mol/L 的硫酸鎂洗滌2～3次即得到純化的原生質體。

（3）60Co輻射誘變處理。將原生質體稀釋至適當濃度用血球計數板計數，吸取200 μL經稀釋的原生質體懸液用不同60Co輻射劑量（30 Gy，50 Gy，100 Gy，150 Gy）分別處理30 min。

（4）變異菌株篩選。吸取100 μL誘變后的原生質體懸液于再生培養基上，用涂布棒涂布均勻，25 ℃倒置培養7～10天可見再生菌落。挑選出一部分單菌落和部分雜交菌落，接種至PDA固體斜面培養基上。置于25 ℃恒溫培養5～7天。觀察菌絲體生長狀況，并與未誘變的對照組進行比較。挑選出一部分與對照組有差異的菌株，接種至液體發酵培養基中，進行搖床發酵培養，測定發酵液的多糖含量。

（5）多糖測定。發酵液多糖含量的測定采用以下公式：發酵液總多糖含量—發酵液還原糖含量=胞外多糖含量。多糖測量方法采用苯酚-硫酸法，還原糖的測定采用DNS法。

2　結果與分析

2.1 原生質體形態

取適量原生質體置于40倍光鏡下進行鏡檢，觀察形態。圖1中呈現黑點且四周透明的即為蛹蟲草原生質體。還有一部分呈現條狀的為未酶解的菌絲體。

圖1 蛹蟲草原生質體形態

2.2 誘變后再生菌株的生長情況

從再生培養基上挑選出一部分單菌落接種于PDA斜面培養基上，置于25 ℃恒溫培養箱中培養1周后觀察菌株的生長情況和菌絲形態。結果（圖2）為：部分單菌落生長明顯快于其他菌株，且有部分菌株的菌絲體外形與其他組有顯著的不同。

圖260Co輻照誘變1周后各菌落生長情況

表1 篩選的菌株胞外多糖含量

2.3 胞外多糖含量

將菌絲體形態和長勢與對照組明顯不同的菌株接種于50 mL液體發酵培養基中，于25 ℃恒溫搖床發酵培養5～7天，隨后過濾菌絲體，測定干重，清液用于測量胞外多糖。結果（表1）可以看出，挑選的20株菌株中，多糖含量提高的有8株，其正突變率達40%；其中，13號菌株胞外多糖含量最高，為195.48 mg/g菌絲，比對照提高了46.2%。

3 討 論

微生物菌種選育是建立在遺傳和變異基礎上的，一個菌種的生物合成物的產量和質量取決于該菌種內部遺傳基因的結構和功能。通過改變微生物遺傳物質的結構就能影響其生物合成產物，包括化學結構、合成能力，以及產物的活性等［5］。而后通過一定的手段，從眾多的變異菌株中篩選出產量高，性狀優良的突變株，進一步研究測試其最佳生長溫度和培養基成分等。

本實驗通過60Co輻照誘變，成功獲得了幾株蛹蟲草誘變新菌株，與出發菌株相比，其胞外多糖產量提高很多。原因可能為經過電離輻射后，出發菌株內部遺傳物質發生變化，如DNA序列的改變，或者DNA上堿基對的變化等，其生物合成能力提高所致，這其中可能是編碼某個酶的序列的改變，或是合成多糖的編碼單位增加而使其活性增加。

本實驗所獲得的研究成果為以后的蛹蟲草新品種培育提供了有益的參考，也為蛹蟲草在食品藥品方面的應用提供了可以借鑒的觀點，有益于改善蛹蟲草的產業前景。

［1］ Li SP，Yang FQ，Tsim KW. Quality control of Cordyceps sinensis， a valued traditional Chinese medicine［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2006， 41: 1571- 1584.

［2］ 王建芳， 楊春清. 蛹蟲草有效成分及藥理作用研究進展［J］.中藥研究進展， 2005， 22（ 5） : 30-32.

［3］ Jong SL， Jeong SK， Dong PW， et a1. Study on macrophage activation and structural characteristics of purified polysaccharide from the liquid culture broth of Cordyceps millitaris［J］. Carbohydrate Polymers， 2010， 82: 982-988.

［4］ 田豐偉， 程傳榮， 袁維涵， 等. 原生質體誘變選育ε-聚賴氨酸高產菌株［J］. 微生物學通報， 2010， 37（10）: 1457-1461.

［5］ 施巧琴， 吳松剛. 工業微生物育種學［M］. 北京：科學出版社， 2009.

S646

A

2095-0934（2015）06-371-03

嘉興市南湖區項目（2014QN06）；浙江省食用菌育種專項（2012C12911）

呂國英，博士，浙江省農科院副研究員，主要從事食藥用菌研究工作，E-mail：bdzlgy@sohu.com